Her blir en protokoll presentert for å identifisere kinesin-1 last. En motorless mutant av kinesin-en tung kjede (KIF5B) aggregater i cytoplasma og induserer aggregering av sine laster. Begge aggregatene blir oppdaget etter fluorescens mikroskopi. En lignende strategi kan bli anvendt for å identifisere laster med andre motor proteiner.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 er en motor protein som medierer antero transport av dens last 1,2. Det er en heterotetramer av de to subenheter av kinesin Lys Chain 1 (KLC1) og to subenheter av kinesin tunge kjeder (KHCs). KIF5B 1, en KHC, inneholder en motor domene ved dets N-terminal, som hydrolyserer ATP og omdanner kjemisk energi til mekanisk energi for bevegelse langs mikrotubuli. Dens C-terminal regionen inneholder dimerization domene som samhandler med KLC1, som assosierer med last. Kinesin-1 transporterer last som blemmer, organeller og mRNA 3,4. Nylig KIF5B ble vist å transportere atomtranskripsjonsfaktor c-MYC for proteosomal nedbrytning i cytoplasma 5. Tre metoder (kjemisk inhibitor, siRNA / shRNA og dominant negativ mutant) ble anvendt for å hemme kinesin-1 funksjon. De induserte aggregasjon av c-myc i cytoplasma. For den siste metoden, ble c-MYC bare påvirket av den dominerende negative mutant av KIF5B, men ikke ved den annen beslektet KIF5A motor protein, noe som tyder på at det mutante ikke utøver generelle effekter på de intracellulære komponentene (som mikrotubul avbrudd) eller på proteinaggregering. Den dominant negativ mutant av KIF5B heller ikke påvirke en annen transkripsjonsfaktor, noe som tyder på at det ikke utøver generelle effekter for transkripsjonsfaktorer. Snarere tyder det på at den dominerende negative mutant utøver spesifikke effekter på sine laster.
Bruken av dominerende negative mutanter som er vanlig på området motor proteiner. Lignende motorless mutanter av kinesins og myosins ble brukt tidligere. De ble i hovedsak brukt til å demonstrere effekten av mutanter på subcellulære lokaliseringer av sine laster eller om cellulære funksjoner 6-12. Mindre vekt ble lagt på romlige forholdet mellom mutanter og last påvirket av dem. Men i noen tilfeller, ble mutantene observert å co-lokalisere med sine cargos 6,10.
Samspillet mellom KIF5B og dens tilknyttede proteiner som tidligere ble bekreftet ved in vivo-gjær to-hybrid-analyse og biokjemiske pull-down-analyser slik som co-immunoutfelling og in vitro-pull-down-analyser 13-16. I denne artikkelen er en visuell metode med fluorescens mikroskopi beskrevet å identifisere KIF5B cargoproteiner. Fremgangsmåten gjør bruk av en motorless KIF5B mutant som fungerer som en dominant negativ mutant. Den samler i cytoplasma og induserer aggregering av sine laster.
Merking av villtype og motorless KIF5B mutant med fluorescerende protein tdTomato 17 gjør sin visualisering av fluorescens mikroskopi. De merkede KIF5B proteiner kan være co-uttrykkes med en kandidat protein smeltet til en annen fluorescerende protein med spektrale egenskaper passende skilt fra KIF5B tag. De merkede proteiner er observert direkte i levende cellerhenhold fluorescens mikroskopi. Induksjon av aggregering av kandidaten protein av motorless KIF5B mutant vil bekrefte at kandidaten protein er en in vivo last med KIF5B. Videre kan tdTomato-merkede KIF5B proteinene uttrykkes alene i cellene for å studere deres virkninger på de endogene cargoproteiner. Senere blir immunofluorescens-mikroskopi gjennomført hvor de transfekterte cellene blir fiksert og farget med et spesifikt antistoff mot endogene kandidatprotein, etterfulgt av et passende sekundært antistoff konjugert til et fluorescerende fargestoff. I dette tilfellet er den endogene kandidaten proteinet ved dens fysiologisk nivå studert. Lignende motorless mutanter av andre motorproteiner kan være forberedt på å identifisere sine laster.
Den metode som er beskrevet utnytter egenskapene til motorless KIF5B mutant som mangler evnen til å bevege seg langs mikrotubuli, men har beholdt evnen til å danne dimerer med vill-type KIF5B og derved tillate det tetramere protein til å samhandle med de samme cargoproteiner som villtype KIF5B. Motorless KIF5B derfor virker som en dominant negativ mutant og danner mislocalized aggregater med dets last. Denne metoden har vist seg å identifisere den kinesin-en last c-MYC (figur 1) 5. I denne artikkelen ble den samme motorless KIF5B mutant som brukes til å identifisere p53 som en annen potensiell last av kinesin-1 (figur 2). Dette viser at metoden er mulig å identifisere andre laster av kinesin-1. Videre blir spesifisiteten av mutant gitt ved mangel på virkning av mutanten på den negative kontroll proteinet c-Fos (figur 3).
I denne protokollen, tdTomato-merket vill-type eller motorless KIF5B protein koekspresjon med en annen fluorescerende protein-merket kandidat last protein. I dette tilfelle blir levende celle fluorescens mikroskopi og avbildning utført. Dannelsen av aggregatene kan spores ved time-lapse imaging. Alternativt blir tdTomato-merkede protein uttrykt alene og kandidat lasten proteinet ved dets fysiologiske nivåer er anskueliggjort ved indirekte immunfluorescens-mikroskopi ved hjelp av spesifikke antistoffer. Den fluorescerende protein tdTomato er valgt for sin lysstyrke og fotostabilitet 17. Hvis bakgrunnen er høy på grunn av auto-fluorescens av hele DMEM medium, er medium uten fenol rødt brukt.
Den motorless KIF5B mutant danner dimerer med villtype KIF5B støkiometrisk. Derfor er det viktig å uttrykke tilstrekkelig mengde av motorless KIF5B mutant for å danne dimerer med villtype-motstykke for å hemme dets funksjon og å danne aggregater. For å løse dette problemet, optimalisering av expression av motorless mutant er avgjørende. Det oppnås ved hjelp av en liten motorless-mutant inneholdende det dimeriseringen domene. I tillegg, optimalisering av det passende reagens transfeksjon og protokollen er også nødvendig. Varigheten av inkubasjon av HeLa-celler med DNA / transfeksjon reagens ble optimalisert i HeLa-celler for ekspresjon av eksogene proteiner og cellelevedyktighet. Inkubasjonen varighet kan måtte bli optimalisert for andre cellelinjer.
For forstørrelser mellom 4X til 40X, ingen dekkglass nødvendig. Celler kan være direkte undersøkt i brønnene. Derfor, i dette tilfellet, er protokollen billig og praktisk. For forstørrelser over 40X, blir cellene dyrket på dekkglass i brønnene, og etter farging, er montert på objektglass for undersøkelse under olje-immersion mål.
Observasjon av aggregater av motorless KIF5B proteinet er begrenset av størrelsen av cytoplasma. Det er lett å detektereaggregater i mange pattedyrceller. Imidlertid er det relativt vanskelig å observere aggregatene i neuronale celler når volumet av cytoplasma er liten rundt kjernene og i neuritter.
Protokollen som anvendes for å vise sammenhengen mellom KIF5B og dens last i tillegg til in vivo gjær to-hybrid og biokjemiske pull-down-analyser 13-16. Alle disse analysene bestemme foreningen under ulike fysiske forhold og deres resultater kan utfylle hverandre. Videre er fordelen med denne fluorescens-analyse i forhold til andre analyser er at det kan vises til regulering av subcellulære lokalisering av last ved KIF5B (Figur 1 og 2).
Protokollen er ikke begrenset til KIF5B og kan brukes til å identifisere laster med andre motorproteiner, så som noen andre kinesin motorer 3 og noen av myosin motorer 23,24 som brukes i intracellulær transport av last 3. Disse motor proteiner inneholder også motor domener for bevegelse langs mikrotubuli for kinesin motorer og microfilaments for myosin motorer og coiled-spole segmenter for oligomeriseringsprosessen. De fleste av dem danner homodimerer 3,23. Derfor kan en lignende strategi brukes på dem ved å lage sine motorless dominerende negative mutanter å identifisere sine laster.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |