Здесь, протокол представлен для идентификации Кинезин-1 грузов. Безмоторных мутант тяжелой цепи Кинезин-1 (KIF5B) агрегирует в цитоплазме и индуцирует агрегацию его грузов. Оба агрегаты обнаруживаются при флуоресцентной микроскопии. Аналогичный подход может быть использован для идентификации грузов других моторных белков.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Кинезин-1 представляет собой белок двигатель, который опосредует транспорт антероградную своих грузов 1,2. Это гетеротетрамер из двух субъединиц Кинезин легкой цепи 1 (KLC1) и двух субъединиц Кинезин тяжелых цепей (KHCs). KIF5B 1, а KHC, содержит домен электродвигателя с его N-терминала, который гидролизует АТФ и преобразует химическую энергию в механическую энергию для движения вдоль микротрубочек. Его С-концевая область содержит домен димеризации, который взаимодействует с KLC1, который связывает с грузами. Кинезин-1 транспортирует грузы, такие как пузырьки, органелл и мРНК 3,4. Недавно было показано, KIF5B транспортировать ядерного фактора транскрипции с-Мус для Протеосомальная деградации в цитоплазме 5. Были использованы три методики (химическая ингибитор, миРНК / shRNA и доминантно-негативный мутант) ингибировать Кинезин-1 функцию. Они все индуцированной агрегации с-Мус в цитоплазме. За последние методологии, с-Мус был затронут только доминирующей negatив мутант KIF5B, но не с тем, что из другой смежной KIF5A двигателя белка, предполагая, что мутант не оказывает общее воздействие на внутриклеточные компоненты (например, нарушения микротрубочек) или агрегации белка. Доминантно-негативный мутант KIF5B также не влияет другой фактор транскрипции, предполагая, что это не оказывает влияния на общие факторы транскрипции. Скорее всего, это говорит о том, что доминантно-негативный мутант оказывает специфическое воздействие на ее грузов.
Применение доминантных негативных мутантов распространен в области моторных белков. Похожие безмоторные мутанты кинезинов и миозинов ранее использовались. Они были в основном используется для демонстрации влияния мутантов на субклеточных локализаций их грузов или на клеточных функций 6-12. Меньше внимания уделялось пространственной взаимосвязи между мутантами и грузов, пострадавших от них. Тем не менее, в некоторых инцидентов, наблюдались мутанты со-локализуется с их саrgos 6,10.
Взаимодействие между KIF5B и связанных с ним белков была ранее подтверждена дрожжей в естественных условиях дигибридная анализа и биохимические выпадающие анализов, таких как совместное иммунопреципитации и в пробирке раскрывающихся анализов 13-16. В этой статье, дополнительный визуальный метод с использованием флуоресцентной микроскопии описана для идентификации KIF5B грузовых белков. Метод дает использование безмоторных KIF5B мутанта, который действует как доминантный негативный мутант. Это агрегаты в цитоплазме и индуцирует агрегацию его грузов.
Мечение дикого типа и безмоторных KIF5B мутанта с флуоресцентным белком tdTomato 17 позволяет их визуализацию с помощью флуоресцентной микроскопии. Маркированные KIF5B белки могут быть совместно выражены с белок-кандидат, слитого с другом флуоресцентного белка с спектральными свойствами соответствующим отделенных от KIF5B тега. Помеченные белки наблюдаются непосредственно в живых клеткахпод флуоресцентной микроскопии. Индукционная агрегации белка кандидата по безмоторных KIF5B мутанта подтвердит, что кандидат белок представляет собой грузов в естественных условиях KIF5B. Кроме того, tdTomato-меченных белков KIF5B может быть выражено в покое в клетках для изучения их воздействия на эндогенных грузовых белков. Позже, иммунофлюоресценции микроскопии проводится в котором трансфицированные клетки фиксировали и окрашивали специфическим антителом против эндогенного белка-кандидата с последующим соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентным красителем. В этом случае, эндогенный белок-кандидат на ее физиологическом уровне изучена. Похожие безмоторные мутанты других моторных белков могут быть получены в целях выявления их грузов.
Описанный способ использует свойства безмоторных KIF5B мутанта, в котором отсутствует способность двигаться вдоль микротрубочек, но сохраняет способность образовывать димеры с дикого типа KIF5B и, тем самым, позволит Тетрамерная белок взаимодействовать с теми же грузовых белков как дикого типа KIF5B. Безмоторных KIF5B, следовательно, выступает в качестве доминантной негативной мутанта и форм mislocalized агрегатах с ее грузов. Этот метод доказал, чтобы определить Кинезин-1 грузовой с-Мус (рисунок 1) 5. В этой статье, то же самое безмоторных KIF5B мутант был использован для идентификации р53 в качестве еще одного потенциального грузом Kinesin-1 (рисунок 2). Это показывает, что технология целесообразной для выявления других грузов из Kinesin-1. Кроме того, специфичность мутанта обеспечивается отсутствием эффекта мутанта на отрицательном контрольного белка с-Fos (рисунок 3).
В этом протоколе, tdTomato-меченый дикого тиПЭ или безмоторных белок KIF5B является коэкспрессируются с другим флуоресцентным белком-меченый кандидат грузового белка. В этом случае, живых клеток флуоресцентной микроскопии и визуализации выполняются. Образование агрегатов можно проследить покадровой обработки. Альтернативно, tdTomato-меченый белок экспрессируется в покое и белок грузов кандидат на своих физиологических уровней визуализируется путем косвенного иммунофлуоресцентного микроскопии с использованием специфических антител. Флуоресцентный белок tdTomato выбран за его яркости и светостойкости 17. Если фон достаточно высок из автофлуоресценции части полной среде DMEM, используется среда без фенола красного.
Безмоторных KIF5B мутантных форм димеры с дикого типа KIF5B стехиометрически. Поэтому крайне важно, чтобы выразить достаточное количество безмоторных KIF5B мутанта с образованием димеров с дикого типа аналога ингибировать свою функцию и образовывать агрегаты. Чтобы решить эту проблему, оптимизацию выражession из безмоторных мутанта является существенным. Это достигается с помощью небольшого безмоторных мутант, содержащий домен димеризации. Кроме того, оптимизация соответствующей трансфекции реагента и протокола также необходим. Продолжительность инкубации клеток HeLa с реагентом ДНК / трансфекции оптимизировали в клетках HeLa для экспрессии экзогенных белков и жизнеспособности клеток. Продолжительность инкубации может должны быть оптимизированы для других клеточных линий.
Для увеличениях между 4х до 40х, никаких покровные стекла не требуется. Клетки могут быть непосредственно рассмотрены в лунках. Следовательно, в этом случае протокол является недорогой и удобной. Для увеличениях выше 40Х, клетки выращивают на покровных стекол в скважинах и после окрашивания, смонтированы на предметных стеклах для исследования под целей масло погружения.
Наблюдение агрегатов безмоторных белка KIF5B ограничена размером цитоплазме. Нетрудно обнаружитьагрегаты во многих клетках млекопитающих. Тем не менее, это относительно трудно наблюдать агрегаты в нейрональных клетках, когда объем цитоплазмы невелик вокруг ядер и в невритов.
Протокол используется, чтобы показать связь между KIF5B и ее грузов в дополнение к в естественных дрожжей двух гибридных и биохимических раскрывающихся анализов 13-16. Все эти анализы определения связи при различных физических условиях и их результаты могут дополнять друг друга. Кроме того, преимуществом этого флуоресценции анализа над другим анализам, что он может показать регуляцию внутриклеточной локализации грузов по KIF5B (фиг.1 и 2).
Протокол не ограничивается KIF5B и может быть использован для идентификации грузов других моторных белков, таких как некоторые другие кинезиновых двигателей 3 и некоторые из миозина двигателей 23,24 используемых в внутриклеточного транспорта грузов 3, Эти моторные белки также содержат двигательные домены для движения вдоль микротрубочек для кинезиновых двигателей и микрофиламентов для миозина двигателей и сегментов биспиральных для олигомеризации. Большинство из них образуют гомодимеры 3,23. Поэтому, аналогичную стратегию можно применить к ним посредством создания их безмоторных доминантных негативных мутантов, чтобы определить их грузов.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |