Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-elueres flytende fraksjon Entrapment Elektroforese

doi: 10.3791/53597 Published: February 29, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Proteinkomplekser utføre en rekke viktige cellulære funksjoner. Belyse sine ikke-kovalente interaksjoner og dynamikk er avgjørende for å forstå rollen av komplekser i biologiske systemer. Mens den direkte karakterisering av biomolekylære sammenstillingene har blitt stadig viktigere i de senere år, innfødte fraksjoneringsteknikker som er kompatible med nedstrømsanalyseteknikker, inkludert massespektroskopi, er nødvendig for å utvide disse studiene. Likevel mangler innen en høy gjennomstrømming, bredt spekter av høy utvinningsseparasjonsmetode for native protein forsamlinger. Her presenterer vi klare innfødte gel-elueres væskefraksjon entrapment elektroforese (CN-GELFrEE), som er en ny separasjon modalitet for ikke-kovalente protein forsamlinger. CN-GELFrEE separasjon ytelse ble demonstrert ved fraksjone komplekser hentet fra mus hjerte. Fraksjoner ble samlet inn over 2 timer og vises diskret band som spenner fra ~ 30-500 kDa. En conkonsistent mønster med økende molekylvekt båndbredder ble observert, som hver strekker seg ~ 100 kDa. Videre, etterfølgende ny analyse av innfødte fraksjoner via SDS-PAGE viste molekylvekten forskyver forenlig med denaturering av proteinkomplekser. Derfor ble CN-GELFrEE viste seg å tilby muligheten til å utføre høy oppløsning og høy-utvinning innfødte separasjoner på protein komplekser fra et stort molekylvekt i området, noe som gir fraksjoner som er kompatible med nedstrøms protein analyser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flertallet av biologiske prosesser som skjer i en celle er tenkt å være utført av protein sammenstillinger i stedet for enkle proteiner 1. Følgelig, for å belyse den spesifikke biologiske rolle av et protein-subenhet i en celle er det nødvendig å forstå de strukturelle interaksjoner med andre proteiner eller ligander i komplekser 2. Men studerer proteiner opprinnelig, opprettholde sine ikke-kovalente interaksjoner og aktivitet, er fortsatt utfordrende. En av manglene ved native protein studier er en egnet innfødt separasjonsteknikk som er kompatibel med ulike nedstrøms proteinanalyseteknikker. Derfor har nylig interesse for separasjonsteknikker som kan karakterisere ikke-kovalente forsamlinger av biomolekyler økt kraftig tre.

Protein separasjonsteknikker er viktig å biokjemi, biofysikk og diverse andre studier. Nåværende innfødte separasjonsteknikker har intrinsic mangler som reduserer kompatibilitet med nedstrøms-analyser, slik som lav oppløsning, lav gjennomstrømning, tap til utfelling, og kravet om store mengder opprinnelige prøve. Tandem affinitet rensing er ofte brukt for protein interaksjonsstudier, men det må utføres separat for hvert protein mål, slik at det å være uforenlig med høy gjennomstrømming analyse fire. Størrelse kromatografi 5, selektiv utfelling med ion affinitet kromatografi 5 og tetthet-gradient separasjon 6 alle har gitt innfødte separasjoner, men er iboende lav oppløsning teknikker og krever høye startprøve beløp.

Alternativt kan gel-baserte teknikker, for eksempel blå Native (BN) og Clear Native (CN) PAGE (enten 1-D eller 2-D), viser høy oppløsning separasjon. Videre, i kontrast til andre teknikker nevnt, både innfødte HOVED separasjoner opprettholde løselighet og native konformasjon av en bred range av makromolekyl arter, inkludert hydrofobe proteiner. Denne funksjonen utvider ytterligere proteomet dekning nås med disse metodene 7,8 og oppnås gjennom ulike kjemi mellom CN og BN-PAGE. CN-PAGE ofte er avhengig av myk ladede vaskemidler som bærermolekyler, og erstatte den Coomassie blå fargestoffet i BN-PAGE. BN-PAGE, selv om forbundet med høyere oppløsning, har begrensninger som redusert enzymaktivitet i de utskilte proteiner 8 og Coomassie molekyl adduktdannelse, sistnevnte er sterkt skadelig for nedstrøms MS analyser 9. Begge disse metodene, men er tradisjonelt forbundet med lav utvinning og smal proteom dekning på grunn av flekker og gel utvinning begrensninger 7.

For studiet av denaturerte proteiner, er det flere teknikker som opprettholder oppløselighet makromolekyl ved utføring av høy oppløsning fraksjonering med høyt proteingjenvinning, og som er kompatible med diverse post-separasjon protein analyseteknikker. Gel-eluert flytende fraksjon Inneslut Elektroforese (GELFrEE) er en av de fraksjoneringsteknikker som passer alle disse egenskapene. Denne fremgangsmåte er i stor grad brukt i high-throughput top-down proteomics studier indikerer at det er raskt og allsidig. I GELFrEE, proteiner denatureres og separert på grunnlag av molekylvekt gjennom en rørformet gelmatrise, kan porøsiteten som varieres basert på eksempel krav og de ønskede fraksjoneringsresultatene. Fraksjonene eluert i væskefase, og dermed redusere de begrensninger som er forbundet med gjenvinning av SDS-PAGE og samtidig opprettholde høy oppløsning. Brøk porsjoner kan deretter bli analysert av en-D PAGE for molekylær-vekt båndbredde valg 11. Det er stor etterspørsel etter fordelene forbundet med GELFrEE i native separasjonsteknikker. Metoden er beskrevet her, Clear Native GELFrEE (CN-GELFrEE), er opprinnelig tilpasning av GELFrEE. For å være forenlig med en bred spectrum av makromolekyler i sin naturlige tilstand, er avhengig av denne fremgangsmåte ikke bare på den myke CN-PAGE kjemi, men også på en porøsitet gradient separasjon, noe som reduserer proteinutfelling ved å eliminere den harde overgangen mellom porøsiteter som er tilstede i diskontinuerlige gelsystemer 9. Når anvendt for å fraksjonere proteinkomplekser ekstrahert fra mus hjerte, eluerte fraksjoner viste høy utvinningsgrad og en høy oppløsning separasjon av et bredt område av molekylvekter ble oppnådd. Videre, de resulterende fraksjoner som er kompatible med de fleste nedstrøms biokjemiske og biofysiske proteinanalyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: Denne videoen protokollen er basert på en tilhørende publikasjon 9. Spesifikke reagenser, materiell og utstyr som er nødvendig for å utføre alle trinnene som er beskrevet i denne protokollen er oppført i materialer delen. Oppskriftene og informasjon for utarbeidelse av alle nødvendige løsninger er spesifisert i tabell 1.

1. Pouring av Gradient Tube Gel

  1. Montering av Casting System
    1. Ved hjelp av en flamme-oppvarmet barberblad eller skalpell, skjæres en 20 ml serologisk pipette langs en ortogonal seksjon 10 cm fra toppen av dispenseringsspissen. Pass på at snittflaten er glatt. Hold bunnstykket (med tuppen) og kast den øverste stykke. Klem bunnen pipette stykke vertikalt (konisk spiss vendt ned) til en støttefoten.
      FORSIKTIG: Ikke berør den oppvarmede blad metall, bruke riktig håndtak eller en tang for å unngå brannskader.
    2. Skjær 3 cm av fleksible rør og koble den til kutt pipette ved å strekke det overdispenseringsspissen. Koble strømningskontrollventilen i den andre enden av røret.
    3. Knytte bunnen av ventilen til dispenseringsspissen av gradienten blanderen ved hjelp av en slange. Hold ventilen åpen.
    4. Sett gradient mikser på toppen av en magnetrører. Plasser magnetiske barer inne i blandekamrene.
    5. Plasser dispenseringsspissen av gradienten blanderen 5-10 cm høyere enn toppen av pipetten stykket for å tillate gelen skal helles av tyngdekraften.
    6. Teste systemet for lekkasjer med avionisert vann. Hvis ingen lekkasjer, tørke systemet ved å blåse luft inni den før du fortsetter.
    7. Dekker toppen av pipetten stykket med to eller flere lag av bånd. Punktere et hull gjennom båndet lagene i sentrum av den sirkulære åpning. Kontroller at punktering er stor nok for glassrør å passere tett gjennom.
    8. Skyv glassrøret, hvor gelen vil bli kastet, gjennom punktert hull, strekker strikken så glasset sitter tett. jegnsert glassrøret slik at bunnen av røret er 2 mm over bunnen pipette.
    9. Sjekk om glassrøret er holdt og sentralisert og ikke berører pipetten veggen når systemet er forberedt. Systemet er nå klart for støping.
  2. casting Gel
    1. Forbered gel buffer, APS og Coomassie løsninger (løsninger 1-3, Tabell 1).
    2. Forbered 12% T (løsning 4, tabell 1) og 1% T (løsning 5, tabell 1) skille gel løsninger. Tilsett 10 mL av Coomassie-oppløsning i 12% T separerende gel-løsning. Legg APS og TEMED i begge løsninger umiddelbart før strømme inn gradient mixer.
      FORSIKTIG: polyakrylamid er svært nevrotoksisk og hansker må brukes.
    3. Pass på at utleveringsventil på graderingen mikseren er lukket. Tilsett 12% T separering geloppløsning til blandekammeret lengst fra dispenseringsspissen. Åpne ventilen mellom begge kamre og la løsningen flyt infor neste kammer.
    4. Steng ventilen og pipette av ledd 12% T separerende gel løsning tilbake til det foregående kammer. Dette gjøres for å unngå luftbobler mellom kamrene.
    5. Tilsett en% T separering geloppløsning til blandekammeret som er nærmest dispenseringsspissen. Slå på magnetrøreren.
    6. Åpne begge gradient blandeventiler på samme tid for å tillate skille gel løsninger som skal blandes, og til å strømme inn i pipetten og glassrøret.
    7. Når skille gel-løsninger i gradienten blanderen er oppbrukt, frakople slangen fra blanderen og paret det til en 10 ml sprøyte. Sørge for at den ende av røret holder seg over væskenivået i pipetten inntil sprøyten er godt festet.
    8. Bruk sprøyten til forsiktig skyve den gjenværende skille gelen oppløsning fra røret inn i pipetten og glassrøret. Lukk pipetten ventilen før slik at luftbobler inn i den.
    9. Forsiktig legge et lag på ca. 0,25 ml vann-mettet butanol (oppløsning 6, tabell 1) på toppen av gelen oppløsningen inne i glassrøret for å forsegle polymerisasjonsreaksjonen fra oksygen i luft og for å flate toppen menisken.
    10. Rengjør helle apparatet umiddelbart med avionisert vann (ikke bruk vaskemiddel).
    11. Vent over natten for fullstendig gel-polymerisasjon ved romtemperatur.
  3. Løsne Gel Tube fra enhet og lagring
    1. På den påfølgende dagen, skrelle teipen forsiktig på toppen av enheten.
    2. Koble ventilen fra røret under pipette. Slipp pipette fra klemmen og utføre trinn 1.3.3. og 1.3.4. over en vask.
    3. Par en 10 ml sprøyte fylles med avionisert vann til det fleksible rør. Presse vann gjennom røret inn i pipetten, sakte glir det polymeriserte gel ut av pipetten.
    4. Holde pipetten horisontalt og forsiktig feste gelen glir ut av den åpne enden.
    5. Skjær av overflødig polyakrylamid under og around glassrøret ved hjelp av et barberblad. Sørge for å skape en jevn ende på gelen inne i røret, ved at det i flukt med spissen av glassrøret.
    6. Dispensere eventuelle gjenværende butanol fra oversiden av gelen og sette gelen røret i en udekket 15 ml sentrifugerør. Bland 0,5 ml gel buffer (løsning 1, tabell 1) med 4,5 ml ultrarent vann, og legge til omtrent 2 ml av oppløsningen til både oversiden (innen glassrøret) og bunnsiden (i sentrifugerør) av gel rør.
    7. Dekker hele oversiden av sentrifugerøret, inklusive glassrøret åpningen, med parafilm for å forhindre fordampning buffer. Geler kan oppbevares ved 4 ° C i ca. 2 uker.

2. Prøvepreparering

  1. Vei to muse hjerter og hakke dem i en petriskål ved hjelp av et barberblad.
  2. Tilsett behandlet vev til en morter og tilsett tilstrekkelig flytende nitrogen til å dekke prøven. Pulverisere vev med en stampe, og legger merflytende nitrogen når den fordamper.
  3. Når vevet blir grundig malt, la nitrogen fordamper og tilsett 1 ml lyseringsbuffer (løsning 7, tabell 1) ved 4 ° C for hver 100 mg vev. Flytt løsning i et sentrifugerør.
  4. Sentrifuger ved 2000 xg i 5 min ved 4 ° C. Samle forsiktig supernatanten i et nytt rør og kast pellet. Kvantifisere proteinkonsentrasjonen i supernatanten ved hjelp av bicinchoninic syre metode 12, eller som foretrukket. Merk: Native Cellelysater eller subcellulære fraksjoner kan fremstilles som foretrukket. CN-GELFrEE er kompatibel med ulike innfødte prøve forberedelser.
  5. Klargjør solubilization bufferløsning og lasteløsning (løsninger 8 og 9, Tabell 1).
  6. Dersom prøven er en pellet, resuspender den i 50-150 ul av oppløsning buffer. Holde prøven på is i 15 min.
  7. Buffer bytte ut resuspendert prøve eller cellelysatet med solubilization buffer ved hjelp av en 30 kDa-MWCO ultra sentrifugale filter.
  8. Sentrifuger proteinprøven ved 4 ° C og 10 000 x g i 5-10 min eller inntil den tilbakeholdte fraksjonen volum er ned til omtrent 20 pl. Kast gjennomstrømnings.
  9. Tilsett 400 ul av solubilisering buffer til den tilbakeholdte fraksjon og blandes ved pipettering. Sentrifuge ved 4 ° C og 10 000 x g i 5-10 min eller inntil den tilbakeholdte fraksjonen er ned til omtrent 20 pl. Kast gjennomstrømnings.
  10. Gjenta trinn 2.9 to ganger til.
  11. Fortynn den filtrerte prøven (ca. 20 pl) i 100 pl buffer oppløsning.
  12. Tilsett 20 mL av lasting løsning å prøve.

3. CN-GELFrEE Device

  1. For å utføre CN-GELFrEE fraksjonering, produserer enheten deler ved å henvise til et maskinverksted. Produksjon enhets deler i teflon. Vennligst referer til figur 1 for all informasjon som er nødvendig for å produsere deler og to Tabell 2 for antallet nødvendige deler for en enhet.
    Sikkerhetshensyn: Bruk egnet personlig verneutstyr. Forsiktighet bør utvises rundt høyspent forsyninger, og alle trafikk skal være korrekt montert. Ikke berør enheten, eller ved våt området mens spenningen er på og vedlikeholde det omliggende benk området tørt under elektroforese. Videre bør strømforsyningen bli slått helt av når du håndterer enheten og / eller samle fraksjoner.
  2. Forbered anoden buffer og katoden buffer (løsninger 10-11, Tabell 1) og holde dem ved 4 ° C eller i isen.
  3. Sett på den øvre ende av gelrør (slutt uten gel) gjennom en spacer, en O-ring og en andre avstandsstykke, i en "sandwich" -form.
  4. Legg bufferkammeret (katode) etter den andre spacer, passerer skruene helt gjennom sidehullene, legge til og stramme nøtter til begge sider. Pass på at den øverste enden av glass rør er festet før den øvre åpning av bufferkammeret, ikke er direkte under det eller forbi den.
  5. Sett bunnen enden av gelen røret gjennom en spacer, en O-ring, i oppsamlingskammeret, og en andre avstandsstykke.
  6. Legg bufferkammeret (anode) etter den andre spacer, passerer skruene helt gjennom sidehullene, legge til og stramme nøtter til begge sider. Sikre at bunnenden av gelen røret er festet forbi den øvre åpning av bufferkammeret, nær, men ikke berører den bakre veggen.
  7. Sett CN-GELFrEE enheten vertikalt med katoden bufferkammer oppover ved hjelp av et støttestativ med klemmer.
  8. Legg anode buffer til anodebufferkammeret (nederst) og katoden buffer til katoden bufferkammeret (øverst). Hold alle buffere ved 4 ° C.
  9. Fjern luftbobler fra innsiden av glassrøret ved å banke lett på glassrøret og sjekke systemet for lekkasje.
  10. Sørge for at platina-elektroder er i kontakt med bufferne i kamrene og at beggegel rørender er nedsenket i buffer innenfor hvert kammer.
  11. Koble strømledninger fra strømforsyningen til de respektive bananplugger: negativ på katoden bufferkammer (øverst) og positiv på anoden bufferkammer (nederst).
  12. Installering av prøven ved bruk av en gel belastning spiss på toppen av overflaten av gelen inne i gelen røret.
  13. Kjør gelen ved en konstant W, for å unngå overoppheting, før det røde fargestoff fronten er på bunnen av gelen røret.
    ADVARSEL: Slå av strømforsyningen før du fortsetter.
  14. Kast anode og katode buffere.
  15. Skru opp mutt ved anodebufferkammeret og demontere den nederste avstandsstykket og kammeret, opprettholde et avstandsstykke og O-ringen. Plasser den nedre ende av gelen rør inne i oppsamlingskammeret, før den øvre åpning, ikke forbi eller direkte under den. Skyv avstandsstykket og O-ringen i nærheten av oppsamlingskammeret.
  16. Klipp et stykke av cellulose dialysemembran og rehydrere det ved immerging i anode buffer. Dekk til aperture mellom oppsamlingskammeret og den nederste avstandsstykket ved hjelp av dialysemembranen.
  17. Monter anodebufferkammer etter den andre spacer, legge til og trekke til skruer og bolter.
  18. Lå enheten horisontalt over en isen bøtte. Legg friske anode og katode buffere til bufferkamre og sjekke systemet for lekkasje.
  19. Legg 150 ul buffer anode inn i oppsamlingskammeret. Sett strømledningene til de respektive bananplugger.
  20. Slå på strømforsyningen på 3 mA konstant strøm. Fargestoffet fram skal da begynne å eluere i bufferen i oppsamlingskammeret.
  21. Når hele fargestoff foran elueres, slå av strømmen og samle den første fraksjonen (0 min), overføre den til en lav-protein binding mikrosentrifugerør.
  22. Fyll opp oppsamlingskammeret med 150 ul av anode-buffer. Hold alle de innsamlede fraksjoner på is.
  23. Samle fraksjoner etter følgende tidsintervaller fra samlingen avførste fraksjon: 2 min, 4 min, 6 min, 8 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 45 min og 60 min. Tar ikke hensyn til tid mens strømmen er slått av. Ikke glem å slå av strømforsyningen før samle fraksjonene og å fylle samlingen kammer med 150 ul anode buffer mellom prøvene. Slå strømforsyningen på igjen etter samlingen å starte eluere neste fraksjonen.
  24. Dispensere anode- og katode-buffere og legge til nye løsninger for å bufferkamrene etter 60 min. Samle fraksjoner på 90 min og 120 min.
  25. Endre anode og katode buffere hver time.
  26. Kjør en klar innfødt eller en blå nativ PAGE med fraksjonene og beis det som foretrekkes. Følg produsentens instruksjoner eller foretrukket protokoll.
  27. Kjør en reduserende SDS-PAGE og beis det som foretrekkes. Følg produsentens instruksjoner eller foretrukket protokoll.
  28. Rydd opp GELFrEE fraksjoner og sender til mors massespektrometri analyser som beskrevet previously 9.

Figur 1
Figur 1:. CN-GELFrEE enhet (A) GELFrEE enhets deler tegninger og (B) fotografi av produserte deler; (C) CN-GELFrEE anordning sammenstilling skjema: (1) bufferkammeret, (2) avstandsstykke, (3) O-ring, (4) gelrør, (5) oppsamlingskammeret, og (6) dialysemembran.

Tabell 1
Tabell 1: Tabell av løsninger.

Tabell 2
Tabell 2: Tabell over GELFrEE enhets deler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

200 mikrogram av proteiner utvunnet fra cryogenically bakken mus hjerter ble fraksjonert opprinnelig inn i 14 fraksjoner av 150 ul hver, med CN-GELFrEE metoden i en 1-12% T gel tube. En alikvot av 10 ul av hver fraksjon ble kjørt på en CN-PAGE-slab-gel og sølvfarget. En klar avbildning av fraksjonering og oppløsning oppnås med CN-GELFrEE fraksjonering er vist i figur 2A. Fraksjoner ble samlet opp i løpet av to timer og gelen analysen viser et konsistent mønster med økende molekylvekt i området fra ~ 30-500 kDa. Hver fraksjon inneholder arter som varierer i vekt over ~ 100 kDa. Fraksjoner vise en lav overlapping av molekylvekt-områder som blir stadig mer redusert etter hvert som flere samlinger skje mellom fraksjoner. CN-PAGE-slab-gel er vist her er bare 6% av proteinet gjenvunnet fra hver 150 ul fraksjon.

Hver av de desimalplasser du skal brukeioner elueres opprinnelig fra CN-GELFrEE ble senere redusert og denaturert før du kjører dem på en SDS-PAGE skive gel. I den reduserende SDS-PAGE-slab-gel (figur 2B), er det mulig å se masse skift på alle fraksjoner i forhold til de respektive opprinnelige fraksjoner (figur 2A), noe som indikerer at intakte proteinkomplekser ble demontert og disulfidbroer ble redusert.

Figur 2
Fig. 2: CN-GELFrEE separasjon av mus hjerte kryogen oppmaling ekstrakt (A) Klar native PAGE av CN-GELFrEE fraksjoner oppsamlet ved tidsintervaller 0 til 120 min. Venstre: innfødte molekylvekt stigen. (B) Redusere SDS-PAGE av samme fraksjoner som A. Venstre: redusert og denaturert molekylvekt stigen.

Fraksjoner kan deretter bli renset og Dette leveresed til mors massespektrometri analyser 9. Native MS-spektrum av homodimert malat dehydrogenase, identifisert i noen av de GELFrEE fraksjonene viser en ladningsfordeling mellom 16+ og 20 + og en molekylvekt på 72 843 Da (figur 3A). 18 + ladetilstand ble isolert og collisionally-aktivert, noe som resulterer i utstøting av monomert malat dehydrogenase med en molekylvekt på 36,421.7 (figur 3B). Kilde aktivering ble påført på den intakte komplekset for å indusere monomer utstøting, slik at isolering og ytterligere fragmentering av monomerene. Fragmentering kart over den 11+ monomer kan observeres i figur 3C. CN-GELFrEE ble påvist å være kompatibel med massespektrometri analyser, og viser ingen forstyrrelse av de ikke-kovalente protein-protein interaksjoner av makromolekylære sammenstillinger.

Figur 3 Figur 3: Massespektra og fragmentering kart over den homodimer malat dehydrogenase (A) MS1-spektrum av det intakte kompleks, (B) MS2-spektrum oppviser monomer utstøtes fra komplekset, og (C) et fragmentering kart oppnådd fra fragmentering av monomeren. . Den røde N indikerer at N-terminal er acetylert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CN-GELFrEE er avledet fra den klare native (CN) PAGE buffersystem som bruker en blanding av anioniske og nøytrale detergenter som bærermolekyler 9 for molekylvekt basert på proteinfraksjonering gjennom en gelmatriks. Anvendelsen av CN-GELFrEE til en innfødt mus hjerte protein ekstrakt generert lav kompleksitet fraksjoner med diskrete båndbredder og samtidig opprettholde ikke-kovalente interaksjoner av biomolekylære forsamlinger. Sammenligning av brøker mellom CN-PAGE og reduserende SDS-PAGE slabgeler viste masse skift som viser tap av ikke-kovalente interaksjoner mellom makromolekyler i fraksjonene og brekker av disulfidbindingene mellom proteinkjeder. Resultatene bekrefter den opprinnelige karakteren av CN-GELFrEE separasjon.

Noen skritt i denne protokollen er kritiske og dermed garanterer mer oppmerksomhet. Først etter støping, gelen rør bør fjernes fra enheten sakte og den ytre polyakrylamid kuttet nøye. Unnlatelse av å gjøreså kan skade gel, forårsaker luftbobler i netting eller løsne gel fra glassrør. Disse skader forringe atskillelse oppløsning og bør være grundig unngås. Dernest, i løpet av elektroforese, vil den elektriske motstanden i systemet øke overtid, genererer varme, og dermed er det svært viktig å enten utføre prosedyren i et kuldekammer eller for å flytte enheten til en isen bøtte etter at prøven er lagt i gel, for ikke å denaturere de lastede proteiner ved varme. Videre er det viktig å huske noen viktige begrensninger ved teknikken ved utføring av den beskrevne protokoll. Høy protein belastninger kan redusere CN-GELFrEE oppløsning. Overbelastning, særlig av prøver hvor noen få arter er mer rikelig, vil føre til at disse proteinarter som skal elueres gjennom en rekke på hverandre følgende fraksjoner. For muse cryogenically bakken prøver, ble de beste resultatene sett med beløp mellom 200 og 400 mikrogram, men dette problemet er sample-avhengig. Også high nivåer av salt i prøven vil endre de elektroforetiske egenskaper til proteiner, endrer bandet mønster og redusere fraksjone oppløsning. Disse kritiske trinn og begrensninger skal regnskapsføres under utførelsen av denne protokollen for å oppnå bedre resultater.

Videre ble CN-GELFrEE vist seg å ha flere svært etterspurt egenskaper i mors kromatografi. Denne enkle separasjonsmetode oppnår høy oppløsning fraksjonering av proteinkomplekser, akseptere store mengder protein belastning og fraksjonerings gjennom et bredt område av molekylvekter. CN-GELFrEE ble også vist seg å være svært allsidig, som er i stand til å fraksjonere biologiske prøver fra et stort utvalg av organismer og forskjellige preparater 9.

Videre er væskefraksjonen eluert i denne teknikken gir høy gjenvinning av protein som ikke er observert i andre gel-baserte innfødte separasjoner. I tillegg, i motsetning til andre metoder som elutt sammenstillinger i flytende fase, betyr CN-GELFrEE ikke redusere prøvekonsentrasjon. Faktisk er den protokoll som er beskrevet heri, øker konsentrasjonen av hvert protein sammenstillingen ved ~ to ganger fra prøve til fraksjoner. Til slutt, de flytende prøvene denne metoden genererer er lett kompatible med forskjellige nedstrøms biokjemiske og biofysiske naturlig proteinanalyser, inkludert massespektrometri. Etter en enkelt rydde opp skritt kunne vi identifisere og karakterisere, gjennom mors massespektrometri, ukjente proteinkomplekser i CN-GELFrEE fraksjoner, videre demonstrere innfødte mote og kompatibilitet mellom disse teknikkene.

I likhet med denaturering GELFrEE, er denne romanen innfødt fraksjone teknikk også svært tilpasningsdyktig. Konsentrasjonene av støpe oppløsninger kan justeres for å lage forskjellige gradient geler, for å variere molekylvektsområde som er løst i løpet av en kjøring. Øke% T av separasjon gel løsningene resulterer i høy Resolution av lavere massearter samtidig redusere den forbedrer separasjonen av høymolekylære typer. Innsamlings ganger gjennom hvilken forsøket utføres kan også tilpasses for å optimalisere molekylvekt båndbredder som er oppnådd i hver fraksjon etter behov. Utvidet eksperiment tid over 120 min vil generere enda høyere molekylvekt områder enn avbildet i denne protokollen. I tillegg kan redusere tiden mellom fraksjonsoppsamling redusere kompleksiteten i hver fraksjon. Derfor flere parametere kan lett finjusteres, optimalisere bruken av teknikken til ulike studier.

Som konklusjon, CN-GELFrEE fordeler oppta et tomrom i feltet av innfødte separasjonsteknikker som representerer høy oppløsning separasjon i et bredt område av molekylvekter, høye proteingjenvinning, og akseptere store mengder protein belastning. Til slutt, de resulterende fraksjoner som er kompatible med de fleste nedstrøms native og denaturerende proteinanalyseteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

WM Keck Foundation sjenerøst gitt midler til dette arbeidet. Dette materialet er basert på arbeid støttet av FAPERJ forskningsstipend 100,039 / 2014 fra myndighetene i Rio de Janeiro - Brasil for RDM, Science Without Borders stipend 88888,075416 / 2013-00 fra Koordinerings for bedring av høyere utdanning personell, under regjeringen i Brasil, for HSS, National Science Foundation Graduate Research Fellowship etter fellesskap nummer 2014171659 for oSS, og ved CNPq forskningsstipend 202011 / 2012-7 fra myndighetene i Brasil for LHFDVPCH er en mottaker av en Northwestern University Kjemi til livsprosessene Institute Postdoktor Fellowship Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
30% acrylamide/bis solution, 37.5:1 Bio-Rad 161-0158 This solution is neurotoxic.
6-aminohexanoic acid (ε-aminocaproic acid) Sigma-Aldrich A2504 This chemical is an irritant.
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific 7727-54-0 This chemical is flammable, toxic, and corrosive.
Coomassie blue G250 Bio-Rad 161-0406
Dodecylmaltoside Sigma-Aldrich D4641 This chemical is an irritant.
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) FLUKA 3777 This chemical is toxic.
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120 This chemical is toxic.
Glycerol Fisher Scientific 56-81-5
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Liquid nitrogen Any supplier n/a Store liquid nitrogen in containers
designed for low-temperature
liquids
Mouse heart Bioreclamation LLC MSE-HEART
n-butanol Fisher Scientific 71-36-3 This chemical is flammable and toxic.
Ponceau S Sigma-Aldrich BP103
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78430 This chemical is toxic.
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970 This chemical is an irritant.
Sucrose JTBaker 4097
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 161-0800 This chemical flammable and irritant.
Tris-HCl Amresco M151
Trycine Bio-Rad 161-071
Equipment
Gradient mixer Hoefer SG15
Magnetic stir  Any supplier n/a
Magnetic bars  Any supplier n/a Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.
Power supply Bio-Rad 164-5056 Voltage up to 1,500 V
Refrigerated centrifugue Eppendorf 022622552 Up to 15,000 x g
Materials
15 ml conical tube Any supplier n/a
30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter Millipore UFC503096
Flexible tubing Saint-Gobain B000FOV1J0 Approximately 1 m length
Ice bucket Any supplier n/a
Liquid/air metallic or plastic valve. (e.g. aquarium air/water flow control lever valve) Any supplier  n/a Aquarium valves are compatible.
Mortar and pestle Any supplier n/a
Native PAGE 3-12% T slab gel Invitrogen BN1003
Parafilm Bemis PM-996
Petri dish Fisher Scientific 08-757-13
Protein low bind tube 1.5 ml Eppendorf 022431081
Razor blade IDL Tools TE05-091C
Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO Fisher Scientific 21-152-9
SDS-PAGE slab gel for any kDa Bio-Rad 456-9036
Serological pipets (25 ml) VWR 89130-900
Syringe (10 ml) Any supplier n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B. The Cell as a Collection of Protein Machines: Preparing the Next Generation of Molecular Biologists. Cell. 92, (3), 291-294 (1998).
  2. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, (8), 645-654 (2007).
  3. Gavin, A. C., Bösche, M., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, (6868), 141-147 (2002).
  4. Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  5. Cremer, K. D., Hulle, M. V., et al. Fractionation of vanadium complexes in serum, packed cells and tissues of Wistar rats by means of gel filtration and anion-exchange chromatography. JBIC J. Biol. Inorg. Chem. 7, (7-8), 884-890 (2002).
  6. Tanese, N. Small-Scale Density Gradient Sedimentation to Separate and Analyze Multiprotein Complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  7. Bunai, K., Yamane, K. Effectiveness and limitation of two-dimensional gel electrophoresis in bacterial membrane protein proteomics and perspectives. J. Chromatogr. B. 815, (1-2), 227-236 (2005).
  8. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5, (17), 4338-4346 (2005).
  9. Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., et al. Native GELFrEE: A New Separation Technique for Biomolecular Assemblies. Anal. Chem. 87, (5), 3032-3038 (2015).
  10. Nijtmans, L. G. J., Henderson, N. S., Holt, I. J. Blue Native electrophoresis to study mitochondrial and other protein complexes. Methods. 26, (4), 327-334 (2002).
  11. Tran, J. C., Doucette, A. A. Gel-Eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis: An Electrophoretic Method for Broad Molecular Weight Range Proteome Separation. Anal. Chem. 80, (5), 1568-1573 (2008).
  12. Smith, P. K., Krohn, R. I., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, (1), 76-85 (1985).
CN-GELFrEE - Clear Native Gel-elueres flytende fraksjon Entrapment Elektroforese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).More

Melani, R. D., Seckler, H. S., Skinner, O. S., Do Vale, L. H. F., Catherman, A. D., Havugimana, P. C., Valle de Sousa, M., Domont, G. B., Kelleher, N. L., Compton, P. D. CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis. J. Vis. Exp. (108), e53597, doi:10.3791/53597 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter