Introduction
A rica história da pesquisa que abrange mais de 50 anos tem sido focada em quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos vasculares. Estes estudos permitem-nos compreender melhor tanto o comportamento fisiológico e patológico dos vasos sanguíneos, fornecer uma base para a avaliação da eficácia / compatibilidade dos dispositivos endovasculares, e ajuda no projeto e fabricação de engenharia vascular constrói 1-6. A medição precisa da resposta mecânica dos tecidos moles e modelação de suas propriedades mecânicas é inerentemente difícil devido à heterogeneidade mecânica, anisotropia, não-linearidade e exibido pela maioria dos tipos de tecidos. Além disso, as medições experimentais são muitas vezes confundidos pelas complexidades locais introduzidas nas interfaces amostra aderência no decorrer de ensaios mecânicos (ie, flexão, fricção, as concentrações de tensão, rasgando) e a transição inevitável das propriedades mecânicas, uma vez tecido é cortado do animal vivo. </ p>
Uma experiência à tracção uniaxial está entre os ensaios mecânicos mais simples que podem ser executadas em uma amostra feita de um material sólido, e é muitas vezes utilizado para avaliar a resposta mecânica do tecido vascular. Os resultados destas experiências proporcionar informação preliminar útil para ambas as fontes de tecido nativo e artificiais, e pode ser utilizado para comparar os efeitos de determinados tratamentos de estados de doença, ou compostos farmacológicos sobre o comportamento mecânico da parede vascular 7-11.
Uniaxial teste mecânico de tecidos moles é tipicamente realizada em amostras com geometrias relativamente uniformes, os quais são mais comumente cão-do osso ou em forma de anel 7,8,12-14. No entanto, afastamento significativo destas geometrias idealizadas pode ocorrer devido a problemas associados com dissecção do tecido, isolamento, e de aperto dentro do sistema de testes. Qualquer falta de uniformidade na geometria acabará por dar origem ao estresse e tensão heterogêneocampos quando a amostra é submetida a extensão uniaxial, com o grau de heterogeneidade dependente da forma real da amostra, assim como o tamanho da amostra (em relação aos apertos) e as propriedades mecânicas do material 9,15,16. Quando heterogeneidades de campo são significativos, os cálculos amostra de tensão com base nas posições de aperto relativos são imprecisos e, portanto, uma base suficiente para avaliar o comportamento mecânico.
Sistemas de análise de vídeo têm sido amplamente utilizados para medições de deformação dos tecidos moles, muitas vezes usando marcadores corantes alto contraste aplicadas à superfície da amostra 17,18. Correlação de imagem digital, uma técnica que mede metrológico óptica de campo total da superfície de tensão, comparando valores de intensidade de nível de cinzento na superfície da amostra antes e após a deformação, tem sido utilizado em conjunto com análises de vídeo de tecidos moles 19-21. Existem várias vantagens de correlação de imagens digitais em comparação com interferometric métodos que podem ser utilizados para as medições. Em primeiro lugar, como uma técnica de medição sem contacto, que minimiza os efeitos de confusão de modificar as propriedades do material, devido à forma em que o sistema de medição afecta o espécime. Em segundo lugar, é necessário um ambiente de medição muito menos rigoroso e tem uma gama mais alargada de sensibilidade e resolução do que outros métodos. Em terceiro lugar, dotado com a capacidade de capturar um campo cheio de vista, esta técnica pode caracterizar a média e as respostas mecânicas locais. Para uma explicação detalhada do método, os leitores são encorajados a ver o livro de Sutton 22.
Para obter campos de deformação na superfície da amostra, uma técnica de correlação de imagem digital bidimensional (2D-DIC) pode ser usado. Em suma, as imagens da amostra são capturados em estados carregados e descarregados diversos. A primeira imagem é dividida em pequenos quadrados chamados subconjuntos (M × M) pixels que formam uma malha para posterior cálculoCampos de deformação 2D. A posição de cada quadrado na amostra deformadas é obtida utilizando um algoritmo de imagem correspondente. O movimento de cada quadrado é, em seguida, rastreados, imagem-a-imagem, produzindo campos de deslocamento que podem então ser utilizadas para derivar estirpes de gradientes de deformação e através de uma variedade de métodos, incluindo interpolação polinomial da montagem ou elemento finito. No presente manuscrito, nós fornecemos uma metodologia detalhada para avaliação dos campos de tensão de superfície em tecidos vasculares nativas por meio da integração de testes de tração uniaxial e 2D-DIC.
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Protocol
NOTA: Os procedimentos descritos abaixo foram realizadas como parte de um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional da Universidade da Carolina do Sul, em Columbia, Carolina do Sul.
1. Tissue Aquisição e Dissection
- Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas anteriores a dissecção dos tecidos. Autoclave tesouras cirúrgicas finas e fórceps convencionais, bem como lâminas cirúrgicas sob pressão de 15 psi e temperatura de 121 ° C durante 15 min.
- Adquirir um conjunto de suíno fresca (7 meses de idade machos da raça Landrace, 60-70 kg) rins com aorta intacta de um matadouro local. Tecido de transporte de volta para o laboratório em solução gelada a 1% de tampão fosfato salino (PBS).
- Imediatamente após a chegada, isolar a aorta abdominal de tecido circundante usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça.
- Lavou-se a recipiente de três vezes, utilizando uma seringa de 50 ml cheia com PBS (pH 7,2). Usando a tesoura e pinça, retire o máximo de tecido perivascular como possvel, sem comprometer a integridade da amostra.
- Verticalmente posicionar uma lâmina afiada para a parte do meio da embarcação e certifique-se que é perpendicular ao eixo longitudinal do vaso. Criar duas amostras de anéis, cada um com uma largura de aproximadamente 20 milímetros, aplicando três cortes circunferenciais sequenciais com a lâmina de barbear.
- Verticalmente posicionar uma lâmina de barbear afiada para uma amostra de anel de tal modo que a lâmina está orientada na direcção radial. Aplicar uma força aguda, para se obter um corte radial, o que resulta em uma amostra em forma de tira para o teste mecânico uniaxial. Colocar a amostra em uma placa de Petri de 100 milímetros de vidro e submergir em PBS até que o aplicativo de manchas da superfície. Repita o procedimento para a segunda amostra anel.
2. Criação de Superfície Speckle Pattern
- Conecte o airbrush com a válvula de pressão.
- Ajustar o diâmetro do bocal do aerógrafo para produzir manchas de 60-100 mm (intervalo adequado para o diâmetro do bocal deveser determinada a partir de estudos preliminares).
- Despeje aproximadamente 2 ml de corante marcação tecido preto no alimentador de gravidade do airbrush.
- Coloque o airbrush aproximadamente 0,5 m de distância da amostra.
- Retirar a amostra a partir da placa de Petri. Spray de corante marcação tecido na superfície íntima da amostra durante aproximadamente 5 segundos sob uma pressão de pulverização de 100 psi. Repita três vezes para garantir que o padrão de manchas cobre uniformemente a superfície da amostra.
3. Desempenho de Experimentos
- Una cada extremidade da amostra a uma tira de plástico (1 cm de largura x 1 cm de comprimento x 0,5 cm de espessura), utilizando um adesivo de tecido. Colocar a amostra em uma placa de corte de tecidos. Posicione a amostra de tal forma que ela fique totalmente e medir suas dimensões, utilizando um paquímetro digital.
- Iniciado controles do sistema para testes mecânicos. No sistema controla tela inicial, selecione "Waveform" na barra de tarefas localizada na aba "Configuração".
- de Anúnciosapenas a posição do punho superior do aparelho de teste mecânico de -4 mm (4 mm de extensão em relação à posição inicial designado no sistema). Gentilmente garantir uma tira de plástico (em anexo ao modelo em 3.1) para o aperto superior do testador mecânica e permitir que a amostra para pendurar livremente. Utilizar o compasso digital para garantir que a distância entre a amostra e o aperto superior é menos do que 2 mm.
- Ajustar manualmente a posição do punho inferior de modo que a extremidade livre da amostra pode ser assegurado sem extensão. Suavemente fixar a tira de plástico ligado à extremidade livre da amostra para o aperto inferior do dispositivo de teste mecânico.
- Utilizar o compasso digital para garantir que a distância entre a amostra e o aperto inferior é menor do que 2 mm. Zerar o sistema de célula de carga. Medir o comprimento da amostra e usa-a como o comprimento de referência para o cálculo das tensões circunferenciais globais.
- Digite o protocolo de teste mecânico. O protocolo utilizado no tsua demonstração implica 4 ciclos de deslocamento uniaxial, que se estendem do comprimento da amostra por 18% a uma taxa de deslocamento de 0,01 mm / seg.
- Intermitentemente PBS pulverizar sobre a amostra ao longo do protocolo de teste restante para assegurar que ele permaneça hidratada.
- Monte o (câmera de 5 mega pixel, lente de 100 mm, tamanho do pixel de 3,49 mm) da câmera em um tripé que está posicionado 1,5 m do quadro de carga. Garantir a câmara ea superfície da amostra são perpendiculares ajustando a câmera para o menor campo disponível de profundidade e manipulando seu alinhamento de tal forma que todo o campo de visão está em foco.
- Abra o software de captura de imagem.
- Selecione "PGR-2" na opção "Selecione o sistema".
- Selecione o caminho do projeto para salvar as imagens a serem analisadas.
- Clique no ícone "Time Square" e especifique o intervalo de aquisição como 5 segundos.
- Ajuste a exposição, abertura numérica, eo foco da lente de modo a obter uma visão clara da amostra.
- Ajuste a posição do LED para fornecer iluminação adequada na amostra.
- Clique no ícone "Iniciar" no software de captura de imagem para obter uma imagem da superfície da amostra.
- Abra o software de análise de imagem.
- Importar a imagem obtida. Zoom sobre um salpico indivíduo, e, em seguida, contar o número de pixels dentro deste salpico individual.
Nota: Identificar um salpico preto representante. Definir o tamanho salpico como a distância linear entre os pixels em ambos os lados do salpico que têm valores elevados semelhantes. Para um tamanho de salpico aceitável, o número de pixels ao longo da largura de um salpico típica deve ser superior a 3 pixels. Para melhorar a resolução espacial nas medições, a maioria das manchas não deve ter mais do que 5-7 pixels ao longo da largura do salpico, sempre que possível. Assim, um salpico típico para este caso se situaria entre 10 um na menor e 23 mm na maior dimensão linear. Para determinar um subconjunto adequadotamanho, um subconjunto típico deve ter pelo menos 3 branco e 3 salpicos preto em toda a sua largura. Se um salpico típico é de 5 pixels de dimensão linear, em seguida, cada 31x31 subconjunto seria, pelo menos, 105 uM em dimensão linear. O espaçamento entre os centros de subconjunto deve ser de pelo menos 1/6 da dimensão linear. Assim, para um tamanho de 31x31 subconjunto, a distância é de 5 pixels, que representa 18 uM na distância linear. - Depois de verificar a qualidade da configuração de manchas, clique simultaneamente no ícone "Executar" no sistema e ícone "Iniciar" no software de captura de imagem para iniciar o teste.
- Capturar uma série de imagens em todo o teste usando a câmera e software de captura de imagem.
4. Procedimentos de limpeza após o experimento
- Colocar a amostra descartado em saco de risco biológico e fechar o saco. Ligue para o Departamento de Saúde Ambiental e Segurança (EHS) na Universidade da Carolina do Sul para o descarte adequado.
- Prepara-se uma fosfatossolução desinfetante livre com um rácio de 1:64 diluição de detergente desinfetante à água destilada. Mergulhe as ferramentas cirúrgicas nesta solução durante 20 min.
- Lave bem os itens descritos no ponto 4.2 com água destilada. Secam-se as ferramentas, utilizando uma toalha de papel e, em seguida, pulverizá-los com uma solução de etanol a 70%. Mais uma vez secar as ferramentas cirúrgicas usando uma toalha de papel e colocá-los de volta na caixa de ferramentas cirúrgico.
5. Análise de Imagem para medir o campo Strain local
- Abra o software de análise de imagem.
- Clique na guia "imagens de manchas", selecione todas as imagens que precisam ser analisados.
- Clique na ferramenta Retângulo e selecione a área de interesse na primeira imagem.
- Digite o tamanho subconjunto 41 × 41 pixels e tamanho do passo 5 pixels.
- Clique iniciar guia análise no software, selecione a interpolação como otimizado 8-trap; selecione o critério como diferenças ao quadrado normalizada de zero e pesos subconjunto de opções como Gaussian.
- Defina as opções de limite como padrão no software.
- Clique na guia sub pós-processamento em análise guia início. Clique na opção estirpe computação e deixar o tamanho do filtro e tipo de filtro como padrão no software. Escolha um tensor digite Lagrange.
- Selecione a guia dados e, em seguida, selecione qualquer imagem analisada para a visualização do campo de tensão de superfície.
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Representative Results
Os dados mecânicos adquiridos a partir de um teste de extensão uniaxial rampa no tecido vascular consiste de carga versus aplicados relações deslocamento amostra a uma dada taxa de deslocamento. Neste estudo, 2D-DIC em conjunto com o teste mecânico uniaxial é utilizado para medir os campos de deformação da superfície do espécime em direcções ortogonais em vários estados deformados. A natureza viscoelástica do tecido vascular é manifestada pela notável grau de histerese nas curvas de deslocamento de carga antes da pré-condicionamento mecânica. Para promover a reprodutibilidade dos ensaios mecânicos e obter uma resposta mecânica elástica, o tecido é pré-condicionada por meio de vários ciclos de carga e descarga, em que a histerese é diminuída gradualmente (Figura 1). Apesar da preparação de amostras extremamente cuidadoso e montagem, as medições 2D-DIC demonstrar que o campo de deformação da superfície da íntima resultante é altamente heterogênea, tanto no direcções circunf erencial e longitudinal. Como esperado, os valores de tensão circunferenciais locais aumentam com o deslocamento de amostra aplicada. Heterogeneidade na estirpe padrão circunferencial geralmente produz valores que são mais baixos, perto do centro da amostra em comparação com perto da interface da amostra-aperto, reflectindo os efeitos do aperto sobre as estirpes locais (Figura 2). Na direcção longitudinal, as estirpes de compressão não-uniformes resultantes na superfície da amostra da íntima são aumentadas quando a amostra é gradualmente alargada, e o campo de deformação resultante exibe um grau de heterogeneidade mais pronunciado quando comparado com a direcção circunferencial (Figura 3). Os coeficientes de variação (CV) dos campos de tensões superficiais em direcções ortogonais foram calculadas de modo a reflectir o grau de heterogeneidade no campo de estados experimentais escolha, e verificou-se diminuir com o aumento da extensão monotonicamente amostra (Tabela 1).
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Figura 1. pré-condicionamento Experimental de amostra de tecido vascular para testes de tração uniaxial. Uma amostra retangular é pré-condicionados com três ciclos de carga-descarga para obter uma resposta elástica reprodutível. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. campo de deformação circunferencial dentro da área de amostra de interesse. (A) Exemplo representativo de superfície da amostra íntima salpicado e área identificada de interesse. (B) local circunferencial aa ε tensão (%) dentro da área identificada de interesse a aumentarníveis de tensão aplicada circunferencial global (aumento de 1,6% para 9% para 18%, da esquerda para a direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. campo Longitudinal tensão dentro da área de amostra de interesse. (A) Exemplo representativo de superfície da amostra íntima salpicado e área identificada de interesse. (B) local longitudinal xx ε tensão (%) dentro da área identificada de juros a níveis crescentes de aplicar tensão circunferencial global (aumento de 1,6% para 9% para 18%, da esquerda para a direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Coeficientes de variação dos campos de deformação. Coeficientes de variação (CV) de amostra íntima campos de tensão de superfície em ambos circunferencial (aa ε) e longitudinal (xx ε) direções ao selecionar níveis de tensão aplicada circunferencial global.
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Discussion
Embora estudos anteriores tenham utilizado uma ampla gama de métodos de vídeo-monitoramento de corante para avaliar a amostra estirpe 18,20,21,23,24, o nosso objectivo presente é o de proporcionar uma metodologia abrangente para casal uniaxial de ensaio de tração com 2D-DIC para a avaliação do estirpes de superfície em amostras de tecidos vasculares. Com uma câmara de alta resolução e software de análise de imagem interna, o campo de tensão pode ser medida dentro de uma zona de superfície pré-determinada como a amostra sofre carregamento uniaxial. De particular relevância para a realização de ensaios mecânicos de tecido vascular, a técnica apresentada pode ser directamente adaptados para avaliar as estirpes em ensaios de superfície bi-axiais planares que por sua vez permitem a identificação de propriedades dos materiais constitutivos.
A fim de facilitar a análise de correlação de imagem digital, um padrão de manchas é aplicada à superfície da amostra. A tinta utilizada para salpicar é um corante de marcação de tecido que adere facilmente à maioria das superfícies dos tecidos moles. Para alcançar umaboa qualidade do contraste e da densidade adequada da configuração de manchas, um tamanho ideal salpico de 60-100 uM de pulverização e a distância de 0,5 m são realizados através do ajuste do diâmetro do bocal do spray e a distância entre a amostra e o spray. O tamanho salpico utilizada está diretamente relacionada com a resolução das medições resultantes 23,25. Cada salpico tem que ser recolhidos por meio de pelo menos 3-5 pixels para obter correlação de imagem aceitável. Dado um campo mm 22 milímetros × 18 de vista e do tamanho salpico utilizado, a resolução do experimento apresentado é de 9 mm / pixel.
Uma taxa de carga de 0,01 mm / seg é usada para testes mecânicos, de modo a obter uma série de estados de equilíbrio deformado quasi-estáticos para tecido vascular 26,27. Dado que a câmara e célula de carga de alta fidelidade são ambos extremamente sensível a vibrações, deve haver o mínimo de movimento durante a experiência; mesmo que pequeno, corpo rígido câmera / espécime movimento pode ocorrer e wmedições 2D-DIC-base doente confundir. Do mesmo modo, a deformação da amostra pode ocorrer devido à desidratação do tecido, portanto, é importante que o PBS é aplicada por meio de testes para promover a precisão de 2D-DIC.
Para 2D-DIC, especificações exigidas incluem o tamanho subconjunto e o tamanho do passo utilizado no algoritmo de imagem correspondente 22. A fim de obter resultados precisos com tendência insignificante, pelo menos, 3 preto e 3 manchas brancas devem estar presentes em cada subconjunto, com cada salpico recolhidos por meio de, pelo menos, 3-5 pixels. Cada ponto de dados na saída fornece informações sobre a média de uma caixa que corresponde ao tamanho do subconjunto (41x41 pixels), considerada como a resolução espacial do experimento. A distância entre dois pontos de dados em termos de tamanho do passo 5 é pixels nesta experiência. A fim de maximizar a precisão nas medições de deformação deslocamento salpico / superficiais, um método de interpolação de spline 8-tap é aplicado para obter valores de intensidade de precisos, sub-pixels. A metanfetamina 8-tapod tem um pouco maior precisão na obtenção de linhagens quando comparados aos resultados obtidos usando um 4-tap-tap ou 6 filtro de interpolação. O critério de correlação "normalizado" diferenças ao quadrado foi selecionado para a harmonização, uma vez que não é afectada por uma alteração na escala de iluminação (por exemplo, quando um subconjunto deformado é 30% mais brilhante do que o de referência). Esta escolha é a seleção padrão no software e, geralmente, oferece a melhor combinação de flexibilidade e resultados 28. Subconjunto de ponderação, que controla como os pixels dentro do subconjunto são ponderados no processo de correspondência, é selecionada como Gaussian. Com pesos uniformes, cada pixel dentro do subconjunto é considerado igualmente; Pesos Gaussianos proporcionar a melhor combinação de resolução espacial e resolução de deslocamento.
Coeficientes de variação do campo de tensão superficial foram calculados com o software de análise de imagem em casa e usado para quantificar o grau de heterogeneidade estirpe. O coeficienteficiente de variação do campo de deformação em ambas as direcções longitudinais e circunferenciais com o aumento da deformação diminuiu circunferencial global, o que foi anteriormente observado em testes mecânicos análogos em outros tipos de tecidos vasculares (resultados não publicados). Com base nesta tendência persistente, é razoável esperar que os campos de deformação da superfície pode homogeneizar suficientemente acima de um certo grau crítico de extensão tais que as medições globais e locais convergem. No entanto, é provável que este valor crítico é para tecidos e específicos de amostra, suportando, assim, a utilização de medições da deformação local para uma identificação precisa das propriedades dos materiais constitutivos.
Várias limitações devem ser consideradas para a interpretação adequada da nossa metodologia e os resultados apresentados. Nós prescrita uma gama moderada de tensão circunferencial global, assim as nossas magnitudes de tensão locais realizadas em ambos as direções circunferenciais e longitudinais foram significativamente menores do que os valores observados in vivo. Além disso, foi avaliada a resposta mecânica uniaxial sob uma única orientação da amostra, e, portanto, gerar dados suficientes para identificar as propriedades dos materiais constitutivos para o tecido vascular 29,30. No entanto, o nosso objectivo não é realizar uma análise abrangente mecânica da aorta porcina, mas sim para demonstrar um protocolo experimental para casal 2D-DIC a um teste mecânico uniaxial em tecidos moles. A técnica aqui apresentada pode ser prontamente alargado para testes mecânicos biaxial e, assim, a quantificação das propriedades mecânicas constitutivas de tecidos vasculares 31-33. O método 2D-DIC só capta um campo de deformação planar correspondente a superfície da amostra. Quando a amostra deforma-se para fora do plano, ou quando a amostra é uma geometria não planar (por exemplo, vasos sanguíneos), a imagem estéreo-visão e uma técnica de 3D-DIC pode ser aplicado para a medição da deformação global 23,25.
nt "> Em resumo, o presente manuscrito fornece informações detalhadas sobre a metodologia para integrar testes de tração uniaxial e correlação de imagem digital para caracterizar a resposta mecânica do tecido vascular nativa. O método apresentado neste estudo pode ser facilmente adaptado para a caracterização mecânica de outro nativo e engenharia de tecidos moles, bem como hidrogel macia / materiais poliméricos, e é particularmente útil quando o campo amostra superfície estirpe apresenta uma heterogeneidade significativa durante o teste mecânico.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse potenciais.
Acknowledgments
O software e suporte técnico foram cortesia de Correlated Solutions Incorporated (www.correlatedsolutions.com).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Uniaxial tensile mechanical tester | Enduratec | 3230 AT/HR | |
| Blue tissue marking dye | http://www.ebay.com/itm/Tissue-Marking-Dye-in-Bottles-2oz-Bottle-1-ea-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696 | ||
| Sprayer | Anest-iwata | CM-B | Custom Micron B |
| Camera | Point Grey | GS2-GE-50S5M-C | |
| Lens | Tokina | AT-X M100 | |
| Vascular tissue | Caughman Inc | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection PBS | BAXTER HEALTHCARE CORP. | ||
| Vic_snap | Correlated Solutions | ||
| Vic_2D | Correlated Solutions | ||
| Wintest 4.1 | Bose ElectroForce | ||
| Tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| Disinfectant | Fisher Scientific | 04-355-13 | Decon BDD Bacdown Detergent Disinfectant |
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