Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ

Published: May 25, 2016 doi: 10.3791/53635
Automatic Translation
1, 1, 1, *2, *1
1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally

Abstract

على نطاق واسع المجهر الإلكتروني 2D (EM)، أو nanotomy، هو تطبيق على مستوى الأنسجة المجهر قرار النانو الإلكترون. الآخرين ونحن تطبيقها من قبل EM على نطاق واسع على الجلد الجزر البنكرياسية الإنسان، وزراعة الأنسجة وكلها اليرقات الزرد 1-7. نحن هنا تصف طريقة تطبيق عالميا لEM مسح الأنسجة النطاق للكشف عن متحيز من الميزات الفرعية الخلوية والجزيئية. تم تطبيق Nanotomy للتحقيق في صحة جيدة والدماغ الزرد الاعصاب. ويستند أسلوبنا على بروتوكولات إعداد نموذج موحد EM: الارتباط مع غلوتارالدهيد والأوسيميوم، تليها التضمين-راتنجات الايبوكسي، سامسونج باجتزاء وتصاعد من سامسونج المقاطع على شبكات حفرة واحدة، يليه آخر تلطيخ مع اليورانيل والرصاص. يتم الحصول على نطاق واسع صور 2D EM الفسيفساء باستخدام المسح EM متصلة مساحة واسعة مولد مسح خارجي باستخدام EM نقل المسح الضوئي (STEM). على نطاق واسع صور EM وعادة ما تكون ~ 5-50 G بكسل طحجم ن، وأفضل عرضها باستخدام ملفات HTML زومابلي، التي يمكن فتحها في أي متصفح ويب، على غرار الخرائط الجغرافية HTML على الانترنت. ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لأنسجة (الإنسان)، المقاطع العرضية من الحيوانات كلها وكذلك زراعة الأنسجة 1-5. هنا، تم تحليل أدمغة الزرد في غير الغازية نموذج الاجتثاث الخلايا العصبية. نحن تصور داخل الأنسجة واحدة مجموعة البيانات الخلوية والتغيرات التحت خلوية والتي يمكن قياسها كميا في مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة، الضامة في الدماغ. وبالإضافة إلى ذلك، nanotomy يسهل ارتباط EM مع المجهر الضوئي (كليم) 8 على النسيج نفسه، ومساحات كبيرة تصويرها سابقا باستخدام المجهر الفلورسنت، ويمكن بعد ذلك أن يخضع لمساحة واسعة م، مما أدى إلى نانو التشريح (nanotomy) من الأنسجة. في كل شيء، nanotomy يسمح كشف متحيز من الميزات على مستوى EM بطريقة قابلة للقياس على مستوى الأنسجة.

Introduction

وتحسنت التطورات التقنية الأخيرة براعة، تطبيق والطبيعة الكمية للEM، مما يؤدي إلى إحياء تحليل التركيبية. وتشمل التطورات 3D EM، على نطاق واسع 2D EM وتحسين أساليب والكاشف لمترابط المجهر الضوئي والمجهر الإلكتروني (كليم) لمقارنة وسائل أخرى للتحليل مجهري مباشرة إلى المستوى EM 8-10. واسعة النطاق 2D EM هو مناسبة خاصة لقياس أو تحديد (رواية) ميزات المرض لعلم الأمراض البشرية، ودراسة نماذج حيوانية لنماذج المرض وزراعة الأنسجة. ويرجع ذلك إلى حقل صغير عادة النظر أنه من الصعب ربط التغيرات في تضخم عالية على نطاق واسع الأنسجة، وكذلك لتحليل unbiasedly وكميا الخصائص التركيبية.

لتحليل المرضي من الأنسجة البشرية أو تقييم علم الأمراض في النماذج الحيوانية، haematoxylin ويوزين (H & E) الملونة أقسام الفورمالديهايد البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من (FFPE) تيسمقاضاة هو المعيار. وعلاوة على ذلك بسيط يتم تنفيذ H & E تلطيخ immunolabeling أيضا لتحديد التشوهات المرضية. إذا يمكن تحليل هذه الأنسجة على مستوى EM، أنواع معينة من الخلايا، ويمكن تحديد التغييرات التحت خلوية. طبيعة مشاركات من EM على نطاق واسع يسمح إيجاد ميزات غير متوقعة وجديدة من المرض. من قبل على نطاق واسع والمناطق EM يصل إلى ملليمتر مربع يمكن تصور. نحن وغيرنا nanotomy إلى الفئران الجزر البنكرياسية 4، ثقافة الخلية 2، 3 دماغ الفئران، والجلد والغشاء المخاطي 7 وكلها اليرقات الزرد 1،5 (www.nanotomy.org) تطبق سابقا. الزرد هي مناسبة جدا للتصوير في الجسم الحي، في بخاصة لتصور أنواع الخلايا التي يصعب الوصول إليها في أنسجة الثدييات بما في ذلك الدماغ الخلايا المناعية 11. هنا يتم وصف الإجراء nanotomy في التفاصيل، وتطبيقها على أقسام الاكليلية من رؤساء الزرد تمر الاجتثاث الخلايا العصبية المشروط تحويل ميترونيدازول من العصبيةوأعرب nitroreductase (www.nanotomy.org) 5،12-14. يتم تقديم جميع البيانات الخام على شكل ملفات HTML زومابلي، تصور الجزيئية للتغيرات على نطاق والأنسجة. عرض البيانات الخام يسمح التحليلات مشاركات من مجموعات البيانات من زوايا أخرى من قبل خبراء في جميع أنحاء العالم.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب مع يرقات الزرد لجنة التجارب على الحيوانات من جامعة جرونينجن وفقا لمبادئ توجيهية وطنية والاتحاد الأوروبي.

التحضير 1. عينة

  1. تثبيت والتضمين
    1. تثبيت
      1. تخدير يرقات الأسماك في تريكين (0.003٪) تضاف إلى E3 (5 ملم كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4، 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.6) المياه الزرد واختبار لعمق التخدير عن طريق بدس بلطف مع 200 ميكرولتر ماصة تحت المجهر تشريح حتى لم يعد الكشف عن الحركة (الشكل 1A).
      2. عند معالجة عينات للEM المتلازم بعد الحصول على البيانات في التصوير الجسم الحي باستخدام متحد البؤر أو التصوير 2 الفوتون في 1.8٪ الاغاروز كما وصفها، 5،15 الإصلاح اليرقات في الاغاروز باستخدام PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني تحتوي على تريتون-X-100 (0.05٪).
      3. قطع اليرقات من الاغاروز وعملية لعلى نطاق واسع م 5.
      4. إصلاح اليرقات في الطازجة بنسبة 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني تحتوي على تريتون-X-100 (0.05٪) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة في أنابيب بلاستيكية.
        ملاحظة: الخلايا التي تزرع في ثقافة (في المختبر) يمكن ان تكون ثابتة مباشرة في غلوتارالدهيد، كما هو موضح في الخطوة التالية (1.1.1.5).
      5. إزالة حل وإضافة 100 ميكرولتر 0.5٪ PFA، 2٪ غلوتارالدهيد (GA)، و 0.1 M كاكوديلات الصوديوم (7.4 درجة الحموضة). تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. عينات شطف مرتين في كاكوديلات 0.1 M الصوديوم.
      6. قطع رؤوس اليرقات rostrally إلى الدماغ المؤخر لتسهيل تغلغل الأوسيميوم. استخدام المحاقن الجميلة / ملقط.
      7. بوستفيكس اليرقات في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (أوسو 4) /1.5٪ فيرو سيانيد البوتاسيوم (K 4 [الحديد (CN) 6]) في 0.1 م كاكوديلات الصوديوم على الجليد لمدة 2 ساعة وشطف 3 × 5 دقائق في ضعف H المقطر 2 O.
      8. يذوى في الإيثانول بنسبة 20 حضانات دقيقة في زيادة تركيزات الإيثانول (50٪، 70٪، و 3 مرات 100٪).
    2. تضمين
      1. إعداد راتنجات الايبوكسي وفقا لصفات القياسية المستخدمة في مختبرات EM.
        ملاحظة: نحن نستخدم راتنجات الايبوكسي على النحو التالي: مزيج 19.8 غرام glycid الأثير 100، 9.6 غرام 2-dodecenylsuccinic أنهيدريد حمض و 11.4 غرام أنهيدريد methylnadic باستخدام محرك مغناطيسي. إضافة 0.5 غرام DMP-30 (tris- (dimethylaminomethyl) الفينول) وتخلط مرة أخرى.
      2. احتضان بين عشية وضحاها اليرقات في راتنجات الايبوكسي 50٪ في الإيثانول (ت / ت) في حين تناوب (RT).
      3. استبدال المخفف الايبوكسي الراتنج مع الراتنج الخالص. احتضان لمدة 30 دقيقة، إضافة راتنج جديد مرة أخرى واحتضان لمدة 30 دقيقة أخرى. مرة أخرى تحديث الراتنج ومن ثم احتضان 3 ساعة على RT، تليها 15 دقيقة في 58 درجة مئوية و 1 ساعة أخرى في RT تحت ضغط منخفض (200 مليبار).
      4. توجيه رؤساء في قوالب السيليكون التضمين شقة متاحة تجاريا تحت المجهر تشريح باستخدام إبرة أو مسواك مع الأمامية التي تواجه الجانب من العفن أو حسب الحاجة (الشكل 1B).
      5. بلمرة الدقة الايبوكسيفي ليلة وضحاها في 58 درجة مئوية. إذا راتنجات الايبوكسي لا تزال تسمح لينة جدا يوم آخر لتتبلمر وتتصلب في 58 درجة مئوية. اختبار صلابة عن طريق الضغط باستخدام ملقط. إذا كان هذا يترك بسهولة المسافة البادئة تسمح يوم آخر لتتبلمر وتتصلب في 58 درجة مئوية. عندما هو صلابة العينة تماما الشروع في تقليم وباجتزاء.
      6. تقليم بعيدا الراتنج الزائدة من كعب استخدام شفرات الحلاقة (الشكل 1B).
  2. باجتزاء، المتناقضة، وتركيب
    1. باجتزاء
      1. قسم راتنجات الايبوكسي كتلة باستخدام مشراح مستدق.
      2. استخدام سكين الزجاج أو histoknife لقطع الماس أقسام semithin (500 نانومتر) لطولويدين الأزرق / بالفوكسين الأساسي (1D الشكل) تلطيخ للكشف عن المواقع الصحيح.
      3. نقل أقسام شبه رقيقة على الشرائح المجهرية التي كتبها انتشالها مع الماصة الزجاج باستور الذي تم إغلاقه من قبل ذوبان في لهب طرف. الجاف على طبق ساخن شntil تبقى ولا ماء. وصمة عار لمدة 10 ثانية مع 1٪ الأزرق طولويدين في المياه على طبق ساخن وبعد الشطف بالماء، وصمة عار لمدة 10 ثانية مع 0.05٪ بالفوكسين الأساسي في 1٪ بورات ثنائي الصوديوم. دراسة مع المجهر الضوئي العادي في 10X 40X ل.
      4. عند الوصول إلى الموقع الصحيح / التوجيه في الدماغ، والاستمرار باجتزاء كتلة راتنجات الايبوكسي بسكين لقطع الماس أقسام سامسونج (~ 70 نانومتر، الشكل 1E)
      5. استخدام الهياكل التشريحية التي يسهل التعرف عليها في وحول الدماغ، بما في ذلك حفر حاسة الشم، والعيون، والحدود مسألة الرمادي والأبيض، لتحديد المنطقة ذات الاهتمام خلال سامسونج باجتزاء ولضبط زاوية باجتزاء عند إمالة العينة.
      6. جبل القسم على فتحة واحدة شبكات L2 × 1 النحاس (الشكل 1F)، للسماح للشراء دون انقطاع الحانات الشبكة. استخدام Formvar شبكات المغلفة لدعم أقسام.
    2. المتناقضة
      1. أقسام سامسونج صمة عار على الشبكةالصورة لمدة 2 دقيقة في 2٪ خلات اليورانيل في الميثانول تليها رينولدز يؤدي سترات لمدة 2 دقيقة أخرى 16.

2. الحصول على الصور

  1. STEM على نطاق واسع
    ملاحظة: نحن نستخدم المسح EM مع مسح مولد خارجي قادر على الحصول على الحقول الكبيرة نظر متعددة بدقة عالية 3،5،7،17 باستخدام الكشف STEM. عادة، ولدت صورة واحدة بهذه الطريقة ما يعادل مجالات نظر ~ 100 نقل المجهر الإلكتروني (تيم) وصور، والحد بشكل كبير من كمية من خياطة.
    1. تركيب نموذج في مجهر
      1. وضع الشبكة مع القسم في صاحب العينة شبكة متعددة ونقل الى غرفة لوزارة شؤون المرأة.
    2. محاذاة الكاشف STEM
      1. وضع الشبكة مع العينة تحت شعاع ونقل عنه ذلك سيكون تقريبا. 5 ملم من القطب العدسة. الحصول على صورة في 20 كيلو فولت باستخدامكاشف في العدسة.
      2. التركيز على حافة الشبكة وضبط العمل عن بعد إلى 4.0 مم.
      3. نقل صاحب العينة إلى وضع آمن وجلب كاشف الجذعية.
      4. توسيط حفرة للكشف STEM في الصورة الميدان من خلال تحويل التعديلات مسامير في حين التصوير في أقصى سرعة مع كاشف في العدسة.
      5. جلب مرة أخرى بعناية صاحب العينة التي سوف يصلح فقط بين عدسة قطب وكاشف.
      6. الحصول على صورة مع كاشف في عدسة للتأكد من أن تكون في منطقة الباب.
      7. التبديل إلى الجذعية الكشف (متوسط ​​الربح وكل الأرباع تعيين على 'ناقص') والحصول على صورة وحدد المنطقة المراد مسحها ضوئيا.
      8. رفع تسريع الجهد إلى 21 كيلو فولت والانتظار لتحقيق الاستقرار من الحزم (صورة مستقرة مرة أخرى) ثم انتقل إلى 29 كيلو فولت في الخطوات من 2 كيلو فولت.
    3. الحصول على صور
      1. قبل أشرق العينة (لمنع التغييرات سطوع الناجمة عن شعاع ه) من قبل التكبيرمن ذلك منطقة كاملة ليتم فحصها يناسب نافذة الصورة.
      2. تغيير الفتحة إلى 120 ميكرون (للحفاظ على النطاق الديناميكي السليم المكاسب كاشف يتعين خفض خطوة واحدة).
      3. دي التركيز لذلك عدم وضوح الصورة.
      4. جعل المنطقة الممسوحة ضوئيا ضيقة قدر الإمكان باستخدام الخيار مسح خفض مساحة.
      5. ضبط سرعة المسح الضوئي مثل هذا الإطار يتم فحصه في تقريبا. 1-2 ثانية.
        ملاحظة: اعتمادا على حجم ونسيج هذا عادة ما يستغرق نصف ساعة (100 × 100 ميكرون فوف) لتصل إلى 3 ساعات (1000 × 500 ميكرون).
      6. تكبير لا يقل عن 100X ومسح منطقة صغيرة لمدة 10 ثانية.
        ملاحظة: عندما لا يغير هذا المجال سطوع مقارنة مع القرى المحيطة، قبل التشعيع غير كافية.
      7. اعادة فتحة 30 ميكرون (وSTEM ربح المتوسطة)
      8. تركيز العينة.
      9. محاذاة الفتحة باستخدام المتذبذب (في ~ 40،000X التكبير).
      10. بينما في التركيز اختيار أخف منطقة / الميزة، ضبط سرعة المسح الضوئي بحيث تفاصيلهي واضحة.
      11. في برنامج مجهر ضبط السطوع والتباين التي تراقب عن كثب الرسم البياني للحفاظ على كل بكسل في النطاق الديناميكي. تفعل الشيء نفسه بالنسبة أحلك منطقة / الميزات.
      12. العودة الى المنطقة مشرقة والتحقق مرة أخرى. يكون على الجانب الآمن حتى لا يكون هناك بعض المساحة على جانبي المدرج.
      13. تصغير حتى منطقة كاملة ليتم فحصها يناسب نافذة التصوير، والبدء في برنامج اكتساب مساحة واسعة.
      14. استخدام الخيار المعالج لإعداد فسيفساء عن طريق اختيار منطقة من الشاشة. استخدام حجم بكسل 2-5 نانومتر اعتمادا على ما يلزم من التفاصيل. استخدام الوقت يسكن 3 ميكرو ثانية لSTEM.
      15. حدد الخيار "التركيز التلقائي على البلاط السابق"، استخدم الاستحواذ على نطاق واسع ضبط تلقائي للصورة البرنامج مع الإعدادات الافتراضية شركة، خانة الاختيار "التحقق من وضع قبل التنفيذ" وتحديد مكان حفظ البيانات.
      16. اضغط على "تحسين" للتحقق من إعدادات المجهر.
        ملاحظة: الآن الوقت اللازم سيكون SHيمتلك. قد يكون هذا ما يصل الى 72 ساعة ل1 × 0.5 ملم المناطق.
      17. في إطار "قرار الحد الأقصى البلاط" نوع لن يكون 20،000 البلاط الفردية عظمتها من 20K العاشر من 20K، ومنع الآثار حافة حادة. اضغط على "تنفيذ".
      18. وردا على سؤال لفحص تركيز والسطوع / التباين (B / C)، وإيقاف مولد المسح الخارجي وبعناية ضبط التركيز والاستجماتيزم في البرنامج المجهر. لا تغيير B / C.
        ملاحظة: يمكن نقل المرحلة والتكبير تغير، ولكن التكبير لابد من تعيين مرة أخرى إلى حجم بكسل المطلوب.
      19. التبديل على مولد المسح الخارجي مرة أخرى ثم اضغط على "الاستمرار".

تحليل 3. البيانات

  1. فتح برنامج عارض ملف EM على نطاق واسع وفتح ملف "معلومات الفسيفساء". هذا وسوف تفتح كل ملفات TIF القرميد. هذا يفضل أن يتم تنفيذها على محطة عمل أخرى لعدم عرقلة عمليات الاستحواذ الجديدة.
  2. اختيار الخيار "الاتحاد الافريقيلغرزة الفسيفساء بأكمله (معلمات تتداخل وضع على نصف، خياطة عتبة 0.90، والحد من الضوضاء التلقائي. وفي معايير خياطة حالة لا يمكن الوفاء بها، والتكبير في وضعه يدويا البلاط في موقف وانقر على 'مواصلة كما هو').
  3. تصدير كملف أتش تي أم أل، أو بدلا من ذلك باعتبارها TIF واحد.
    لاحظ أن لTIF تصدير قد تكون هناك حاجة لتقليص النطاقات. تشمل حجم بكسل النهائي في اسم الملف تمكين القياسات في وقت لاحق.
  4. أداء الشروح في ملف TIF عن طريق فتحه في برنامج تحرير الصور. في موازاة ذلك، فتح ملف HTML زوومابلي في متصفح الإنترنت لمراقبة المثلى القرار.

Representative Results

على نطاق واسع EM بيانات من أقسام الاكليلية للرئيس اليرقات الزرد القديمة 1-اسابيع يظهر العديد من الأنسجة والميزات الخلوية في صورة واسعة النطاق واحدة (www.nanotomy.org).

Nanotomy من أقسام الدماغ السيطرة يكشف ملامح التركيبية نموذجية من الأنسجة العصبية من الدماغ الأمامي منقاري بما في ذلك حزم الشم الألياف، نوى الخلايا العصبية والأجزاء الفرعية العصبية بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي (الشكل 2A، www.nanotomy.org). وتشمل أنواع الخلايا في الرأس التي يمكن تمييزها غضروفية مع فجوات كبيرة في الفك السفلي، المايلين أليف الأوزميك من الخلايا العصبية الشمية، والخلايا البطانية سفينة صغيرة، وتشمل هياكل السحاءة (النظير الزرد السحايا، وطبقة اشراب غشائي أدمغة الثدييات). وتشمل البنى التحت خلوية والكنان السكري من البشرة، الأشكال التضاريسية النووية المختلفة وبؤر في سل مختلفة أنواع لتر والعضيات بما في ذلك جهاز جولجي، الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا)، الميتوكوندريا والحويصلات المشبكية وكثافة بعد متشابك.

بشكل غير متوقع نوى الخلايا المبطنة للبطين هي غاية كثيفة الإلكترون مقارنة مع الخلايا الأخرى فرقت أكثر إبداعا في الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، تظهر هذه النوى البطين بؤر الظلام التي هي غائبة في الخلايا الأخرى في الدماغ وتبدو مختلفة في حجم وهيكل من المغاير، التي وجدت في نوى الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (الشكل 2). الخلايا المبطنة للبطين في تطوير الزرد وتشمل الخلايا الدبقية معظمهم شعاعي والأسلاف العصبية، والتي قد تعكس حالة لونين غيرت من خلايا أكثر متباينة. كما الخلايا الجذعية في الأنسجة بشكل عام نادرة جدا، nanotomy لربط العلامات الأنسجة لعلامات الخلايا الجذعية مع حجم الأنسجة EM ذلك يمكن استخدامها لتحديد ملامح التركيبية للخلايا الجذعية.

ve_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> على نطاق واسع-EM (www.nanotomy.org) من قسم الاكليلية في اليرقة الزرد تمر الاجتثاث الخلايا العصبية يكشف العديد من أنسجة معينة، والخصائص الخلوية والجزيئية لم يتم العثور في الحيوانات السيطرة. وتشمل الميزات الخلوية الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة وفجوات حجم الخلايا، من المرجح أن يمثل الموت الخلايا (الشكل 2B، www.nanotomy.org). وقد حددت الدراسات EM السابقة الخلايا الدبقية الصغيرة في الفقاريات 18،19. السمات المميزة للالخلايا الدبقية الصغيرة وتشمل نوى ممدود ، كتل من لونين غير مكتمل بجانب الغلاف النووي، جهاز جولجي بارز، polyribosomes الحرة، الشبكة الإندوبلازمية الحبيبية (ER) مع صهاريج الطويلة الضيقة، والظلام نسبيا / السيتوبلازم الكثيفة، والعديد من الادراج، مثل جسم بلعمي، قطرات الدهون والجسيمات الحالة. كل هذه بصمات، تنسب إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في أنسجة الثدييات وجدت، وأيضا في هذه الخلايا في أدمغة الزرد (الشكل 2B، www.nanotomy.org).

<الطبقة ص = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: سير العمل على نطاق واسع الأنسجة المجهر الإلكتروني على أدمغة الزرد. (A) اليرقة الزرد القديمة يوم 7. (ب) رؤساء اليرقات الزرد جزءا لا يتجزأ من جنبا إلى جنب في راتنجات الايبوكسي. سكين (C) زجاج شبه -thin باجتزاء وتوجيه العينة. (D) الممثل semithin طولويدين الأزرق القسم الملون تظهر اثنين جنبا إلى جنب جزءا لا يتجزأ من اليرقات الزرد. سكين (E) الماس لقطع سامسونج (70 نانومتر) أقسام. (F) تحريره صورة في (د) من القسم الدماغ اليرقات الزرد كله على شبكة حفرة واحدة تشير إلى المواقع. (G) نظام الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع 2D EM في هذه الدراسة. (H) تدفق معالجة الصور. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
. الشكل 2: Nanotomy النتائج: من جزيء إلى الأنسجة (A) Nanotomy من أدمغة 7 أيام السيطرة التسميد آخر و (ب) تعامل (الاجتثاث الخلايا العصبية، الشكل 1)، والتي تبين ملامح محددة إلى العصبية ذاب الدماغ التنكسية (B) هذه وتشمل الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة، زنازين مظلمة تمر موت الخلايا وظهور الاسفنجية من الأنسجة العصبية ((A) و (B)). الألواح العلوية (مقتبس من 5): 10X عرض مكبرة من المنطقة المشار إليها في لوحات المتوسطة. لوحات الوسطى: عرض 10X مكبرة من المنطقة المشار إليها في لوحات أقل. (A، وسط لوحة) عرض عالية التكبير من neuropil تظهر المشبك في الفقرة (أ، اللوحة السفلى)، الحويصلات المشبكية (SVS) وكثافة بعد المشبكي (PD). (B، لوحة الأوسط) عرض عالية التكبير من الخلايا الدبقية الصغيرة أميبية أو ربما البلاعم (لوحة المتوسطة، M) تظهر المظاهر التقليدية أميبية دبيقي (اللوحة السفلى) بما في ذلك جهاز جولجي بارز (G)، الادراج بما في ذلك فجوات الليزوزومية (L). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (أعلى)، 5 ميكرون (وسط) و 0.5 ميكرون (القاع). تم تعديل هذا الرقم من 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم ، أو زيارة البيانات على الانترنت كامل (nanotomy.org).

Discussion

EM يسمح تحليل السياق الخليوي مع القرار التصوير عالية من الجزيئات في سياق البيولوجي. ومع ذلك، وهذا يحد عادة من مجال الرؤية. نطاق أوسع 3D EM هو مناسبة خاصة لربط الخرائط العصبية من خلال خلق قرار النانو 3 إعادة البناء الأبعاد، تتطلب معالجة البيانات المعقدة 10. في المقابل، 2D على نطاق واسع EM يتطلب سوى مقطع واحد وخياطة من البيانات التصوير، وتقييم البيانات ممكنا من قبل أي شخص من الوصول إلى مستعرض إنترنت. نحن وغيرنا المستخدمة سابقا EM على نطاق واسع لتحليل الأنسجة والحيوانات كلها. أما بالنسبة لمعظم النهج، تيم وخياطة أساس SEM-لا مزاياها. هنا، نقل مسح EM (STEM) والمستخدمة التي تتيح توليد حقل كبير للعرض بدقة عالية. عادة، صورة STEM واحد ما يعادل مجالات عرض ما يقرب من 100 صورة تيم، والحد بشكل كبير من كمية خياطة عند التصوير ملعب لكبيرس النظر بدقة عالية. إذا كانت هناك حاجة دقة أعلى، قد يكون من المفيد تيم. STEM لديه ميزة على تيم ان العينات غير يتناقض يمكن استخدامها مع تباين التركيبية جيد 6.

بالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الموصوفة هنا يمكن تعديلها ببساطة للاستخدام مع الظهر المنتشرة كشف الإلكترون (BSD) على شنت أقسام على رقائق السيليكا، وتوسيع نطاق استخدام نظم المجهر متعددة. الأنسجة HTML زومابلي الملفات EM هي مفيدة جدا لتقدير، وتبادل البيانات التي قد لا يتم تحليلها لمضمونها الكامل، والجمع بين LM والبيانات EM (كليم) 8، أغراض العرض في مجال البحث العلمي، لتحليل بيانات المرضى، والتعليم. بدلا من ذلك، في EM على نطاق واسع في وزارة شؤون المرأة، ولكن ليس في تيم، رقائق السيليكا يمكن استخدامها، والذي فقد اثنين من المزايا الرئيسية: BSD يمكن استخدامها، والذي يتوفر على المجاهر الإلكترونية المسح الضوئي من STEM الكشف بشكل عام. ثانيا، تصاعد قطاعات كبيرة (> 1 مم 2 مجالاتالفائدة) واضح ومباشر. تصاعد على شبكات فترة زمنية محددة واحدة إلى عمالة كثيفة وصعبة من الناحية التقنية. هو مفصل مقارنة تفصيلية بين تيم، ووزارة شؤون المرأة وSTEM في أي مكان آخر 6. عيوب التصوير BSD هو أنه، مقارنة STEM، زادت الصور الضوضاء. وهذا يمكن أن يعوض جزئيا عن طريق زيادة الوقت بكسل يسكن، مما أدى في مرات الحصول أطول من ذلك بكثير.

على الرغم من أن لتحضير العينات وتجهيز قياسي نسبيا EM (التثبيت، وتضمين وباجتزاء) هناك حاجة إلى 5-7، فمن الصعب فنيا لخفض أقسام سامسونج كبيرة خالية تماما من القطع الأثرية. أقسام هشة جدا، وكسر بسهولة، أضعاف أو دمرت أثناء التصوير، والتي عادة ما يستغرق ساعات عدة في البيانات. ومع ذلك، بسبب المشاركة عبر الإنترنت من بيانات مشاركات الخام، فإنه ينبغي أن يصبح من الممكن مقارنة بسهولة أكبر إلى البيانات المنشورة، واستخدام بيانات نشرت في المجال مفتوح والضوابط. حاليا، عدد قليل من الأجهزة EM قادرة على لوس انجليستحليل RGE على نطاق وقيد الاستخدام، وبالتالي الوصول إلى هذه التقنية محدودة نوعا ما، رغم أن معظم مراكز التصوير ترحب الجهود التعاونية.

لأقسام واسعة النطاق الأنسجة يجب أن تكون ثابتة بشكل صحيح في جميع أنحاء العينة. وهذا هو السبب يتم استخدام خليط من تثبيتي بسرعة ولكن معتدل PFA في تركيبة مع GA بطيء ولكنه قوي تثبيتي. قطع والتقاط أجزاء كبيرة من دون القطع الأثرية أمر صعب. العمل مع رقائق في تركيبة مع BSD هو أسهل مقارنة مع جمع المقاطع على شبكات حفرة واحدة. آخر المعادن الثقيلة تلطيخ أكثر خطورة مقارنة EM الكلاسيكية. حيث يتم تصوير الفرع بأكمله كل قطعة أثرية سوف تكون واضحة. المستخدمين تيم تجد عادة صعوبة في التحول إلى وزارة شؤون المرأة، وذلك بسبب الفرق في عملية المجهر.

الكمي وتبادل البيانات - تحديد مقدار الميزات التحت خلوية من الصعب في الصور EM واحدة. إمكانية التكبير والتصغير واسعة النطاقالصور يسمح بسهولة تحديد خلايا الفائدة، والتي يمكن أن تتبعها القياسات النانوية داخل الخلايا. وتشير هذه المجموعات أن أنواع معينة من الخلايا يمكن التعرف بسرعة وكميا بطريقة غير متحيزة في هذه المقاطع الأنسجة كبيرة، على أساس الخصائص للكشف على مختلف المستويات. ويمكن التعرف على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرة القائمة على التشكل والسيتوبلازم الكثيفة. وفي وقت لاحق، على التكبير على الخلايا الفردية، وميزات النانوية التحت خلوية وجزيئية من هذه الخلايا يمكن قياسها ضمن نفس مجموعة البيانات، كما فعلنا في السابق لعرض ER ضمن نطاق واسع الأنسجة EM الثقافة مجموعة البيانات 2. ميزة إضافية من nanotomy هي أن استضافة مجموعات البيانات على نطاق واسع على الانترنت وسوف تسمح للآخرين أن تفقد البيانات، ربما لغيرها من الميزات، واستخلاص النتائج على فرضية جديدة.

كليم - بالإضافة إلى تسهيل EM الكمي، كبير EM على نطاق ويجعل من الاسهل لربط microsco خفيفةالموافقة المسبقة عن علم العلامات على مستوى EM 8. في المثال الحالي يظهر وجود الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية في نموذج الاجتثاث الزرد. والسؤال الكبير في علم الأعصاب هو ما المهام الفردية والمساهمات من الخلايا الدبقية الصغيرة وغيرها من المصادر المحتملة للأكلة والخلايا المناعية. وقد أظهرت الدراسات EM مبكرة ميزات التحت خلوية مميزة من الخلايا الدبقية الصغيرة في مرض 18. لسوء الحظ، فإنه من الصعب تسمية انتقائي الخلايا الدبقية الصغيرة على وجه الخصوص في إعداد المرضية، كما أنها تظهر تداخل كبير مع خلايا مناعية أخرى في التعبير الجيني، مورفولوجيا وظيفة. ولذلك، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت وعندما تختلف الخلايا الدبقية الصغيرة على مستوى التركيبية من الخلايا المناعية من مصادر أخرى بما في ذلك الوحيدات المستمدة التسلل الضامة. فهم ما إذا كانت هناك اختلافات التركيبية بين هذه الخلايا وتوفير نقطة انطلاق لتحليل الفروق الوظيفية. الجمع الانتقائي المعدلة وراثيا أو التعبير علامات وكليم يسمح ديتection من الميزات التركيبية انتقائية لفئات معينة من السكان.

التشخيص والعرض والتعليم - من خلال وضع تصور النانو لالميكروسكيل ضمن البيانات بيانات EM واحد مما يسهل إلى حد كبير لجمهور واسع. مع زيادة إمكانيات وأدوات لEM مترابط وعلى نطاق واسع، فإننا نتوقع انتعاش EM في البحوث الأساسية والطبية. يتم تطبيق أسلوبنا الممثلة هنا إلى نموذج إصابة الزرد الدماغ 5، ولكن تم استخدامها في الأنسجة البشرية 7، دماغ الفئران 3، في نموذج الفئران لمرض السكري (4) وفي زراعة الخلايا 2، ويمكن أن تستخدم أيضا في تركيبة مع تيم النهج القائم 1 تظهر براعة هذا الأسلوب. لم يعد التسجيل المختار المشغل المجهر للغاية، وبالتالي الصور المتحيزة، ولكن يتم تسجيل كافة الميزات التركيبية عديدة ومفتوحة للتحليل في جميع أنحاء العالم.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تنفيذ معظم الأعمال في المجهر والتصوير مركز UMCG (UMIC)، الذي ترعاه NWO 175-010-2009-023 وZonMW 91111006. موطني "وادي المجهر 12718" لBNGG. وقد رعت هذا العمل من خلال منحة ZonMW شفني، وماري كوري منحة التكامل الوظيفي (إنقاذ الموت الخلايا العصبية) والزمالة الزهايمر هولندا إلى TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 111، على نطاق واسع المجهر الإلكتروني والمسح الضوئي EM، nanotomy، الزرد، EM الكمي، المجهري المترابطة
على نطاق واسع الضوئي نقل المجهر (Nanotomy) من صحي والمصاب الزرد الدماغ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuipers, J., Kalicharan, R. D.,… More

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter