इधर, एक प्रोटोकॉल kinesin-1 cargos की पहचान के लिए प्रस्तुत किया है। Kinesin -1 भारी श्रृंखला (KIF5B) के एक motorless उत्परिवर्ती कोशिका द्रव्य में समुच्चय और उसके cargos के एकत्रीकरण लाती है। दोनों समुच्चय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत पता चला रहे हैं। एक समान रणनीति अन्य मोटर प्रोटीन की पहचान करने के लिए cargos नियोजित किया जा सकता।
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 एक मोटर प्रोटीन है कि इसकी cargos 1,2 के अग्रगामी परिवहन मध्यस्थता करता है। यह kinesin प्रकाश श्रृंखला 1 (KLC1) और kinesin भारी जंजीरों की दो यूनिटों (KHCs) की दो यूनिटों की एक heterotetramer है। KIF5B 1, एक केएचसी, इसकी एन टर्मिनल, जो एटीपी hydrolyzes और सूक्ष्मनलिकाएं साथ आंदोलन के लिए यांत्रिक ऊर्जा को रासायनिक ऊर्जा धर्मान्तरित पर एक मोटर डोमेन होते हैं। इसका सी टर्मिनल क्षेत्र dimerization डोमेन कि KLC1, जो cargos के साथ सहयोगियों के साथ सूचना का आदान प्रदान होता है। Kinesin-1 ऐसे पुटिकाओं, अंगों और mRNAs 3,4 के रूप में cargos transports। हाल ही में, KIF5B कोशिका द्रव्य 5 में proteosomal गिरावट के लिए परमाणु प्रतिलेखन कारक सी-MYC परिवहन करने के लिए दिखाया गया था। तीन तरीके (रासायनिक अवरोध, siRNA / shRNA और प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती) को बाधित करने के लिए kinesin -1 समारोह इस्तेमाल किया गया। वे सभी कोशिका द्रव्य में सी-MYC के एकत्रीकरण प्रेरित किया। पिछले कार्यप्रणाली के लिए सी-MYC केवल प्रमुख negat से प्रभावित थाKIF5B के उत्परिवर्ती ive, लेकिन नहीं एक अन्य संबंधित KIF5A मोटर प्रोटीन की है कि द्वारा, सुझाव है कि उत्परिवर्ती जनरल (microtubule व्यवधान की तरह) intracellular घटकों पर प्रभाव या प्रोटीन एकत्रीकरण पर लागू नहीं होता है। KIF5B के प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती भी एक और प्रतिलेखन कारक प्रभावित नहीं किया है, सुझाव है कि यह प्रतिलेखन कारक पर सामान्य प्रभाव डालती नहीं है। दरअसल, यह पता चलता है कि प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती अपने cargos पर विशेष प्रभाव डाल रही है।
प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट का उपयोग मोटर प्रोटीन के क्षेत्र में आम है। kinesins और myosins की इसी motorless म्यूटेंट पहले से इस्तेमाल किया गया। वे मुख्य रूप से उनकी cargos के subcellular स्थानीयकरण पर या सेलुलर कार्यों 6-12 पर म्यूटेंट के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कम जोर म्यूटेंट और cargos उनके द्वारा प्रभावित बीच स्थानिक संबंधों पर रखा गया था। हालांकि, कुछ घटनाओं में, म्यूटेंट उनकी सीए के साथ सह स्थानीय बनाना मनाया गयाrgos 6,10।
KIF5B और उसके संबंधित प्रोटीन के बीच बातचीत के पहले इन विवो खमीर दो संकर परख और इस तरह के सह immunoprecipitation के रूप में और इन विट्रो पुल से नीचे assays 13-16 में जैव रासायनिक पुल से नीचे assays के द्वारा पुष्टि की गई। इस अनुच्छेद में, एक अतिरिक्त दृश्य विधि का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी KIF5B कार्गो प्रोटीन की पहचान करने में वर्णित है। विधि एक motorless KIF5B उत्परिवर्ती कि एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती के रूप में कार्य का उपयोग करता है। यह कोशिका द्रव्य में समुच्चय और उसके cargos के एकत्रीकरण लाती है।
जंगली प्रकार और tdTomato 17 फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ motorless KIF5B उत्परिवर्ती की टैगिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा उनके दृश्य सक्षम बनाता है। टैग किए गए KIF5B प्रोटीन एक उम्मीदवार प्रोटीन वर्णक्रमीय गुण को उपयुक्त KIF5B टैग से अलग के साथ एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए के साथ सह व्यक्त किया जा सकता है। टैग प्रोटीन जीवित कोशिकाओं में सीधे मनाया जाता हैप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत। Motorless KIF5B उत्परिवर्ती द्वारा उम्मीदवार प्रोटीन के एकत्रीकरण की प्रेरण की पुष्टि करेगा कि उम्मीदवार प्रोटीन KIF5B का इन विवो माल है। इसके अलावा, tdTomato टैग KIF5B प्रोटीन अंतर्जात कार्गो प्रोटीन पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए कोशिकाओं में अकेले व्यक्त किया जा सकता। बाद में, immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का आयोजन किया जाता है जिसमें ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं तय की और अंतर्जात उम्मीदवार प्रोटीन के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, एक फ्लोरोसेंट रंजक के साथ संयुग्मित एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया। इस मामले में, अपनी शारीरिक स्तर पर अंतर्जात उम्मीदवार प्रोटीन का अध्ययन किया जाता है। अन्य मोटर प्रोटीन की इसी motorless म्यूटेंट उनकी cargos की पहचान करने के लिए तैयार किया जा सकता है।
विधि वर्णित motorless KIF5B उत्परिवर्ती, जो सूक्ष्मनलिकाएं साथ स्थानांतरित करने की क्षमता का अभाव है के गुणों का इस्तेमाल करता है, लेकिन जंगली प्रकार KIF5B साथ dimers के लिए फार्म और, इस प्रकार की अनुमति ही कार्गो प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता को बरकरार रखे हुए tetrameric प्रोटीन जंगली प्रकार KIF5B के रूप में। Motorless KIF5B, इसलिए, एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती रूपों और mislocalized अपने cargos के साथ समुच्चय के रूप में कार्य करता है। इस विधि (चित्रा 1) 5 kinesin-1 मालवाहक सी-MYC की पहचान करने के लिए साबित हो रहा है। इस लेख में, एक ही motorless KIF5B उत्परिवर्ती kinesin-1 का एक और संभावित माल (चित्रा 2) के रूप में P53 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इससे पता चलता है कि कार्यप्रणाली kinesin-1 के अन्य cargos की पहचान करने के लिए संभव है। इसके अलावा, उत्परिवर्ती की विशिष्टता नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन सी-Fos (चित्रा 3) पर उत्परिवर्ती के प्रभाव की कमी से प्रदान की जाती है।
इस प्रोटोकॉल में, tdTomato टैग जंगली Tyपीई या motorless KIF5B प्रोटीन एक और फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग उम्मीदवार माल प्रोटीन के साथ coexpressed है। इस मामले में, रहते सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्रदर्शन कर रहे हैं। समुच्चय के गठन के समय चूक इमेजिंग से पता लगाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, tdTomato टैग प्रोटीन अकेले व्यक्त किया है और इसकी शारीरिक स्तर पर उम्मीदवार माल प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग अप्रत्यक्ष immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन tdTomato इसकी चमक और photostability 17 के लिए चुना जाता है। पृष्ठभूमि पूरा DMEM माध्यम के ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण अधिक है, फिनोल लाल के बिना मध्यम प्रयोग किया जाता है।
motorless KIF5B उत्परिवर्ती जंगली प्रकार KIF5B stoichiometrically साथ dimers रूपों। इसलिए, यह जंगली प्रकार के समकक्ष के साथ dimers फार्म के लिए अपने कार्य को बाधित करने और समुच्चय के रूप में करने के लिए motorless KIF5B उत्परिवर्ती के लिए पर्याप्त मात्रा में व्यक्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस मुद्दे expr के अनुकूलन को संबोधित करने के लिए,motorless उत्परिवर्ती की ession आवश्यक है। यह dimerization डोमेन युक्त एक छोटे motorless उत्परिवर्ती का उपयोग करके हासिल की है। इसके अलावा, उचित अभिकर्मक अभिकर्मक और प्रोटोकॉल के अनुकूलन भी आवश्यक है। डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ हेला कोशिकाओं के ऊष्मायन की अवधि exogenous प्रोटीन और सेल व्यवहार्यता की अभिव्यक्ति के लिए हेला कोशिकाओं में अनुकूलित किया गया था। ऊष्मायन अवधि अन्य सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
40X के लिए 4X के बीच आवर्धन के लिए, कोई कवर चश्मा आवश्यक हैं। कोशिकाओं को सीधे कुओं में जांच की जा सकती है। इसलिए, इस मामले में, प्रोटोकॉल सस्ती और सुविधाजनक है। 40X ऊपर आवर्धन के लिए, कोशिकाओं कुओं में कवर चश्मे पर हो रहे हैं और, धुंधला के बाद, तेल विसर्जन उद्देश्यों के तहत परीक्षा के लिए खुर्दबीन स्लाइड पर बढ़ रहे हैं।
motorless KIF5B प्रोटीन का समुच्चय के अवलोकन कोशिका द्रव्य के आकार के द्वारा सीमित है। यह पता लगाने के लिए आसान हैकई स्तनधारी कोशिकाओं में समुच्चय। हालांकि, यह neuronal कोशिकाओं में समुच्चय निरीक्षण करने के लिए जब कोशिका द्रव्य की मात्रा नाभिक के चारों ओर और neurites में छोटा है अपेक्षाकृत मुश्किल है।
प्रोटोकॉल में विवो खमीर दो संकर और जैव रासायनिक पुल से नीचे assays 13-16 के अलावा KIF5B और उसके cargos के बीच सहयोग को दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। इन सभी assays के विभिन्न शारीरिक शर्तों के तहत संघ का निर्धारण और उनके परिणामों को एक दूसरे के पूरक कर सकते हैं। इसके अलावा, अन्य assays पर इस प्रतिदीप्ति परख का लाभ यह है कि यह KIF5B द्वारा cargos के subcellular स्थानीयकरण के विनियमन दिखा सकता है (1 आंकड़े और 2)।
प्रोटोकॉल KIF5B तक सीमित नहीं है और इस तरह के कुछ अन्य kinesin मोटर्स 3 और मायोसिन मोटर्स 23,24 cargos 3 के intracellular परिवहन में उपयोग के रूप में कुछ अन्य मोटर प्रोटीन, cargos की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। ये मोटर प्रोटीन भी kinesin मोटर्स और मायोसिन मोटर्स के लिए microfilaments, और oligomerization के लिए coiled-तार क्षेत्रों के लिए सूक्ष्मनलिकाएं साथ आंदोलन के लिए मोटर डोमेन होते हैं। उनमें से अधिकांश homodimers 3,23 के रूप में। इसलिए, एक समान रणनीति उनकी motorless प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट बनाने के लिए अपने cargos की पहचान करने से उन्हें लागू किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |