A continuación, se presenta un protocolo para identificar Kinesin-1 cargamentos. Un mutante sin motor de la Kinesin-1 de cadena pesada (KIF5B) agregados en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas. Ambos agregados se detectan bajo microscopía de fluorescencia. Una estrategia similar se puede emplear para identificar cargamentos de otras proteínas de motor.
Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.
Kinesin-1 es una proteína de motor que media el transporte anterógrado de sus cargos 1,2. Es un heterotetrámero de las dos subunidades de la cadena Kinesin Light 1 (KLC1) y dos subunidades de Cadenas Kinesin pesados (KHCs). KIF5B 1, un KHC, contiene un dominio de motor en su extremo N-terminal, que hidroliza ATP y convierte la energía química en energía mecánica para el movimiento a lo largo de los microtúbulos. Su región C-terminal contiene el dominio de dimerización que interactúa con KLC1, que se asocia con cargas. Kinesin-1 transporta cargas tales como vesículas, orgánulos y mRNAs 3,4. Recientemente, se demostró KIF5B para transportar el factor de transcripción nuclear c-MYC de la degradación en el citoplasma proteosomal 5. Tres metodologías (inhibidor químico, siRNA / shRNA y mutante dominante negativo) fueron utilizados para inhibir la función Kinesin-1. Todos ellos inducen la agregación de c-MYC en el citoplasma. Para la última metodología, c-MYC solamente se vio afectada por la negat dominanteive mutante de KIF5B, pero no por la de otra proteína motor KIF5A relacionada, lo que sugiere que el mutante no ejerce efectos generales sobre los componentes intracelulares (como interrupción de microtúbulos) o en la agregación de proteínas. El mutante dominante negativo de KIF5B también no afectó a otro factor de transcripción, lo que sugiere que no ejerce efectos generales sobre los factores de transcripción. Más bien, se sugiere que el mutante negativo dominante ejerce efectos específicos sobre sus cargas.
El uso de mutantes dominantes negativos es común en el campo de las proteínas de motor. mutantes desprovistos de motor similares de Kinesins y myosins se utilizaron con anterioridad. Se utilizan principalmente para demostrar los efectos de los mutantes en las localizaciones subcelulares de sus cargas o en funciones celulares 6-12. Menos énfasis se puso en la relación espacial entre los mutantes y los cargos afectados por ellos. Sin embargo, en algunas incidencias, se observaron los mutantes para co-localizar con su cargos 6,10.
La interacción entre KIF5B y sus proteínas asociadas se confirmó previamente por la levadura in vivo ensayo de dos híbridos y pull-down ensayos bioquímicos tales como co-inmunoprecipitación y en pull-down ensayos in vitro 13-16. En este artículo, se describe un método mediante microscopía de fluorescencia visual adicional para identificar las proteínas de carga KIF5B. El método hace uso de un mutante KIF5B sin motor que actúa como un mutante negativo dominante. Se agrega en el citoplasma e induce la agregación de sus cargas.
El etiquetado de los de tipo salvaje y mutante KIF5B sin motor con la proteína fluorescente tdTomato 17 permite su visualización por microscopía de fluorescencia. Las proteínas etiquetadas KIF5B pueden co-expresan con una proteína candidata fusionada a una proteína fluorescente diferente con propiedades espectrales adecuadamente separadas de la etiqueta KIF5B. Las proteínas marcadas se observan directamente en células vivasbajo microscopía de fluorescencia. La inducción de la agregación de la proteína candidato por el mutante KIF5B motorless confirmará que la proteína candidata es una carga in vivo de KIF5B. Por otra parte, las proteínas KIF5B tdTomato-etiquetados se pueden expresar por sí solo en las células para estudiar sus efectos sobre las proteínas endógenas de carga. Más tarde, microscopía de inmunofluorescencia se lleva a cabo en el que se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo específico contra la proteína candidato endógena las células transfectadas, seguido por un anticuerpo secundario apropiado conjugado con un colorante fluorescente. En este caso, se estudió la proteína endógena candidato en su nivel fisiológico. mutantes desprovistos de motor similares de otras proteínas motoras se pueden preparar para identificar sus cargas.
El método descrito utiliza las propiedades del mutante KIF5B sin motor, que carece de la capacidad de moverse a lo largo de los microtúbulos, pero conserva la capacidad para formar dímeros con la KIF5B de tipo salvaje y, de este modo, permitir que la proteína tetramérica para interactuar con las mismas proteínas de carga como la de tipo salvaje KIF5B. KIF5B sin motor, por lo tanto, actúa como un mutante negativo dominante y formas mislocalized agregados con sus cargas. Este método se ha demostrado para identificar la Kinesin-1 de carga c-MYC (Figura 1) 5. En este artículo, se usó el mismo mutante KIF5B sin motor para identificar p53 como otra carga potencial de Kinesin-1 (Figura 2). Esto demuestra que la metodología es posible identificar otros cargos de Kinesin-1. Además, la especificidad de la mutante es proporcionado por la falta de efecto de los mutantes de la proteína de control negativo c-Fos (Figura 3).
En este protocolo, el tdTomato-etiquetados salvaje-tyPE o proteína KIF5B sin motor se coexpresan con otra proteína candidata de carga de proteínas marcadas con fluorescencia. En este caso, se llevan a cabo en vivo de células microscopía de fluorescencia y formación de imágenes. La formación de los agregados puede ser rastreado por la imagen de lapso de tiempo. Alternativamente, la proteína tdTomato-etiquetados se expresa solo y la proteína de carga candidato en sus niveles fisiológicos se visualiza mediante microscopía de inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos. El tdTomato proteína fluorescente es elegido por su brillo y fotoestabilidad 17. Si el fondo es alto debido a la auto-fluorescencia del medio completo DMEM, se utiliza medio sin rojo fenol.
El mutante KIF5B motorless forma dímeros con el KIF5B de tipo salvaje estequiométricamente. Por lo tanto, es crítico para expresar cantidad suficiente de mutante KIF5B sin motor para formar dímeros con la contraparte de tipo salvaje para inhibir su función y para formar agregados. Para abordar esta cuestión, la optimización de exprESIÓN del mutante sin motor es esencial. Esto se logra mediante el uso de una pequeña mutante sin motor que contiene el dominio de dimerización. Además, la optimización de la transfección reactivo apropiado y el protocolo es también necesaria. La duración de la incubación de las células HeLa con el reactivo de ADN / transfección se optimizó en células HeLa para la expresión de proteínas exógenas y la viabilidad celular. La duración de la incubación puede tener que ser optimizada para otras líneas celulares.
Para aumentos entre 4X a 40X, no se requieren cubiertas de vidrio. Las células pueden ser examinados directamente en los pocillos. Por lo tanto, en este caso, el protocolo es de bajo costo y conveniente. Para aumentos por encima de 40X, las células se cultivan en cubreobjetos en los pozos y, después de la tinción, están montados en portaobjetos de microscopio para examinarlas con objetivos de inmersión en aceite.
Observación de los agregados de la proteína KIF5B sin motor está limitado por el tamaño del citoplasma. Es fácil detectar laagregados en muchas células de mamíferos. Sin embargo, es relativamente difícil de observar los agregados en las células neuronales cuando el volumen del citoplasma es pequeño alrededor de los núcleos y en las neuritas.
El protocolo se utiliza para mostrar la asociación entre KIF5B y sus cargas, además de la in vivo levadura de dos híbridos y pull-down ensayos bioquímicos 13-16. Todos estos ensayos determinan la asociación en diferentes condiciones físicas y sus resultados pueden complementarse entre sí. Por otra parte, la ventaja de este ensayo de fluorescencia con respecto a otros ensayos es que puede mostrar la regulación de la localización subcelular de los cargos por KIF5B (Figuras 1 y 2).
El protocolo no se limita a KIF5B y se puede utilizar para identificar cargamentos de otras proteínas de motor, tales como algunos otros kinesin motores 3 y algunos de los motores de miosina 23,24 utilizados en el transporte intracelular de cargas 3. Estas proteínas motoras también contienen dominios de motor para el movimiento a lo largo de los microtúbulos para kinesin motores y microfilamentos para motores de miosina, y segmentos de doble espiral de oligomerización. La mayoría de ellos forman homodímeros 3,23. Por lo tanto, una estrategia similar se puede aplicar a ellos mediante la creación de sus mutantes negativos dominantes sin motor para identificar sus cargas.
The authors have nothing to disclose.
Roche’s Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.
absolute ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
Opti-MEM-I (transfection medium) | Life Technologies | 51985 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | |
formaldehyde, para | Fisher Scientific | O4042-500 | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche | 6365787001 | |
Taq DNA polymerase | Life Technologies | 10342020 | |
PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix) | Roche | 12111424 | |
Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-541A | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder | Life Technologies | SM1333 | |
PureLink Quick Gel Extraction kit | Life Technologies | K210012 | |
BamHI | New England Biolab | R0136 | |
SalI | New England Biolab | R0138 | |
T4 DNA ligase | New England Biolab | M0202T | |
Ethidium bromide | Thermo Scientific | 17898 | |
DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
c-MYC rabbit antibody | Cell Signaling | 5606 | |
p53 mouse antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody | Life Technologies | A11008 | |
Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody | Life Technologies | A11059 | |
fluorescent microscope | Olympus IX71_Fluoview | ||
computer software for imaging | cellSens |