Aqui, um protocolo é apresentada para identificar cinesina-1 cargas. Um mutante motorless da cinesina-1 de cadeia pesada (KIF5B) agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas. Ambos os agregados são detectados por microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser empregue para identificar cargas de outras proteínas do motor.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Cinesina-1 é uma proteína que medeia o transporte de motor anterógrada das suas cargas 1,2. É um heterotetrâmero das duas subunidades de cadeia leve cinesina 1 (KLC1) e duas subunidades de Cadeias Pesadas cinesina (KHCs). KIF5B 1, um KHC, contém um domínio de motor na sua extremidade N-terminal, que hidrolisa ATP e converte a energia química em energia mecânica para o movimento ao longo dos microtúbulos. A sua região C-terminal contém o domínio de dimerização que interage com KLC1, que se associa com cargas. Cinesina-1 transporta cargas, tais como vesículas e organelas, mRNAs 3,4. Recentemente, foi mostrado KIF5B para transportar o factor de transcrição nuclear de C-MYC para a degradação no citoplasma proteossomal 5. Três metodologias (inibidor químico, siRNA / shRNA e mutantes dominante negativo) foram utilizados para inibir cinesina-1 função. Todos eles induzida agregação de c-myc no citoplasma. Para o último método, c-myc só foi afectada pela negat dominanteive mutante de KIF5B, mas não pela de uma outra proteína relacionada KIF5A do motor, o que sugere que o mutante não exerce efeitos gerais sobre os componentes intracelulares (tais como perturbação de microtúbulos) ou sobre a agregação de proteína. O mutante negativo dominante de KIF5B também não afectou outro factor de transcrição, sugerindo que não exercem efeitos gerais de factores de transcrição. Em vez disso, ele sugere que o mutante negativo dominante exerce efeitos específicos sobre suas cargas.
A utilização de mutantes negativos dominantes é comum no campo das proteínas de motor. Similar mutantes sem motor de kinesins e myosins foram usadas anteriormente. Eles foram principalmente utilizados para demonstrar os efeitos dos mutantes nas localizações subcelulares das suas cargas ou sobre funções celulares 6-12. Menos ênfase foi colocada sobre a relação espacial entre os mutantes e as cargas afetadas por eles. No entanto, em alguns incidências, os mutantes foram observados para co-localizar com a sua cargos 6,10.
A interacção entre KIF5B e suas proteínas associadas foi anteriormente confirmado pela levedura em ensaio in vivo de dois hridos e ensaios de pull-down bioquímicos, tais como co-imunoprecipitação e ensaios in vitro suspensos 13-16. Neste artigo, usando um método de microscopia de fluorescência visual adicional é descrito para identificar proteínas de carga KIF5B. O método faz uso de um mutante KIF5B motorless que actua como um mutante negativo dominante. Ele agrega no citoplasma e induz a agregação de suas cargas.
A marcação de tipo selvagem e mutante KIF5B motorless com a proteína fluorescente tdTomato 17 permite a sua visualização por microscopia de fluorescência. As proteínas marcadas KIF5B pode ser co-expressa com uma proteína candidata fundido com uma proteína fluorescente diferente com propriedades espectrais adequadamente separados a partir da etiqueta KIF5B. As proteínas marcadas são observados directamente em células vivassob microscopia de fluorescência. A indução da agregação da proteína candidata por o mutante KIF5B motorless confirmará que a proteína candidata é uma carga in vivo de KIF5B. Além disso, as proteínas marcadas com KIF5B tdTomato pode ser expressa por si só nas células de estudar os seus efeitos sobre as proteínas endógenas da carga. Mais tarde, a microscopia de imunofluorescência é conduzida em que as células transf ectadas são fixadas e coradas com um anticorpo específico contra a proteína endógena candidato, seguido por um anticorpo secundário apropriado conjugado com um corante fluorescente. Neste caso, o candidato de proteína endógena no seu nível fisiológico é estudada. Similar mutantes sem motor de outras proteínas do motor podem estar preparados para identificar as suas cargas.
O método descrito utiliza as propriedades do mutante KIF5B motorless, que não tem a capacidade para se mover ao longo dos microtúbulos, mas mantém a capacidade de formar dímeros com o tipo selvagem KIF5B e, desse modo, permitir que a proteína tetramérica para interagir com as mesmas proteínas de carga como o de tipo selvagem KIF5B. KIF5B motorless, portanto, atua como um mutante negativo dominante e formas mislocalized agrega com suas cargas. Este método é comprovado para identificar a cinesina-1 de carga de c-myc (Figura 1) 5. Neste artigo, o mesmo mutante KIF5B motorless foi usada para identificar a p53 como uma outra carga potencial de cinesina-1 (Figura 2). Isto demonstra que a metodologia é possível identificar outras cargas de cinesina-1. Além disso, a especificidade do mutante é fornecido pela falta de efeito do mutante na proteína de controlo negativo c-Fos (figura 3).
Neste protocolo, o tdTomato-marcado wild-tyPE ou proteína KIF5B motorless é co-expressa com outra proteína carga candidato marcado com proteína fluorescente. Neste caso, a microscopia de fluorescência de células vivas e imagens são executadas. A formação dos agregados pode ser rastreada por imagem time-lapse. Alternativamente, a proteína marcada com tdTomato é expressa por si só e a proteína candidata carga nos seus níveis fisiológicos são visualizados por microscopia de imunofluorescência indirecta utilizando anticorpos específicos. O tdTomato proteína fluorescente é escolhido para o seu brilho e fotoestabilidade 17. Se o fundo é elevado, devido à auto-fluorescência do meio DMEM completo, o meio sem vermelho de fenol é usada.
O mutante KIF5B motorless forma dímeros com o tipo selvagem KIF5B estequiometricamente. Portanto, é crítica para expressar a quantidade suficiente de mutante KIF5B motorless para formar dímeros com o homólogo do tipo selvagem para inibir a sua função e para formar agregados. Para abordar esta questão, otimização de exprESSÃO do mutante motorless é essencial. Isso é conseguido através de um pequeno motorless mutante contendo o domínio de dimerização. Além disso, a optimização da transfecção do reagente apropriado e o protocolo é também necessária. A duração da incubação das células HeLa com o reagente de ADN / transf ecção foi optimizada em células HeLa para a expressão de proteínas exógenas e a viabilidade celular. A duração da incubação pode ter que ser optimizado para outras linhas de células.
Para ampliações entre 4X para 40X, não usa óculos de cobertura são necessários. As células podem ser examinadas directamente nos poços. Portanto, neste caso, o protocolo é barato e conveniente. Para ampliações acima de 40X, as células são cultivadas em vidros de cobertura nos poços e, após coloração, são montadas em lâminas de microscópio para exame no âmbito dos objectivos de imersão em óleo.
Observação de agregados da proteína KIF5B motorless é limitado pelo tamanho do citoplasma. É fácil de detectar oagregados em muitas células de mamíferos. No entanto, é relativamente difícil de observar os agregados de células neuronais, quando o volume do citoplasma é pequena em torno dos núcleos e em neurites.
O protocolo é utilizado para mostrar a associação entre KIF5B e as suas cargas, para além do in vivo de levedura de dois híbridos e bioquímicos ensaios suspensos 13-16. Todos estes ensaios determinar a associação sob diferentes condições físicas e seus resultados podem complementar-se mutuamente. Além disso, a vantagem de este ensaio de fluorescência em relação a outros ensaios é que ele pode mostrar a regulação da localização subcelular das cargas por KIF5B (Figuras 1 e 2).
O protocolo não está limitado a KIF5B e pode ser usado para identificar outras proteínas de cargas do motor, tais como alguns outros motores de cinesina 3 e alguns dos motores de miosina 23,24 utilizadas no transporte intracelular de 3 cargas. Estas proteínas do motor também contêm domínios de motor para o movimento ao longo dos microtúbulos para motores cinesina e microfilamentos para motores de miosina e segmentos em espiral espiralada para oligomerização. A maioria deles formar homodímeros 3,23. Portanto, uma estratégia semelhante pode ser aplicada a elas, criando seus mutantes dominantes negativos sem motor para identificar as suas cargas.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |