כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 הוא חלבון מנוע שמתווך תחבורת האנטרוגרד של המטענים שלה 1,2. זהו heterotetramer של שתי יחידות המשנה של Kinesin אור שרשרת 1 (KLC1) ושתי יחידות משנה של שרשרות כבדות Kinesin (KHCs). KIF5B 1, KHC, מכיל תחום רכב בבית שלה N-terminal, אשר hydrolyzes ATP ו ממיר את האנרגיה הכימית לאנרגיה מכנית לתנועה לאורך microtubules. באזור C-terminal שלה מכיל את תחום dimerization כי אינטראקציה עם KLC1, אשר מקשר עם מטענים. Kinesin-1 משלוחי מטענים כגון שלפוחית, אברונים mRNAs 3,4. לאחרונה, KIF5B הוצגה להובלת גורם שעתוק גרעיני c-myc השפלה proteosomal בציטופלסמה 5. שלוש מתודולוגיות (מעכב כימי, siRNA / shRNA ו מוטציה שלילית דומיננטית) שמשו לעכב פונקצית Kinesin-1. כולם המושרה צבירה של c-myc בציטופלסמה. לחישוב על פי השיטה האחרון, c-myc הושפע רק על ידי negat הדומיננטיive מוטציה של KIF5B, אבל לא על ידי זה של חלבון אחר מנוע קשור KIF5A, הדבר המצביע כי המוטציה לא להשפעות כלליות על הרכיבים התאיים (כמו שיבוש microtubule) או על הצטברות חלבון. המוטציה השלילית הדומיננטית של KIF5B גם לא השפיעה גורם שעתוק אחר, דבר המצביע על כך זה לא להשפעות כלליות על גורמי שעתוק. במקום זאת, הוא טוען כי המוטציה השלילית הדומיננטית מפעילה השפעות ספציפיות על המטענים שלה.
שימוש מוטציות שליליות דומיננטיות נפוץ בתחום חלבוני מנוע. מוטציות motorless דומה kinesins ו myosins שימשו בעבר. הם שימשו בעיקר כדי להדגים את ההשפעות של מוטציות על localizations subcellular של מטענים שלהם או על תפקודים תאיים 6-12. פחות דגש הושם על הקשר המרחבי בין מוטנטים המטענים המושפעים מהם. עם זאת, בכמה מקרים, המוטציות נצפו לשתף למקם עם ca שלהם6,10 rgos.
האינטראקציה בין KIF5B והחלבונים הקשורים אליו אושרה בעבר על ידי שמרי in vivo assay השני היברידי מבחני הנפתח ביוכימיות כגון שיתוף immunoprecipitation וב מבחני נפתח במבחנת 13-16. במאמר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשיטה חזותי נוסף מתואר לזהות חלבוני מטען KIF5B. השיטה עושה שימוש מוטצית KIF5B motorless שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית. גוגל מאגד בציטופלסמה ומשרת צבירה של המטענים שלה.
התיוג של wild-type ו מוטציה KIF5B motorless עם חלבון פלואורסצנטי tdTomato 17 מאפשרת הדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבוני KIF5B מתויגים יכולים להיות שותף הביע עם חלבון מועמד התמזג חלבון פלואורסצנטי שונה עם תכונות ספקטרליות מופרדות כראוי מתג KIF5B. החלבונים מתויגים הם נצפו ישירות בתאים חייםתחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אינדוקציה של אגרגציה של החלבונים המועמדים על ידי מוטצית KIF5B motorless תאשר כי חלבון המועמד הוא מטען in vivo של KIF5B. יתר על כן, חלבוני KIF5B מתויג tdTomato יכולים להתבטא לבד בתאים ללמוד והשפיעו על חלבוני מטען אנדוגני. מאוחר יותר, מיקרוסקופיה immunofluorescence מתנהלת שבו תאי transfected הם קבועים מוכתם נוגדן ספציפי נגד חלבון מועמד אנדוגני, ואחריו נוגדנים משני מתאימים מצומדות עם פלורסנט לצבוע. במקרה זה, חלבון מועמד אנדוגני ברמה הפיזיולוגית שלו נלמד. מוטציות motorless דומות חלבוני מנועים אחרים יכולות להיות מוכן לזהות המטענים שלהם.
השיטה המתוארת מנצלת את המאפיינים של מוטצית KIF5B motorless, אשר חסרה את היכולת לנוע לאורך microtubules, אך שומרת לעצמה את היכולת ליצור דימרים עם KIF5B wild-type, ובכך לאפשר את חלבון tetrameric לקיים אינטראקציה עם אותם חלבוני המטען כמו wild-type KIF5B. KIF5B Motorless, ולכן, משמש מוטציה וצורות שליליות דומיננטיות mislocalized אגרגטים עם המטענים שלה. שיטה זו מוכחת לזהות את המטען Kinesin-1 c-myc (איור 1) 5. במאמר זה, באותו מוטציה KIF5B motorless שימש לזיהוי p53 כעוד מטען הפוטנציאל של Kinesin-1 (איור 2). זה מראה כי המתודולוגיה אינו ריאלי לזהות מטענים אחרים של Kinesin-1. יתר על כן, את הספציפיות של המוטציה מסופקת על ידי חוסר ההשפעה של המוטציה על חלבון הבקרה השלילי c-Fos (איור 3).
בפרוטוקול זה, tdTomato מתויג-טאי ברPE או חלבון KIF5B motorless הוא coexpressed עם חלבון אחר מטען מועמד חלבון מתויג ניאון. במקרה זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי Live- תא הדמיה מבוצעים. ההיווצרות של אגרגטים ניתן לייחס ידי הדמית זמן לשגות. לחלופין, חלבון מתויג tdTomato מתבטא לבד ואת חלבון מטען המועמד ברמות הפיזיולוגיות שלה היא דמיינה ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עקיפה באמצעות נוגדנים ספציפיים. TdTomato חלבון פלואורסצנטי נבחר הבהירות שלה בצילום 17. אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש.
מוטצית KIF5B motorless יוצרת דימרים עם KIF5B wild-type stoichiometrically. לכן, חשוב להביע כמות מספקת של מוטצית KIF5B motorless ליצירת דימרים עם עמיתו wild-type כדי לעכב את התפקיד וכדי ליצור אגרגטים. כדי לטפל בבעיה זו, אופטימיזציה של expression של מוטציה motorless חיוני. זו מושג באמצעות מוטצית motorless קטנה המכילה את תחום dimerization. בנוסף, אופטימיזציה של מגיב ופרוטוקול transfection המתאימים גם הכרחית. משך הדגירה של תאים הלה עם מגיב DNA / transfection היה מותאם בתאים הלה לביטוי של חלבונים אקסוגני כדאיות התא. משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם במיוחד שורות תאים אחרות.
לקבלה בהגדלה בין 4X ל 40X, לא משקפי כיסוי נדרשים. תאים יכול להיבחן ישירות במי קידוחים. לכן, במקרה זה, הפרוטוקול הוא זול ונוח. לקבלה בהגדלה מעל 40X, תאים גדל על משקפי כיסוי הבארות, לאחר מכתים, הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ לבדיקה תחת מטרות-טבילת שמן.
תצפית של אגרגטים של חלבון KIF5B motorless היא מוגבלת על ידי גודל של הציטופלסמה. נקל לזהות אתאגרגטים בתאי יונקים רבים. עם זאת, הוא יחסית קשה להתבונן המצרפים בתאים עצביים כאשר היקף בציטופלסמה קטן סביב הגרעינים והן neurites.
הפרוטוקול משמש כדי להראות את הקשר בין KIF5B והמטענים שלה בנוסף שמרי in vivo השנייה היברידי מבחני נפתח ביוכימיים 13-16. כל אלה מבחני לקבוע את הקשר בתנאים פיזיים שונים ותוצאותיהם יכולים להשלים אחד את השני. יתר על כן, היתרון של assay הקרינה הזאת על מבחני אחרים היא שזה יכול להראות את הסדרת לוקליזציה subcellular של מטענים ידי KIF5B (איורים 1 ו -2).
הפרוטוקול אינו מוגבל KIF5B וניתן להשתמש בו כדי לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים, כגון כמה מנועי kinesin אחרים 3 וחלק מנועי השרירן 23,24 בשימוש בתחבורה תאית של מטענים 3. חלבונים המנועים אלה מכילים גם תחומי מנוע לתנועה לאורך microtubules עבור מנועי kinesin ו microfilaments עבור מנועי שרירן, ומגזרי סליל מפותלים עבור oligomerization. רובם יוצרים homodimers 3,23. לכן, אסטרטגיה דומה ניתן ליישם אותם על ידי יצירת המוטציות השליליות הדומיננטיות motorless שלהם לזהות המטענים שלהם.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |