Summary
Bioluminescentie beeldvorming is een bekend hulpmiddel voor het lokaliseren van tumoren en metastasen, maar kwantificering van deze beelden zijn vaak complexe berekeningen en bijzondere instrumenten. We beschrijven de easy-to-use luminoscore methode, gebaseerd op een nauwkeurige overname voorwaarden, vereist geen berekeningen, en het mogelijk maken tumorlast en de respons op de behandeling te kunnen houden in muismodellen.
Introduction
Vroege detectie van tumorcellen blijft een uitdaging en is van cruciaal belang voor het verbeteren van de behandeling van kanker werkzaamheid. In vivo bioluminescentie imaging (BLI) is een zeer gevoelig, niet-invasieve optische techniek op grote schaal gebruikt voor het bewaken van tumoren in kleine dieren. Vuurvlieg-luciferase tot expressie brengen worden gebruikt voor deze experimenten 1,2. Deze oxygenase oxideert D-luciferine met moleculaire zuurstof maar vereist twee cofactoren - Mg2 + en adenosine trifosfaat 3. Vuurvlieg luciferase is meer geschikt voor in vivo beeldvorming dan Renilla luciferase 4 omdat de kwantumopbrengst hoger.
Het geoxideerde substraat - oxyluciferine - emitteert een foton spontaan terugkeert naar zijn grondtoestand en inactief. De uitgezonden fotonen hebben een maximale golflengte rond 530 nm. De zeer gevoelige camera kan de luminescerende fotonen detecteren van de binnenkant van een klein dier en leveren beelden die zij maken mogbare tumorcellen lokaliseren.
De mogelijkheid om tumorlast nauwkeurig kwantificeren fotontellingen kan dienen als een krachtig en gevoelig middel voor het kwantificeren behandeling werkzaamheid. Omdat neveneffecten sneller kan worden gedetecteerd, kan deze gevoeligheid het mogelijk om het exacte moment waarop een behandeling ingaat bepalen.
Absolute kwantificering van totaal geëmitteerde fotonen is zeer complex. Het aantal fotonen verzameld afhankelijk van de diepte van de tumor en de organen van de fotonen worden door de uitgezonden. Correctiecoëfficiënten gebaseerd op weefselabsorptieplaats coëfficiënten worden berekend 5, maar de absolute kwantificering van tumorcel cijfers nodig weten het aantal fotonen door elk tumorcel. Bovendien luciferase expressie, zoals die van vele reportergenen (bijv., Fluorescerende eiwitten) niet homogeen, zelfs in een celpopulatie verkregen uit een enkele kloon 6. Het aantal luciferase eiwitten in cellen kan niet exact worden berekend. Om gestandaardiseerde experimentele omstandigheden lijkt dus cruciaal voor een betrouwbare semikwantitatieve analyse.
We pasten de luminoscore methode om twee verschillende muislymfoma modellen 7,8,9. In deze modellen worden syngene tumorcellen geïnjecteerd in het oog of onder de huid, een primaire intraoculaire lymfoom (PIOL) model en een subcutane lymfoom (SCL) model te verkrijgen, respectievelijk. In elk van deze orthotopische modellen, wordt de behandeling toegediend in situ, zeven dagen na de tumor-inoculatie voor PIOL en wanneer de tumor bereikt 0,5 tot 0,7 cm in zijn grootste diameter SCL.
We gebruikten de luminoscore methode om de effecten van in situ CpG behandeling te controleren, eerder aangetoond effectief 7,10,11 zijn. CpG is een oligonucleotide sequentie en een ligand van TLR9, die op zijn beurt een intracellulaire receptor door talrijke ce uitgedruktlls van het immuunsysteem, zoals dendritische cellen, B lymfocyten, monocyten en natuurlijke killer cellen. CpG-DNA is een 20-meer DNA-sequentie die de CpG (CG) immunostimulerende-motief bevat; de controle (ODN-control) gelijk is aan 20-meer DNA-sequentie, behalve dat het immunostimulerende sequentie CG geïnverteerd (GC). TLR9 engagement in het muizen lymfoom onderzoeken we induceert apoptose 10, activeert het immuunsysteem 12 en daardoor vermindert tumorlast 7,11.
Hier beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor het kwantificeren van de tumor lasten en respons op de behandeling door middel van bioluminescentie beelden. Deze methode is gebaseerd op verschillende aspecten van de beeldvorming procedure, van acquisitie tot analyse, om de betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid, non-user afhankelijkheid en statistische significantie te optimaliseren. Een bioluminescentie kwantificering index wordt toegeschreven aan elke muis; Deze waarde, die wij noemen luminoscore, vergelijkbaar niet alleen tussen dieren, maar aldus tussen de experimenten.
In dit werk, richten we ons op de bioluminescentie imaging procedure, alsmede het beeld kwantificering door de luminoscore methode. We tonen de effectiviteit van deze werkwijze voor het verifiëren van de injectie controle tumorlast, en beoordeling van de werkzaamheid van behandeling situ kanker. Elk van deze punten wordt geïllustreerd in representatieve resultaten van experimenten met verschillende muismodellen om het aanpassingsvermogen van de luminoscore methode te markeren.
Protocol
Alle procedures waarbij muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Unie, de Franse regelgeving voor dierproeven (Ministerie van Landbouw wet nr 2001-464, mei 2001), en de richtlijnen van het Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Commissie Animal Research en werden goedgekeurd door de relevante lokale commissie (de Charles Darwin ethische commissie voor dierproeven, Parijs, Frankrijk; nummer van de vergunning: p3 / 2009/004).
1. Celbereiding
- Groei van muizen-B-lymfoom cellijn A20.IIA-luc2 in RPMI-1640 medium aangevuld met Glutamax 10% foetaal kalfsserum, 100 ug / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 10 mM natriumpyruvaat, 50 pM 2-mercaptoethanol en 0,50 mg / ml hygromycine B.
- Handhaaf celkweek bij 37 ° C, 5% CO2 en veranderen medium elke twee tot drie dagen. Harvest 5 ml van de celsuspensie met een pipet één dag nadat de drager.
- Spin cellen bij 3005; g gedurende 10 minuten en suspendeer de cellen in 3 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal deze stap tweemaal om de cellen te wassen.
- Mix 15 pi celsuspensie met 30 pi trypan Blue labeling voor het laden van een Malassez telkamer. Bereken de celconcentratie met de formule: Concentratie (cellen / ml) = Aantal cellen in de telrooster * 3 * 1000.
- Draai de cellen nog een keer bij 300 xg gedurende 10 min. Verwijder supernatant met een pipet. Met C de concentratie berekend bij stap 1,4), het aantal cellen N = C * 3.
- Bereken het volume steriel PBS 1x nodig om een celsuspensie te verkrijgen met een concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml met de volgende formule: PBS Volume (ml) = N / (5 x 10 7). Suspendeer de celpellet (uit stap 1.5)) in volume steriel PBS 1x berekend in de vorige zin. Een celsuspensie wordt gebruikt in de SCL model (in vivo geïnjecteerde volume 100 pl: 5 x 10 6 cellens).
- Pipetteer 10 ul celsuspensie A en voeg 90 pl steriel PBS in een 1,5 ml buis 100 pl celsuspensie B at 5 x 10 6 cellen per ml te verkrijgen. Celsuspensie B wordt gebruikt in de PIOL model (in vivo geïnjecteerde volume 2 ui: 1 x 10 4 cellen).
2. Luciferine
- Verdun 1 g D-luciferine kaliumzout poeder in 30 ml steriel PBS 1x in een 50 ml buis en schud gedurende enkele seconden om de aggregaten op te lossen.
OPMERKING: Omdat luciferine is lichtgevoelig, voor te bereiden 500 ul fracties in het donker 1,5 ml microcentrifugebuizen. - Bewaar de fracties bij -20 ° C.
Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen voor meerdere maanden.
Na het ontdooien, moet de monsters niet opgeslagen langer dan 1 dag bij + 4 ° C. Invriezen-ontdooien cycli voorkeur opslag bij 4 ° C. - Injecteer 100 ui van D-luciferine kalium zoutoplossing intraperitoneaal elke imaging ASSAy.
Opmerking Deze oplossing komt overeen met 3,3 mg per muis voor een dosis van 150 mg / kg.
3. anesthesiemengsel en verdoving
- Bereid een anestheticum door mengen ketamine 120 mg / kg xylazine en 6 mg / kg in steriele PBS 1x.
- Injecteer 60 ul van verdoving mengsel intraperitoneaal voor elke imaging test met een 25 G naald. Voor chirurgie (met PIOL of SCL model) Injecteer 80 pi van het mengsel tot een diepere anesthesie verkrijgen. Zet de muis terug in de kooi.
- Wanneer de muis verschijnt onbeweeglijk, haal hem uit zijn kooi en knijp het been van de muis tussen de vingers. Als de muis reageert met een ontsnapping reflex, wacht u enkele minuten. Herhaal deze actie totdat de muis niet reageert, die bevredigend verdoving wordt bevestigd.
- Plaats de muis op een warmhoudplaat of onder een opwarming licht.
- Toepassing oogzalf om droge ogen tijdens verdoving voor de imaging-test of SCL een operatie te vermijden. Breng deoogzalf na de operatie voor de PIOL model.
4. Chirurgie en Cell Inenting
LET OP: Voer alle chirurgische ingrepen op een warmhoudplaat of onder een opwarming licht, in een type 1 microbiologische veiligheid kabinet in een dier bioveiligheidsniveau 2 faciliteit. Alle chirurgische instrumenten die gebruikt worden in deze sectie werden geautoclaveerd voor gebruik.
- Subcutane Lymphoma Model:
- Bereid 100 pi van de celsuspensie verkregen in stap 1,6 in een 1 ml spuit met een 25 G naald. Knijp de muis huid op de flank tussen de vingers, op de injectieplaats. Steek de naald precies in de huidplooi. Om subcutane injectie te garanderen, mag u de naald diep in het weefsel.
- Injecteren van de cellen in de huidplooien. Zien of een beetje vloeibaar bal verschijnt onder de huid te bevestigen dat de injectie correct is uitgevoerd.
- Bereid 100 pi van de celsuspensie verkregen in stap 1,6 in een 1 ml spuit met een 25 G naald. Knijp de muis huid op de flank tussen de vingers, op de injectieplaats. Steek de naald precies in de huidplooi. Om subcutane injectie te garanderen, mag u de naald diep in het weefsel.
- PIOL model:
LET OP: Deze procedure vereist 2 operators, hier aangeduid als operator 1 en operator 2.- Verwijdering van bindvlies:
- Heeft Operator 1 plaats van de muis onder een dissectie microscoop. Druk zachtjes met de vingers aan weerszijden van het oog om het te wissen. Hou deze positie.
- Hebben Operator 2 l OOK door het ontleden microscoop. Grip het bindvlies met een kleine tang in de ene hand; met de andere hand, stuurde de conjunctiva net onder de tang met een paar kleine chirurgische schaar.
- Heeft Operator 1 vrijlating het oog van de muis ingedrukt bij stap 4.2.1.1)
- Celinjectie:
- Bereid een 10-ul botte precisie spuit. Was het door het pompen van steriel gedemineraliseerd water doorheen. Herhaal twee of drie keer te zorgen dat er geen luchtbellen in de spuit. Vervolgens worden 2 pl celsuspensie voor injectie.
- Hebben Operator 2 druk zachtjes met de vingers van ope hand aan iedere zijde van het oog om het te wissen. Hou deze positie.
- Heeft Operator 1 greep de rand van het oog met een kleine tang in de ene hand en trek het voorzichtig naar achteren om het weefsel te rekken.
- Hebben Operator 2 l OOK door het ontleden microscoop. Met anderzijds een kleine opening in de onderste oogbol van de muis met een 32 G naald.
- Hebben Operator 2 zette de naald en pick-up (met dezelfde hand) de precisie spuit en steek de naald in het gat gemaakt in stap 4.2.2.4.
- Heeft Operator 1 druk op de zuiger met de andere hand.
- Hebben Operator 2 v erify met het ontleden microscoop die de celsuspensie in de spuit op de juiste manier in de oogbol ingespoten (de vloeistofstroom is gemakkelijk waarneembaar).
- Hebben Operator 2 V ERWIJDER de precisie spuit.
- Heeft Operator 1 r Elease de rand van eeniMAL oog gegrepen bij stap 4.2.2.3)
- Hebben Operator 2 r Elease de zijkanten van het oog geperst bij stap 4.2.2.2)
- Breng de oogzalf onmiddellijk.
LET OP: Als alle stappen correct zijn uitgevoerd, moet de muis helemaal niet bloeden tijdens deze procedure.
- Verwijdering van bindvlies:
5. Bioluminescentie Imaging - Day 0
Opmerking: Alle producten geïnjecteerd in de muis moeten bij KT vóór injectie. Nadat de tumorcellen is geïnoculeerd, en terwijl het dier nog verdoofd, verder met deze stappen voor de beeldvorming.
- Schakel de imager en open de acquisitie software. Initialiseer de camera, de stadia, en de lenzen door te klikken op de knop "Initialize". De initialisatie duurt 10 tot 15 minuten volledig te zijn.
- Injecteer 100 ul van D-luciferine kaliumzout oplossing intraperitoneaal met een 25 G naald. Doe het niet intraveneus toedienen. Als intravenous wordt toegediend om welke reden moet de D-luciferine natriumzout te gebruiken in plaats D-luciferine kaliumzout.
OPMERKING: Luciferine is de overmaat reactant bij deze concentratie; daarom bioluminescentie signaal bereikt een plateau na 3-7 minuten en blijft langer dan 30 minuten. - 10 min na D-luciferine injectie 13, plaatst het onderwerp muis in de imager. Plaats de muis in zijn natuurlijke positie, de rug naar de camera, in een zo vlak mogelijke positie. Deze positie is natuurlijk en gemakkelijk reproduceerbaar.
- Vink de functie voor automatische belichting, en klik op Ophalen om het beeld terug te (posterior) van het dier te verwerven, met de functie voor automatische belichting.
NB: De functie automatische belichting optimaliseert de belichtingstijd door het berekenen van deze afbeelding van een 1-sec blootstelling aan. Als de muis bioluminescentie signaal negatief of zeer laag is, kan de optimale belichting tijdautomatisch ingesteld op meer dan 20 min. In dit geval kan een belichtingstijd van 8-10 minuten een goed compromis. Belichtingstijd kan handmatig worden ingesteld, maar de beelden mag geen verzadigde pixels bevatten. - Keer de muis om naar de voorkant van de muis om de camera bloot. Probeer de muis plat en spreiden de voorpoten zodat ze de borst blokkeren.
- Het verwerven van een front beeld van het dier. Controleer of het selectievakje automatische belichting is nog steeds aangevinkt en klik opnieuw op de "Acquire" knop.
LET OP: Het beeld voorzijde kan worden verkregen voordat het beeld heen en vice versa. De belichtingstijd van voor- en achterkant afbeeldingen kunnen verschillen afhankelijk van de relatieve intensiteit van elke zijde van de muis. Het wordt automatisch berekend bij gebruik van de functie automatische belichting. Kwantificering gebruikt alleen de fotonflux (fotonen per seconde) en is niet afhankelijk belichtingstijd. - Plaats de muis op een van de aarde plate of onder een opwarming licht totdat hij herstelt van de narcose en plaats het dan terug in zijn kooi.
6. Bioluminescentie Imaging - After Day 0
- Schakel de imager, initialiseren van de camera, de stadia, en de lenzen zoals in stap 5.1).
- Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 60 pl van de ketamine (120 mg / kg) / xylazine (6 mg / kg) mengsel (zie stap 3,1-3,5).
LET OP: Deze methode van verdoving maakt imaging elke 5 dagen. Dagelijks beeldvorming, een methode die gebruikt isofluraan als verdovingsmiddel en een bioluminescentie imager geschikt voor gebruik met deze verdoving vereist voeren. - Verwerven voor- en achterkant beelden van het dier, met de functie automatische belichting, zoals in stap 5,5) en 5,6). Behandel de muis als in stap 5.7).
7. Bioluminescentie kwantificering en beeldanalyse
LET OP: De luminoscore methode is gebaseerd op de afbeelding analysis. Zodra de beelden zijn verkregen op basis van de bovenstaande stappen, kan de kwantificering worden uitgevoerd op elk gewenst moment (met inbegrip van onmiddellijk na de overname), een luminoscore koppelen aan elke muis op elk tijdstip.
- Geef het "Tool Palette" door te klikken op het menu "View" en klik vervolgens op "Tool Palette" als deze niet al worden weergegeven. Klik op het tabblad "ROI Tool" van de Tool Palette. Kies de "Contour" knop en selecteer "Free draw".
- Handmatig markeren van het gebied van belang (ROI) rond de muis door de randen van de muis in het vooraanzicht. Sluit de contour met een klik met de rechtermuisknop op de computer muis.
- Klik op het menu "View" en vervolgens op "ROI Measurements". Zorg ervoor dat "Radiance (fotonen)" is geselecteerd in de "Meting types" menu scrollen op de linkerbenedenhoek van het venster "ROI Measurements". Zo niet, dan selecteert u deze. Meet vervolgens de foton flux (ph / s) door registratie van de waarde in het "Total Flux [p / s]" vak.
LET OP: Gebruik geen Radiance of een andere eenheid die ten opzichte van het ROI oppervlakte. - Herhaal stap 7.2) en 7.3) voor de rug weergave.
- Som de twee foton flux waarden verkregen uit voor- en achterkant weergave. Het resultaat is de luminoscore.
- Vergelijk de waarden voor elke groep met een geschikt statistisch onderzoek (niet-parametrische tweezijdige Mann Whitney-test, bijvoorbeeld) 14.
Representative Results
De Luminoscore methode kan dienen om de injectie van tumorcellen Verifieer
In modellen waarbij de injectie van een klein aantal tumorcellen of wanneer de injectieplaats visuele verificatie van de injectie niet toelaat, kan het zeer moeilijk zijn om de kwaliteit van de toediening te garanderen. De luminoscore methode dient als een snelle en handige tool om de kwaliteit van de procedure te verifiëren en gemakkelijk en onmiddellijk dat alles goed ging vast te stellen. In beide modellen, de tumor detecteerbaar al 10 minuten na de injectie (Figuur 1A). De beelden alleen voldoende om te controleren of tumorcellen aanwezig zijn in de juiste locatie. Niettemin kwantificeren van de afbeeldingen geeft een beeld van de heterogeniteit van de injectie. De dot plot (Figuur 1B) toont duidelijk een verschil tussen dieren die ontvangen (zwarte stippen) en niet opnieuwceive (rode lijn) injecties. Interessant is dat de verkregen in de SCL model signaal 100 maal hoger dan in de PIOL model; Deze bevinding komt overeen met het aantal cellen geïnjecteerd (5 x 10 6 en 1 x 10 4 cellen, respectievelijk).
Figuur 1. Controle van de Injectie in andere muis lymfoom Models. De luminoscores gemeten 10 min na tumorcel inoculatie in verschillende lymfoom modellen. (A) Representatieve beelden van beide modellen. (B) Luminoscore van elk dier in de verschillende modellen. De rode lijn komt overeen met de gemiddelde achtergrondgeluid gemeten op 10 dieren vóór tumorcel enten; de gestippelde lijnen zijn de gemiddelde +/- standaarddeviatie. Voor elk model, kunnen alle dieren worden onderscheiden van achtergrondruis. In de PIOL model, 1 x 10 4 cellen Inoculated in het glasvocht van het rechter oog, en in het SCL model, 5 x 10 6 cellen subcutaan in elke flank van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Monitoring Tumor Burden en behandeling Response
De luminoscore is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van tumorgroei en werkzaamheid van de behandeling. Figuur 2A toont representatieve beelden van de controle op tumorgroei in de controle en de behandelde CpG PIOL groepen. De muizen werden geïnoculeerd met 1 x 10 4 tumorcellen elk, en behandeling werd toegediend in situ op dag 7. De beelden tonen dat na een voldoende tijd (28 dagen), metastasen begon te verschijnen in de controlegroep. Hoewel de primaire tumor ongevoelig leek behandeling, mindermetastasen werden waargenomen in de CpG-behandelde groep (Tabel 1). De kwantitatieve analyse van de tumorlast in elke groep (Figuur 2B) toont dat CpG vertraagde tumorontwikkeling, produceert een statistisch significant verschil tussen de behandelde en de controlegroep na 28 dagen (niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney-test p = 0,0079 ). Niettemin, de tumoren groeiden nog in de behandelde muizen, en geen van hen overleefden (gegevens niet getoond). Deze bevinding is consistent met eerdere verslagen: CpG geen beduidend effect op de primaire oogtumoren 10. De significant effect dat we hier tussen de ODN en de CpG groep komt uit de metastase groeiremming.
Figuur 2. Monitoring tumorlast en de respons op de behandeling. (A) Representatieve beelden van de twee groepen (ODN-controle en CpG-behandelde) of PIOL-dragende muizen. (B) Monitoring tumorlast met de luminoscore. Gezien op de puntdiagram het effect van CpG op luminoscore significant op dag 28. In deze twee groepen, deze methode was het mogelijk om tumorlast volgen en de geringe maar significante (p = 0,0079) effecten van CpG- meten DNA, wat kan niet door beelden alleen aangetroffen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| groepen | Muis | Aanwezigheid van uitzaaiingen | plaats | Fotonflux (ph / s) |
| CpG | 1 | Nee | X | X |
| 2 | Ja | 9.32E + 05 | ||
| 3 | Nee | X | X | |
| 4 | Nee | X | X | |
| 5 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt | 2.21E + 07 | |
| ODN | 1 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt | 1.06E + 07 |
| 2 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt | 7.25E + 07 | |
| 3 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt + contralaterale | 7.64E + 08 | |
| 4 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt + contralaterale | 1.74E + 09 | |
| 5 | Ja | Eye-drainerende lymp knooppunt + contralaterale | 9.76E + 07 |
Tabel 1. THij Luminoscore methode kan worden aangepast aan verschillende benaderingen
De luminoscore methode is niet beperkt tot één type muismodel. Figuur 3 laat zien dat het kan worden aangepast aan verschillende muismodellen. In de SCL model worden twee tumoren geënt aan weerszijden van de muis. De behandeling wordt toegediend in situ op één enkele zijde op dag 0, en de contralaterale tumor dient als controle (Figuur 3A). Daarom werden twee ROI getekend per muis: één voor elke zijde (figuur 3C). De verhouding tussen de luminoscore op de behandelde en de controlegroepen zijden beschrijft de relatieve loop van een tumor. Deze verhouding werd ingesteld op 1 op dag 0, wanneer de behandeling werd toegediend. Wij observeerden een significante daling van deze verhouding 13 dagen na de behandeling toediening (figuur 3D, niet-parametrische tweezijdige Mann-Whitney-test p = 0,004). Deze daling blijkt dat de behandelde zijde tumoris geresorbeerd, zoals op de representatieve bioluminescentie beelden (figuur 3B).
Figuur 3. Aanpassing van de Luminoscore Methode om een model met twee primaire tumor sites. (A) Experimentele ontwerp van een SCL assay. De muizen werden geïnjecteerd met twee primaire tumoren bij elke flank. Een kant is geïnjecteerd met ofwel CpG-DNA of ODN-controle, en de andere kant met PBS, om te dienen als controle. (B) Representatieve beelden van CpG-behandelde en controlemuizen op dag 0 en dag 13. De behandeling werd toegediend op dag 0. de tumorgroei werd geremd op de CpG-behandelde zijde van de muis. (C) de handbediende gemarkeerd interessegebieden per dier twee primaire tumorplaatsen. (D) de verhouding tussen de luminoscores van de CpG-behandeld of ODN-control kant en de PBS-controle kant is een index dieweerspiegelt de relatieve groei van elke tumor in hetzelfde dier. Deze verhouding werd ingesteld op 1 op dag 0. Op dag 13 was de verhouding van de CpG-behandelde groep significant af (p = 0,004), wat voor de remming van tumorgroei door in situ toediening van CpG-DNA. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.
Discussion
Lichtabsorptie door de organen en weefsels is een beperking van bioluminescentie beeldvorming, hoewel deze beperking is inherent aan elke optische beeldvorming modaliteit. In het kader van onze benadering worden de effecten van anatomische structuren op de luminoscore wordt naar lage variabiliteit, voor zover dit onderzoek uit te voeren in een bepaald model (locatie en muis streng), waardoor vervolgens vergelijkingen. Bioluminescentie niet excitatie licht nodig en dus is meer aangepast aan het gehele lichaam in vivo beeldvorming dan fluorescentie.
Ruimtelijke resolutie is ook een beperking van bioluminescentie beeldvorming, en de precieze locatie van het orgaan waaruit bioluminescentie fotonen worden uitgestoten blijft moeilijk. Echter, goede kennis van het model helpen bij het kwalitatieve locatie van de tumor sites. De enige uitgang in deze bioluminescentie-gebaseerde methode is de luminoscore. Locatie heeft geen invloed op de luminoscore omdat de handmatige mark-up Regio Interest (ROI) bestrijkt het hele muis. Tenslotte vuurvlieg luciferase zuurstof nodig. Dienovereenkomstig, bioluminescentie beeldvorming onderschat meestal necrotische tumoren. Wederom wordt een goede kennis van dit aspect van het model vereist.
In dit document, zijn we niet de bedoeling de werkzaamheid van CpG als een anti-tumor drugs (reeds aangetoond 7,9,11), maar een werkwijze die een vergelijking van bioluminescentie datasets te beschrijven. We inderdaad een methode om tumorlast te helpen bij de acquisitie standaardiseren protocol voor het vergelijken van verschillende assays op verschillende plaatsen op verschillende tijdstippen kwantificeren beschrijven en die niet vereist computerberekeningen. Om de reproduceerbaarheid en correcte foton flux kwantificering te garanderen, moet de beeldvormende inrichting worden gekalibreerd met een lichte referentie voor zelfgemaakte apparaten of zoals aanbevolen door de provider voor commerciële apparaten.
Ons protocol vereist een zorgvuldige aandacht voor een aantal cruciale points: (i) eerste moet de kwaliteit van de muis anesthesie is cruciaal voor het verkrijgen van duidelijke beelden, vooral in gevallen met lange belichtingstijden. (Ii) Kwantificering apparaat altijd als fotonflux omdat straling afhangt van de oppervlakte van elke muis en irrelevant voor het vergelijken van verschillende muizen kunnen zijn. (Iii) De bioluminescentie afbeeldingen moeten niet verzadigde pixels bevatten, omdat deze zouden bias luminoscore. (iv) Voor- en achterkant verkrijgen moeten alle fotonen uitgezonden door de tumorplaats (dus front verkrijging niet noodzakelijkerwijs fotonen uit de achterkant van de tumor detecteren) verzamelt. Verschillende ROI tekeningen getest tijdens de ontwikkeling van de luminoscore methode. Alleen de handmatige verhoging bevredigend resultaat oplevert dat vaker statistisch significant te zijn (gegevens niet getoond).
Inoue et al. aan een luciferine dosis van 75 mg / kg 13. Door een dosis van 150 mg / kg in plaats daarvan het tijdstip van beeldvorming naluciferine administratie blijft onveranderd en wij zorgen ervoor dat het plateau duurt gedurende een lange overname blootstelling. Luciferine moet de overmaat reactant gedurende de acquisitie proces. Afhankelijk van het model, kan het gebied van belang worden aangepast, zoals we in het SCL model waar we trokken twee ROI per dier liet zien. In de SCL model wordt de behandeling ingespoten wanneer de tumor van 0,5 cm in zijn grootste diameter van de variabiliteit te beperken bereikt van engraftment. Afhankelijk van de muizen, de tumor kan anders zijn gegroeid. Standaardiseren en te vergelijken muizen besloten we een verhouding tussen behandelde en niet-behandelde zijde waar de relatieve groei van beide flanken tumoren onthult gebruiken.
Wanneer geen signaal wordt waargenomen vanaf een geïnjecteerde muis verwacht positief, hetzij (i) het aantal cellen is zeer laag en het signaal onder de detectiedrempel; of (ii) de muis ontbreekt zuurstof en vereist directe zorg.
Verscheidene van de kwantitatieve bioluminesclingen analyses beschreven door verschillende auteurs vereisen complexe berekeningen en instrumenten (bijvoorbeeld 3D bioluminescentie tomografie) om de absolute kwantificering van bioluminescentie uitgezonden fotonen 5,15 benaderen. Er is geen consensus over een methode voor het kwantificeren van bioluminescentie reproduceerbaar, vooral in de tumor modellen, met een 2D imager bioluminescentie. Ons doel was om het beeld overname protocol om user-afhankelijkheid te beperken standaardiseren.
De injectie van CpG in situ tumor-inoculatie verminderde tumorlast in beide modellen. De luminoscore methode kan dienen als een middel om tumorlast in andere modellen van tumor immuuntherapie te bewaken. Monitoring tumorlast verschaft een niet-invasieve methode die ons begrip van tumorgroei en metastasering mechanismen kunnen verbeteren zonder interferentie met de tumor micro-omgeving. De identificatie van de dieren die wel en niet reageren op een behandeling met deze methode wordt versterkt door de verificatie van de sUccessful injectie van tumorcellen aan het begin van het experiment.
We hier toonde het aanpassingsvermogen van de luminoscore methode in een SCL model met behulp van A20.IIA-luc2 cellen. Echter kan deze methode worden aangepast aan andere tumormodel op andere cellijnen mits luciferase expressie, of in de context van T-cel studies (tumorspecifieke cytotoxische T-cellen, regulerende T-cellen, enz.). De controle van in vivo genoverdracht in de context van gentherapie van zeldzame ziekte kan ook gebeuren met het luminoscore methode.
Tenslotte is de gegevens blijkt dat de bioluminescentie gebaseerde luminoscore methode maakt vergelijkingen tussen experimenten, biedt flexibiliteit en aanpasbaarheid aan de specifieke experimentele behoeften, en is een handig hulpmiddel voor niet-invasieve longitudinale preklinische studies.
Acknowledgments
We danken het dier faciliteiten van het Cordelier Research Center (CEF, Parijs, Frankrijk), Genethon (Evry, Frankrijk) en Genopole (CERFE, Evry, Frankrijk). Wij danken Jo Ann Cahn voor haar zorgvuldige lezing van het manuscript. Dit onderzoek werd gesteund door het Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre en Marie Curie Universiteit, de Association pour la Recherche contre le Cancer, de Tunesische Direction Générale de la Recherche Scientifique, de Frans-Tunesische CMCU project, en de acties Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) fondsen. JC werd gesteund door de Frontiers in Life Science Doctoral School en door een beurs van de INCA (Institut National du Cancer). RBA was een ontvanger van subsidies van de DGRS-INSERM en de CMCU. SD ontving een subsidie van het Institut National du Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
| ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
| D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
| Ketamin | Virbac, France | ||
| Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
| A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
| Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
| IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
| Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
| R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
| Hamilton Precision Serynge 10 µl | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
| Eye ointment | Lacrinorm | ||
| Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |
References
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2 (6), New York, N.Y. 491-495 (2000).
- Edinger, M., et al. Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging. European Journal of Cancer. 38 (16), Oxford, England. 2128-2136 (2002).
- Hastings, J. W., Gibson, Q. H. The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase. Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).
- Inouye, S., Shimomura, O. The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).
- Pesnel, S., et al. Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology. Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).
- Corre, G., et al. Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Ben Abdelwahed, R., et al. Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18 (2013).
- Abdelwahed, R. B., et al. Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).
- Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Sautès-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances in Hematology. 2012, (2012).
- Qi, X. -F., et al. CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways. Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).
- Houot, R., Levy, R. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).
- Krieg, A. M. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).
- Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging. International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update. Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1 (2014).
