Summary
Bioluminescence इमेजिंग ट्यूमर और मेटास्टेसिस स्थानीयकृत के लिए एक प्रसिद्ध उपकरण है, लेकिन इन छवियों की मात्रा का ठहराव अक्सर जटिल गणना और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। हम आसान करने के लिए उपयोग luminoscore विधि का वर्णन है, सटीक अधिग्रहण शर्तों के आधार पर, कोई गणना की आवश्यकता होती है, और सक्रिय करने के ट्यूमर बोझ और उपचार की प्रतिक्रिया माउस मॉडल में नजर रखी जा सके।
Introduction
प्रारंभिक ट्यूमर सेल का पता लगाने के लिए एक चुनौती बनी हुई है और कैंसर के इलाज के प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। विवो में bioluminescence इमेजिंग (BLI) एक बहुत ही संवेदनशील, noninvasive ऑप्टिकल तकनीक, व्यापक रूप से छोटे जानवरों में ट्यूमर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जाता है। जुगनू luciferase व्यक्त कोशिकाओं आमतौर पर इस तरह के प्रयोगों 1,2 के लिए उपयोग किया जाता है। इस oxygenase डी luciferin आणविक ऑक्सीजन के साथ ऑक्सीकरण होता लेकिन दो सहकारकों की आवश्यकता है - 2 मिलीग्राम + और adenosine triphosphate 3। जुगनू luciferase renilla luciferase 4 क्योंकि इसके क्वांटम उपज अधिक है की तुलना में vivo इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है।
ऑक्सीकरण सब्सट्रेट - oxyluciferin - अनायास अपनी मौलिक राज्य में लौटने के लिए एक फोटान का उत्सर्जन करता है और उसके बाद निष्क्रिय हो जाता है। उत्सर्जित फोटॉनों 530 एनएम के चारों ओर एक अधिकतम तरंग दैर्ध्य है। एक उच्च संवेदनशीलता कैमरा एक छोटे जानवर के अंदर से luminescent फोटॉनों का पता लगाने और छवियों है कि यह poss बनाने प्रदान कर सकते हैंट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए ible।
फोटोन मायने रखता द्वारा सही ट्यूमर बोझ यों की क्षमता उपचार प्रभावकारिता बढ़ाता के लिए एक शक्तिशाली और संवेदनशील उपकरण के रूप में सेवा कर सकता है। उपचार के प्रभाव जल्दी ही पता लगाया जा सकता है, क्योंकि इस संवेदनशीलता यह सही समय है, जिस पर एक उपचार प्रभावी हो जाता है निर्धारित करने के लिए संभव हो सकता है।
कुल उत्सर्जित फोटॉनों की मात्रा का ठहराव निरपेक्ष बहुत जटिल है। इकट्ठा फोटॉनों की संख्या ट्यूमर की गहराई पर और अंगों फोटॉनों के माध्यम से उत्सर्जित कर रहे हैं पर निर्भर करता है। सुधार पर ऊतक अवशोषण गुणांक के आधार गुणांक गणना की जा सकती 5, लेकिन ट्यूमर सेल नंबर की पूर्ण मात्रा का ठहराव प्रत्येक ट्यूमर सेल द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या जानने की आवश्यकता है। इसके अलावा, luciferase अभिव्यक्ति, कई रिपोर्टर जीन (जैसे।, फ्लोरोसेंट प्रोटीन) की तरह नहीं सजातीय, एक भी क्लोन 6 से व्युत्पन्न एक सेल की आबादी में है। लूसिफ़ेर की संख्याकोशिकाओं में प्रोटीन एएसई वास्तव में गणना नहीं की जा सकती है। मानकीकृत प्रयोगात्मक शर्तों की स्थापना इस प्रकार एक विश्वसनीय अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण होता है।
हम दो अलग माउस लिंफोमा मॉडल 7,8,9 को luminoscore विधि लागू होता है। इन मॉडलों में, syngeneic ट्यूमर कोशिकाओं आंख में या त्वचा प्राप्त करने के लिए, क्रमशः, एक प्राथमिक intraocular लिम्फोमा (PIOL) मॉडल और एक चमड़े के नीचे लिम्फोमा (एससीएल) मॉडल के तहत इंजेक्शन हैं। इन ओर्थोटोपिक मॉडलों में से प्रत्येक में, उपचार बगल में प्रशासित किया जाता है, सात दिनों PIOL के लिए ट्यूमर टीका के बाद और ट्यूमर एससीएल के लिए अपने सबसे बड़े व्यास में 0.5 से 0.7 सेमी तक पहुँच गया है।
हम luminoscore विधि का इस्तेमाल किया सीटू सीपीजी चिकित्सा में के प्रभाव की निगरानी करने के लिए, पहले से प्रभावी 7,10,11 होना दिखाया। सीपीजी एक oligonucleotide अनुक्रम और TLR9, की एक ligand जो बारी में एक intracellular रिसेप्टर कई सीई द्वारा व्यक्त की हैप्रतिरक्षा प्रणाली के lls, वृक्ष के समान कोशिकाओं बी लिम्फोसाइटों, monocytes, और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं भी शामिल है। सीपीजी डीएनए एक 20 मेर डीएनए अनुक्रम कि सीपीजी (सीजी) immunostimulatory मूल भाव होता है; नियंत्रण (ODN-नियंत्रण), सिवाय इसके कि immunostimulatory तटरक्षक अनुक्रम उलटा है (जीसी), वही 20-मेर डीएनए अनुक्रम है। Murine लिंफोमा हम अध्ययन कर रहे हैं में TLR9 सगाई apoptosis 10 लाती है, प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय करता है 12, और जिससे काफी ट्यूमर बोझ 7,11 कम कर देता है।
यहाँ हम ट्यूमर बोझ और bioluminescent छवियों के माध्यम से उपचार की प्रतिक्रिया बढ़ाता के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन है। इस विधि के अधिग्रहण से विश्लेषण करने के लिए, इमेजिंग प्रक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर निर्भर करता है, विश्वसनीयता, reproducibility, गैर उपयोगकर्ता निर्भरता, और सांख्यिकीय महत्व अनुकूलन करने के लिए। एक bioluminescence मात्रा का ठहराव सूचकांक प्रत्येक माउस के लिए जिम्मेदार ठहराया है; इस मूल्य है, जो हम एक luminoscore फोन, पशुओं, लेकिन अल के बीच न केवल तुलना की जा सकतीप्रयोगों के बीच इतना।
इस काम में, हम bioluminescence इमेजिंग प्रक्रिया के साथ ही luminoscore विधि द्वारा छवि मात्रा का ठहराव पर ध्यान केंद्रित। हम इंजेक्शन की पुष्टि करने, ट्यूमर बोझ निगरानी, और सीटू के कैंसर के इलाज में की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस विधि का प्रभाव दिखा। इन बिंदुओं में से प्रत्येक luminoscore विधि की अनुकूलन क्षमता को उजागर करने के लिए विभिन्न माउस मॉडल का उपयोग कर प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणामों में सचित्र है।
Protocol
चूहों को शामिल सभी प्रक्रियाओं यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों, पशु प्रयोग के लिए फ्रांस के नियमों (कृषि मंत्रालय के अधिनियम सं 2001-464, मई 2001), और पर संस्थान में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Recherche MEDICALE (INSERM) समिति के दिशा-निर्देशों का पालन किया पशु अनुसंधान, और प्रासंगिक स्थानीय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (चार्ल्स डार्विन आचार समिति पशु प्रयोगों, पेरिस, फ्रांस के लिए; परमिट नंबर: पी 3/2009/004)।
1. सेल तैयार
- माउस बी बढ़ो RPMI 1640 Glutamax मध्यम 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल, और 0.50 के साथ पूरक में लिंफोमा सेल लाइन A20.IIA-luc2 मिलीग्राम / बी hygromycin मिलीलीटर
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेल संस्कृति को बनाए रखने और मध्यम हर दो से तीन दिन बदल जाते हैं। हार्वेस्ट मध्यम बदलने के बाद एक एक दिन पिपेट के साथ सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर।
- 300 पर स्पिन कोशिकाओं5; 10 मिनट के लिए जी और 3 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं को निलंबित। कोशिकाओं को धोने के लिए दो बार इस चरण को दोहराएँ।
- एक Malassez गिनती चैम्बर लोड करने से पहले 30 μl Trypan ब्लू लेबल के साथ सेल निलंबन के 15 μl मिक्स। सूत्र के साथ सेल एकाग्रता की गणना: एकाग्रता (कोशिकाओं / एमएल) = कोशिकाओं की गिनती ग्रिड * 3 * 1000 में संख्या।
- 10 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं को एक बार और स्पिन। एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें। सी एकाग्रता 1.4 चरण में गणना) के साथ, कोशिकाओं की संख्या एन = सी * 3 है।
- बाँझ पीबीएस 1x की मात्रा निम्न सूत्र के साथ 5 10 x 7 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में सेल निलंबन एक प्राप्त करने की आवश्यकता की गणना: पीबीएस वॉल्यूम (एमएल) = एन / (5 एक्स 10 7)। सेल गोली बाँझ पीबीएस 1x की मात्रा पिछले वाक्य में गणना में) (1.5 कदम से) निलंबित। 5 एक्स 10 6 सेल: सेल निलंबन एक (एससीएल मॉडल में इस्तेमाल किया जा विवो इंजेक्शन की मात्रा में 100 μl हैs)।
- पिपेट सेल निलंबन एक के 10 μl और मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं पर सेल निलंबन बी के 100 μl प्राप्त करने के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ पीबीएस के 90 μl जोड़ें। सेल निलंबन बी PIOL मॉडल में इस्तेमाल किया जा रहा है (: 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं विवो इंजेक्शन की मात्रा में 2 μl है)।
2. Luciferin
- एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बाँझ पीबीएस 1x के 30 मिलीलीटर में डी luciferin पोटेशियम नमक पाउडर की 1 ग्राम पतला और कुछ सेकंड के लिए हिला समुच्चय भंग करने के लिए।
नोट: क्योंकि luciferin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, अंधेरे 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 500 μl aliquots तैयार करते हैं। - -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots स्टोर।
नोट: aliquots कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
विगलन के बाद, aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिक से अधिक 1 दिन के लिए संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। बर्फ़ीली विगलन चक्र 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने के लिए बेहतर होते हैं। - intraperitoneally प्रत्येक इमेजिंग Assa के लिए डी luciferin पोटेशियम नमक समाधान के 100 μl इंजेक्षनवाई।
नोट: यह समाधान 150 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक के लिए माउस प्रति 3.3 मिलीग्राम से मेल खाती है।
3. संवेदनाहारी मिश्रण और Anesthetization
- बाँझ पीबीएस 1x में ketamine 120 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 6 मिलीग्राम / किग्रा के मिश्रण से एक संवेदनाहारी समाधान तैयार है।
- intraperitoneally एक 25 जी सुई के साथ प्रत्येक इमेजिंग परख के लिए संवेदनाहारी के मिश्रण के 60 μl इंजेक्षन। सर्जरी (PIOL या एससीएल मॉडल के साथ) के लिए, एक गहरी संज्ञाहरण प्राप्त करने के लिए मिश्रण के 80 μl इंजेक्षन। माउस अपने पिंजरे में वापस डाल दिया।
- माउस स्थिर प्रकट होता है, अपने पिंजरे से हटा दें और धीरे उंगलियों के बीच माउस के पैर दबाओ। माउस एक भागने पलटा साथ प्रतिक्रिया करता है, तो कई मिनट तक प्रतीक्षा करें। कार्रवाई जब तक माउस प्रतिक्रिया नहीं करता है, जो संतोषजनक anesthetization की पुष्टि करता है दोहराएँ।
- एक वार्मिंग प्लेट पर या एक वार्मिंग प्रकाश के तहत माउस रखें।
- आँख मरहम इमेजिंग परख के लिए या एससीएल सर्जरी के लिए anesthetization के दौरान आंख सूखापन से बचने के लिए लागू करें। लागू करेंPIOL मॉडल के लिए सर्जरी के बाद आंख मरहम।
4. सर्जरी और सेल टीका
नोट: सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं के एक वार्मिंग प्लेट पर या एक वार्मिंग प्रकाश के तहत, एक प्रकार 1 सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट में एक पशु जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में प्रदर्शन करना। इस खंड में इस्तेमाल सभी सर्जिकल उपकरण उपयोग करने से पहले autoclaved थे।
- चमड़े के नीचे लिंफोमा आदर्श:
- एक 25 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में 1.6 चरण में प्राप्त सेल निलंबन के 100 μl तैयार करें। धीरे इंजेक्शन स्थल पर, उंगलियों के बीच पार्श्व पर माउस त्वचा निचोड़। वास्तव में त्वचा गुना में सुई डालें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक में गहरी सुई जगह नहीं है।
- skinfold में कोशिकाओं इंजेक्षन। निरीक्षण के एक छोटे से तरल गेंद त्वचा के नीचे प्रकट होता है कि क्या इस बात की पुष्टि की है कि इंजेक्शन सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था।
- एक 25 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में 1.6 चरण में प्राप्त सेल निलंबन के 100 μl तैयार करें। धीरे इंजेक्शन स्थल पर, उंगलियों के बीच पार्श्व पर माउस त्वचा निचोड़। वास्तव में त्वचा गुना में सुई डालें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए ऊतक में गहरी सुई जगह नहीं है।
- PIOL मॉडल:
नोट: इस प्रक्रियाDure 2 ऑपरेटरों, के रूप में ऑपरेटर 1 और ऑपरेटर 2 यहाँ करने के लिए भेजा आवश्यकता है।- कंजाक्तिवा का हटाया:
- ऑपरेटर 1 जगह एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत माउस है। धीरे आंख के प्रत्येक पक्ष पर उंगलियों के साथ प्रेस में यह स्पष्ट है। इस स्थिति को बनाए रखें।
- विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से ऑपरेटर 2 एल ook है। पकड़ एक हाथ में चिमटा के एक छोटे से जोड़ी के साथ कंजाक्तिवा; दूसरे हाथ से, शल्य कैंची का एक छोटा सा जोड़ी के साथ सिर्फ सरौता नीचे कंजाक्तिवा काटा।
- ऑपरेटर है 1 रिहाई माउस कदम 4.2.1.1 पर दबाया की आंख)
- सेल इंजेक्शन:
- एक 10 μl कुंद परिशुद्धता सिरिंज तैयार करें। इसके माध्यम से बाँझ विआयनीकृत पानी पम्पिंग द्वारा इसे धो लें। दो बार या तीन बार दोहराएँ सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज में कोई बुलबुले हैं। फिर इंजेक्शन के लिए सेल निलंबन के 2 μl तैयार करते हैं।
- ऑपरेटर 2 पर की उंगलियों के साथ प्रेस धीरे हैई आंख के प्रत्येक पक्ष पर हाथ साफ करने के लिए। इस स्थिति को बनाए रखें।
- ऑपरेटर 1 पकड़ एक हाथ में चिमटा के एक छोटे से जोड़ी के साथ आंख की बढ़त है और यह धीरे पीछे की ओर खींच ऊतक फैलाने के लिए।
- विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से ऑपरेटर 2 एल ook है। दूसरी ओर, एक 32 जी सुई के साथ माउस के अवर नेत्रगोलक में एक छोटा सा छेद करना।
- ऑपरेटर 2 नीचे सुई डाल दिया है और अप (एक ही हाथ से) प्रेसिजन सिरिंज लेने के लिए और कदम 4.2.2.4 में किए गए छेद में सुई डालने।
- दूसरे हाथ से सिरिंज सवार पर ऑपरेटर 1 धक्का दिया है।
- ऑपरेटर 2 v विदारक माइक्रोस्कोप है कि सिरिंज में सेल निलंबन को सही ढंग से नेत्रगोलक अंदर इंजेक्ट किया गया है साथ erify है (तरल प्रवाह आसानी से नमूदार है)।
- ऑपरेटर 2 आर निकालें परिशुद्धता सिरिंज है।
- ऑपरेटर 1 r एक के किनारे elease हैIMAL आंख कदम 4.2.2.3 पर सोचने के लिए मजबूर)
- ऑपरेटर 2 आर elease है आंख के पक्ष कदम 4.2.2.2 पर दबाया)
- आँख मरहम तुरंत लागू करें।
नोट: सभी कदम सही ढंग से प्रदर्शन कर रहे थे, माउस इस प्रक्रिया के दौरान सभी पर खून बहाना नहीं करना चाहिए।
- कंजाक्तिवा का हटाया:
5. bioluminescence इमेजिंग - दिवस 0
नोट: माउस में इंजेक्शन सभी उत्पादों इंजेक्शन से पहले आरटी पर होना चाहिए। ट्यूमर कोशिकाओं के बाद टीका दिया गया है, और जब तक पशु अभी भी anesthetized है, इमेजिंग के लिए इन चरणों के लिए आगे बढ़ना।
- इमेजर पर मुड़ें और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खुला। "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करके कैमरा, चरणों, और लेंस को प्रारम्भ करें। प्रारंभ के 10 से 15 मिनट लेने के लिए पूरा हो जाएगा।
- एक 25 जी सुई के साथ डी luciferin पोटेशियम नमक के घोल intraperitoneally के 100 μl इंजेक्षन। यह नसों प्रशासन नहीं है। अगर intravenouप्रशासन किसी भी कारण के लिए आवश्यक है, डी luciferin सोडियम नमक डी luciferin पोटेशियम नमक के बजाय इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
ध्यान दें: Luciferin इस एकाग्रता में अतिरिक्त अभिकारक है; इसलिए bioluminescence संकेत 3 से 7 मिनट के बाद एक पठार तक पहुँच जाता है और अधिक से अधिक 30 मिनट के लिए बनी रहती है। - 10 मिनट डी luciferin इंजेक्शन के बाद 13, इमेजर में विषय माउस जगह है। अपनी प्राकृतिक स्थिति, संभव के रूप में कैमरे की ओर अपनी पीठ, के रूप में फ्लैट की स्थिति में में माउस रखें। इस स्थिति में प्राकृतिक और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है।
- ऑटो जोखिम सुविधा टिक, और जानवर के पीछे (पीछे) छवि प्राप्त करने के मोल पर क्लिक करें, ऑटो जोखिम की सुविधा के साथ।
ध्यान दें: ऑटो जोखिम सुविधा एक 1 सेकंड जोखिम छवि से यह गणना के द्वारा जोखिम समय का अनुकूलन। अगर माउस के bioluminescence संकेत नकारात्मक या बहुत कम है, इष्टतम जोखिम समय हो सकता हैस्वचालित रूप से अधिक से अधिक 20 मिनट के लिए निर्धारित किया है। इस मामले में, 8 से 10 मिनट के एक जोखिम समय एक अच्छा समझौता हो सकता है। एक्सपोजर समय मैन्युअल रूप से सेट किया जा सकता है, लेकिन छवियों संतृप्त पिक्सल शामिल नहीं करना चाहिए। - कैमरे के लिए माउस के सामने बेनकाब करने के लिए माउस पर बारी। माउस समतल और इतना है कि वे छाती ब्लॉक नहीं है अपने पूर्वकाल अंग प्रसार करने के लिए प्रयास करें।
- जानवर के सामने छवि मोल। सत्यापित करें कि ऑटो जोखिम चेकबॉक्स अभी भी चिह्नित किया जाता है और "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें।
नोट: सामने छवि को वापस छवि से पहले प्राप्त किया जा सकता है और इसके विपरीत। आगे और पीछे की छवियों का जोखिम समय माउस के प्रत्येक पक्ष के रिश्तेदार तीव्रता के आधार पर अलग-अलग हो सकता है। जब ऑटो जोखिम सुविधा का उपयोग कर यह स्वचालित रूप से गणना की है। मात्रा का ठहराव केवल फोटॉन प्रवाह (प्रति सेकंड फोटॉनों) का उपयोग करता है और जोखिम समय पर निर्भर नहीं करता। - एक वार्मिंग बेनी पर माउस रखेंई या एक वार्मिंग प्रकाश जब तक यह संवेदनाहारी से ठीक हो जाए और फिर अपने पिंजरे में इसे वापस जगह के तहत।
6. bioluminescence इमेजिंग - 0 दिवस के बाद
- इमेजर चालू करें, 5.1 कदम के रूप में कैमरा, चरणों, और लेंस को प्रारंभ)।
- ketamine (120 मिलीग्राम / किग्रा) / xylazine (6 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण के 60 μl (चरण देखें 3.5 करने के लिए 3.1) की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize।
नोट: anesthetization का यह तरीका इमेजिंग की अनुमति देता है हर 5 दिनों के लिए। दैनिक इमेजिंग, एक विधि का उपयोग करता है isoflurane संवेदनाहारी और इस संवेदनाहारी के साथ उपयोग के लिए उपयुक्त एक bioluminescence इमेजर के रूप में आवश्यक है करने के लिए। - जानवर के सामने और पीछे के चित्र, ऑटो जोखिम सुविधा का उपयोग कर कदम 5.5) और 5.6) के रूप में, मोल। कदम 5.7) के रूप में माउस संभाल लेना।
7. Bioluminescence मात्रा और छवि विश्लेषण
नोट: luminoscore विधि छवि विश्लेषण करने पर आधारित हैएस। एक बार छवियों उपरोक्त कदम के अनुसार अधिग्रहण किया गया है, मात्रा का ठहराव किसी भी समय किया जा सकता है (अधिग्रहण के बाद तुरंत सहित), हर समय बिंदु पर प्रत्येक माउस के लिए एक luminoscore संबद्ध करने के लिए।
- "उपकरण पट्टी" प्रदर्शन "देखें" मेनू पर क्लिक करके और फिर "उपकरण पट्टी" पर क्लिक करता है, तो पहले से प्रदर्शित नहीं। उपकरण पट्टी के 'रॉय उपकरण "टैब पर क्लिक करें। "कंटूर" बटन चुनें और फिर "नि: शुल्क ड्रा" का चयन करें।
- मैन्युअल सामने देखने पर माउस के किनारों का पालन करते हुए ब्याज (आरओआई) माउस के आसपास के क्षेत्र को चिह्नित। कंप्यूटर माउस पर एक सही क्लिक के साथ समोच्च बंद करें।
- "देखें" मेनू और फिर "रॉय माप" पर क्लिक करें। यकीन है कि "चमक (फोटॉनों)" बनाओ "माप प्रकार" में चयनित है "रॉय माप" खिड़की के नीचे छोड़ दिया पर स्क्रॉल मेनू। यदि नहीं, तो उसका चयन करें। तब फोटॉन FL मापनेUX (पीएच / एस) "कुल प्रवाह [पी / एस]" बॉक्स में मान रिकॉर्डिंग से।
नोट: चमक या किसी अन्य इकाई है कि रॉय सतह क्षेत्र के सापेक्ष है प्रयोग न करें। - दोहराएँ 7.2) और 7.3) वापस देखने के लिए कदम।
- दो फोटॉन प्रवाह सामने और पीछे के दृश्य से प्राप्त मानों का योग। परिणाम luminoscore है।
- एक उचित आंकड़ा परीक्षण का उपयोग कर प्रत्येक समूह के लिए मूल्यों की तुलना करें (गैर पैरामीट्रिक दो पूंछ मान व्हिटनी परीक्षण, उदाहरण के लिए) 14।
Representative Results
Luminoscore विधि ट्यूमर कोशिका इंजेक्शन सत्यापित करें करने के लिए सेवा कर सकते हैं
ट्यूमर कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के इंजेक्शन से जुड़े मॉडल में या जब इंजेक्शन साइट इंजेक्शन के दृश्य सत्यापन की अनुमति नहीं देता, यह बहुत मुश्किल इंजेक्शन की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए हो सकता है। luminoscore विधि प्रक्रिया की गुणवत्ता को सत्यापित और आसानी से और तत्क्षण है कि सब कुछ सही चला गया पता लगाने के लिए एक तेज और सुविधाजनक उपकरण के रूप में कार्य करता है। दोनों मॉडलों में, ट्यूमर इंजेक्शन (चित्रा 1 ए) के बाद 10 मिनट के रूप में जल्दी के रूप में detectable है। छवियों अकेले सत्यापित करने के लिए कि ट्यूमर कोशिकाओं को सही स्थान में मौजूद हैं पर्याप्त। बहरहाल, छवियों बढ़ाता इंजेक्शन की विविधता की एक विचार है। डॉट साजिश (चित्रा 1 बी) स्पष्ट रूप से (काले डॉट्स) कि प्राप्त जानवरों के बीच एक अंतर पता चलता है और फिर से नहीं कियाceive (लाल रेखा) इंजेक्शन। दिलचस्प बात यह संकेत एससीएल मॉडल में प्राप्त PIOL मॉडल की तुलना में 100 गुना अधिक है; यह निष्कर्ष इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या (5 एक्स 10 6 और 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं, क्रमशः) के अनुरूप है।
चित्रा 1. अलग माउस लिंफोमा मॉडल में इंजेक्शन का सत्यापन। Luminoscores विभिन्न मॉडलों में प्रत्येक जानवर के विभिन्न लिंफोमा मॉडल में ट्यूमर सेल टीका के बाद 10 मिनट मापा जाता है। (ए) दोनों मॉडलों की छवियों प्रतिनिधि। (बी) Luminoscore। लाल रेखा ट्यूमर सेल टीका से पहले 10 जानवरों पर मापा मतलब पृष्ठभूमि शोर से मेल खाती है; बिंदीदार रेखा मतलब +/- मानक विचलन कर रहे हैं। प्रत्येक मॉडल के लिए, सभी जानवरों पृष्ठभूमि शोर से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। PIOL मॉडल में, 1 एक्स 10 4 कोशिकाओं inoc थेदाहिनी आंख के शीशे में संचित, और एससीएल मॉडल में, 5 एक्स 10 6 माउस के प्रत्येक दिशा में subcutaneously कोशिकाओं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
निगरानी ट्यूमर बोझ और उपचार की प्रतिक्रिया
Luminoscore भी ट्यूमर के विकास और उपचार प्रभावकारिता के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। चित्रा 2A नियंत्रण में ट्यूमर के विकास की निगरानी के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है और सीपीजी PIOL समूहों का इलाज किया। चूहों 1 एक्स 10 4 ट्यूमर कोशिकाओं से प्रत्येक के साथ inoculated थे, और उपचार के दिन 7 पर सीटू दिलाई छवियों चलता है कि एक पर्याप्त समय (28 दिन) के बाद, मेटास्टेसिस नियंत्रण समूह में प्रदर्शित हुई। हालांकि प्राथमिक ट्यूमर के इलाज के प्रति संवेदनशील प्रकट नहीं किया था, कममेटास्टेसिस सीपीजी इलाज समूह (तालिका 1) में मनाया गया। प्रत्येक समूह (चित्रा 2 बी) में ट्यूमर बोझ के मात्रात्मक विश्लेषण से पता चलता है कि सीपीजी ट्यूमर के विकास धीमा है, इलाज और 28 दिन (गैर पैरामीट्रिक दो पूंछ मान व्हिटनी परीक्षण पी = 0.0079 के बाद नियंत्रण समूह के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का निर्माण )। बहरहाल, ट्यूमर अभी भी इलाज चूहों में वृद्धि हुई है, और उनमें से कोई भी (नहीं दिखाया डेटा) बच गया। यह निष्कर्ष पिछली रिपोर्टों के साथ संगत है: सीपीजी प्राथमिक आंख का ट्यूमर 10 के आधार पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है। महत्वपूर्ण प्रभाव ODN और सीपीजी समूह के बीच में हम मेटास्टेसिस विकास निषेध से आता है।
चित्रा 2. निगरानी ट्यूमर बोझ और उपचार की प्रतिक्रिया। (ए) के दो समूहों के प्रतिनिधि छवियों (ODN नियंत्रण और सीपीजी इलाज) ओएफ PIOL असर चूहों। luminoscore साथ (बी) की निगरानी ट्यूमर बोझ। के रूप में डॉट साजिश पर देखा, luminoscore पर सीपीजी के प्रभाव 28. दिन पर महत्वपूर्ण उन दो समूहों में है, इस विधि यह ट्यूमर बोझ पर नजर रखने और मामूली लेकिन महत्वपूर्ण (पी = 0.0079) CpG- के प्रभाव को मापने के लिए संभव बनाया डीएनए, जो अकेले छवियों से पता लगाया गया नहीं हो सकता था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| समूह | माउस | मेटास्टेसिस की उपस्थिति | स्थान | फोटॉन प्रवाह (पीएच / s) |
| सीपीजी | 1 | नहीं | एक्स | एक्स |
| 2 | हाँ | 9.32E + 05 | ||
| 3 | नहीं | एक्स | एक्स | |
| 4 | नहीं | एक्स | एक्स | |
| 5 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड | 2.21E + 07 | |
| ODN | 1 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड | 1.06E + 07 |
| 2 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड | 7.25E + 07 | |
| 3 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड + contralateral | 7.64E + 08 | |
| 4 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड + contralateral | 1.74E + 09 | |
| 5 | हाँ | नेत्र draining lymp नोड + contralateral | 9.76E + 07 |
तालिका 1 टीवह Luminoscore विधि अलग दृष्टिकोण के लिए अनुकूलित किया जा सकता
Luminoscore विधि माउस मॉडल का एक प्रकार तक सीमित नहीं है। 3 से पता चलता है कि यह अलग माउस मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता चित्रा। एससीएल मॉडल में, दो ट्यूमर माउस के प्रत्येक पक्ष पर grafted कर रहे हैं। उपचार दिवस 0 पर एक तरफ करने के लिए बगल में प्रशासित किया जाता है, और contralateral ट्यूमर अपने नियंत्रण (चित्रा 3) के रूप में कार्य करता है। इसलिए, दो रॉय माउस प्रति खींचा गया: प्रत्येक पक्ष (चित्रा 3 सी) के लिए एक। इलाज और नियंत्रण पक्षों पर luminoscore के बीच का अनुपात प्रत्येक ट्यूमर के रिश्तेदार पाठ्यक्रम का वर्णन है। इस अनुपात, दिवस 0 के आधार पर 1 से स्थापित किया गया था जब इलाज दिलाई। हम 13 दिनों के इलाज के बाद प्रशासन इस अनुपात में एक महत्वपूर्ण कमी मनाया (चित्रा 3 डी, गैर पैरामीट्रिक दो पूंछ मान व्हिटनी परीक्षण पी = 0.004)। यह कमी है कि इलाज साइड ट्यूमर का पता चलता है, resorbed कर दिया गया है के रूप में प्रतिनिधि bioluminescence छवियों (चित्रा 3 बी) पर दिखाया गया है।
चित्रा दो प्राथमिक ट्यूमर साइटें के साथ एक मॉडल के लिए Luminoscore विधि 3. अनुकूलन। (ए) एक एससीएल परख की प्रायोगिक डिजाइन। चूहों प्रत्येक दिशा में दो प्राथमिक ट्यूमर के साथ इंजेक्शन थे। एक तरफ तो सीपीजी डीएनए या ODN-नियंत्रण, और पीबीएस के साथ दूसरे पक्ष, इसके नियंत्रण के रूप में सेवा करने के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (बी) के दिन 0 और दिन 13. उपचार पर सीपीजी का इलाज और नियंत्रण चूहों की छवियों प्रतिनिधि दिलाई दिन पर 0. ट्यूमर के विकास के लिए माउस का सीपीजी इलाज तरफ हिचकते था। (सी) मैन्युअल दो प्राथमिक ट्यूमर साइटों के लिए प्रति पशु हित के क्षेत्रों को चिह्नित किया। (डी) सीपीजी इलाज या luminoscores के बीच का अनुपात ODN नियंत्रण पक्ष और पीबीएस नियंत्रण पक्ष निर्देशिका है किएक ही पशु के भीतर प्रत्येक ट्यूमर के सापेक्ष विकास को दर्शाता है। इस अनुपात 0. दिन पर 1 करने के लिए स्थापित किया गया था 13 दिन, सीपीजी इलाज समूह के अनुपात में काफी कमी हुई थी (पी = 0.004), सीपीजी डीएनए के सीटू प्रशासन में से ट्यूमर के विकास के अवरोध खुलासा। कृपया यहाँ क्लिक करें देखने के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण।
Discussion
अंगों और ऊतकों द्वारा प्रकाश के अवशोषण, bioluminescence इमेजिंग की एक सीमा बनी हुई है, हालांकि इस सीमा के किसी भी ऑप्टिकल इमेजिंग साधन के लिए स्वाभाविक है। हमारे दृष्टिकोण के संदर्भ में, luminoscore पर शारीरिक संरचनाओं के प्रभाव को कम परिवर्तनशीलता प्रदान की है कि पढ़ाई तो तुलना अनुमति देता है, एक दिया मॉडल (स्थान और माउस किनारा) में प्रदर्शन कर रहे है की संभावना है। Bioluminescence उत्तेजना प्रकाश प्रतिदीप्ति से vivo इमेजिंग में पूरे शरीर के लिए अधिक अनुकूलित है की जरूरत है और इस प्रकार नहीं है।
स्थानिक संकल्प भी bioluminescence इमेजिंग की एक सीमा है, और अंग से bioluminescence फोटॉनों उत्सर्जित कर रहे हैं की सटीक स्थान मुश्किल बनी हुई है। हालांकि, मॉडल का अच्छा ज्ञान ट्यूमर साइटों के गुणात्मक स्थान में मदद कर सकते हैं। इस bioluminescence आधारित पद्धति में केवल उत्पादन luminoscore है। स्थान luminoscore को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि Interes के मैनुअल मार्क-अप क्षेत्रटी (आरओआई) पूरे माउस को शामिल किया। अंत में, जुगनू luciferase ऑक्सीजन की आवश्यकता है। तदनुसार, bioluminescence इमेजिंग आमतौर पर परिगलित ट्यूमर underestimates। एक बार फिर, मॉडल के इस पहलू का एक अच्छा ज्ञान की आवश्यकता है।
इस पत्र में, हम एक एंटी-ट्यूमर दवा के रूप में सीपीजी की प्रभावकारिता (जो पहले से ही 7,9,11 प्रदर्शन किया गया है), लेकिन एक विधि bioluminescence डेटासेट की तुलना की अनुमति का वर्णन करने के आकलन पर निशाना नहीं कर रहे हैं। हम वास्तव में ट्यूमर बोझ अलग अलग समय पर अलग-अलग स्थानों में अलग अलग assays की तुलना के लिए अधिग्रहण प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने में मदद करने के उद्देश्य से यों के लिए एक विधि का वर्णन है और है कि कंप्यूटर गणना की आवश्यकता नहीं है। reproducibility और सही फोटॉन प्रवाह मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग डिवाइस घर में बने उपकरणों के लिए एक प्रकाश संदर्भ के साथ calibrated किया जाना चाहिए या के रूप में वाणिज्यिक उपकरणों के लिए प्रदाता द्वारा की सिफारिश की।
हमारी प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण पी करने के लिए सावधान ध्यान देने की आवश्यकताoints: (i) पहले, माउस संज्ञाहरण की गुणवत्ता, स्पष्ट चित्र प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से लंबे समय जोखिम समय के साथ मामलों में के लिए महत्वपूर्ण है। (Ii) मात्रा का ठहराव इकाई हमेशा होना चाहिए फोटॉन प्रवाह हो सकता है क्योंकि चमक प्रत्येक माउस की सतह क्षेत्र पर निर्भर करता है और अलग चूहों की तुलना के लिए अप्रासंगिक हो सकता है। (Iii) bioluminescence छवियों, संतृप्त पिक्सल शामिल नहीं करना चाहिए, क्योंकि इन पूर्वाग्रह luminoscore होगा। (iv) पीठ और सामने अधिग्रहण सभी फोटॉनों ट्यूमर साइट (यानी, सामने अधिग्रहण जरूरी ट्यूमर के पीछे से फोटॉनों का पता नहीं लगा सकते हैं) से उत्सर्जित इकट्ठा करने के लिए आवश्यक हैं। विभिन्न विभिन्न रॉय चित्र luminoscore विधि के विकास के दौरान परीक्षण किया गया। केवल मैनुअल मार्क-अप संतोषजनक परिणाम है कि अधिक सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है (नहीं दिखाया डेटा) की संभावना है झुकेंगे।
Inoue एट अल। 75 मिलीग्राम की एक खुराक की सिफारिश luciferin / किलो 13। 150 मिलीग्राम की एक खुराक का उपयोग करके / के बाद के बजाय किलो, इमेजिंग के समयluciferin प्रशासन अपरिवर्तित रहता है और हम यह सुनिश्चित करना है कि पठार एक लंबे समय जोखिम अधिग्रहण भर रहता है। Luciferin अधिग्रहण की प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त अभिकारक होना चाहिए। मॉडल पर निर्भर करता है, ब्याज के क्षेत्र, अनुकूलित किया जा सकता है, क्योंकि हम एससीएल मॉडल जहां हम जानवरों के प्रति दो रॉय आकर्षित में पता चला है। एससीएल मॉडल में, उपचार इंजेक्ट किया जाता है जब ट्यूमर अपने सबसे बड़े व्यास परिवर्तनशीलता सीमित करने में 0.5 सेमी तक पहुँचता है engraftment की। चूहों पर निर्भर करता है, ट्यूमर अलग ढंग से बड़े हो गए हो सकता है। मानकीकरण और चूहों की तुलना करने के लिए, हम इलाज और गैर इलाज पक्ष के बीच एक अनुपात है कि दोनों किनारों ट्यूमर के सापेक्ष विकास का पता चलता है का उपयोग करने का फैसला किया है।
कोई संकेत, सकारात्मक होने की उम्मीद कर एक इंजेक्शन माउस से मनाया जाता है या तो (i) कोशिकाओं की संख्या बहुत कम है और संकेत का पता लगाने सीमा से नीचे है; या (ii) माउस ऑक्सीजन का अभाव है और तत्काल देखभाल की आवश्यकता है।
मात्रात्मक bioluminesc के अनेकखिलाडि़यों विभिन्न लेखकों द्वारा वर्णित विश्लेषण उत्सर्जित bioluminescence फोटॉनों 5,15 के पूर्ण मात्रा का ठहराव दृष्टिकोण करने के लिए जटिल गणना और उपकरणों (जैसे, 3 डी bioluminescence टोमोग्राफी) की आवश्यकता होती है। वहाँ reproducibly bioluminescence बढ़ाता है, विशेष रूप से ट्यूमर मॉडल में, एक 2 डी bioluminescence इमेजर के साथ के लिए एक विधि पर कोई आम सहमति नहीं है। हमारा उद्देश्य उपयोगकर्ता निर्भरता को सीमित करने की छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल का मानकीकरण करने के लिए था।
ट्यूमर टीका के बाद बगल में सीपीजी के इंजेक्शन दोनों मॉडल में ट्यूमर बोझ कम हो। luminoscore विधि ट्यूमर immunotherapies के अन्य मॉडलों में ट्यूमर बोझ की निगरानी के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं। निगरानी ट्यूमर बोझ एक noninvasive तरीका है कि ट्यूमर microenvironment के साथ हस्तक्षेप किए बिना ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसाइज़िंग तंत्र के बारे में हमारी समझ में सुधार कर सकते हैं प्रदान करता है। जानवरों है कि क्या करना है और इस विधि के साथ उपचार का जवाब नहीं है की पहचान एस के सत्यापन से मजबूत बनाया हैप्रयोग की शुरुआत में uccessful ट्यूमर सेल इंजेक्शन।
हम यहाँ A20.IIA-luc2 कोशिकाओं का उपयोग कर एक एससीएल मॉडल में luminoscore विधि की अनुकूलनशीलता दिखाया। हालांकि, इस पद्धति अन्य सेल लाइनों बशर्ते कि वे luciferase व्यक्त करते हैं, या का उपयोग कर किसी अन्य ट्यूमर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता टी सेल स्टडीज (ट्यूमर विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं, विनियामक टी कोशिकाओं, आदि) के संदर्भ में। दुर्लभ बीमारी के जीन थेरेपी के संदर्भ में इन विवो जीन स्थानांतरण की निगरानी भी luminoscore विधि का उपयोग किया जा सकता है।
अंत में आंकड़ों से पता चलता है कि bioluminescence आधारित luminoscore विधि प्रयोगों के बीच तुलना में सक्षम बनाता है, विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के लचीलापन और अनुकूलन क्षमता प्रदान करता है, और noninvasive अनुदैर्ध्य preclinical अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Acknowledgments
हम Cordelier रिसर्च सेंटर (CEF, पेरिस, फ्रांस), Genethon (Evry, फ्रांस) और Genopole (CERFE, Evry, फ्रांस) के पशु सुविधाओं धन्यवाद। हम पांडुलिपि की उसे सावधान पढ़ने के लिए जो एन Cahn धन्यवाद। इस शोध संस्थान में राष्ट्रीय डी ला Santé एट डी ला Rechercher médicale, पेरिस डेसकार्टेस विश्वविद्यालय, पियरे और मैरी क्यूरी विश्वविद्यालय, एसोसिएशन डालना ला Recherche contre le कर्क, ट्यूनीशियाई दिशा जेनरल डे ला Recherche Scientifique, फ्रेंको-ट्यूनीशियाई CMCU द्वारा समर्थित किया गया परियोजना, और Thématiques Incitatives डी Genopole (ATIGE) धन प्रक्रिया। जे.सी. जीवन विज्ञान में डॉक्टरेट स्कूल में फ्रंटियर्स द्वारा और इंका (Institut राष्ट्रीय du कैंसर) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया। RBA DGRS-INSERM और CMCU से अनुदान के एक प्राप्तकर्ता था। एसडी इंस्टीट्यूट राष्ट्रीय du कैंसर से अनुदान प्राप्त किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
| ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
| D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
| Ketamin | Virbac, France | ||
| Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
| A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
| Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
| IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
| Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
| R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
| Hamilton Precision Serynge 10 µl | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
| Eye ointment | Lacrinorm | ||
| Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |
References
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