Abstract
Grootschalige 2D-elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is het weefsel-brede toepassing van nanoschaal resolutie elektronenmicroscopie. Anderen en we eerder toegepast op grote schaal EM op de menselijke huid pancreaseilandjes, weefselkweek en hele zebravis larven 1-7. Hier beschrijven we een universeel toepasbare methode voor het weefsel schaal scanning EM voor onpartijdige detectie van sub-cellulaire en moleculaire kenmerken. Nanotomy werd op de gezonde en neurodegeneratieve hersenen zebravis onderzoeken. Onze werkwijze is gebaseerd op de gestandaardiseerde EM monstervoorbereiding protocollen: fixatie met glutaraldehyde en osmium, gevolgd door epoxy hars inbedding, ultradunne snijden en monteren van ultradunne secties in-één-hole netten, gevolgd door na kleuring met uranyl en lood. Grootschalige 2D EM mozaïek beelden werden met behulp van een scanning EM aangesloten op een externe grote oppervlakte scan generator middels scanning transmissie EM (STEM). Grootschalige EM beelden zijn meestal ~ 5-50 G pixels in de grootte en het best bekeken met behulp van zoomable HTML-bestanden, die kunnen worden geopend in een webbrowser, vergelijkbaar met online geografische HTML kaarten. Deze methode kan worden toegepast (humaan) weefsel, doorsneden van hele dieren en weefselkweek 1-5. Hier werden zebravis hersenen geanalyseerd op een niet-invasieve neuronaal ablatie model. We visualiseren binnen een enkele dataset weefsel, cellulaire en subcellulaire veranderingen die kunnen worden gekwantificeerd in verschillende celtypes, waaronder neuronen en de microglia, macrofagen de hersenen. Bovendien nanotomy maakt de correlatie van EM met lichtmicroscopie (CLEM) 8 op hetzelfde weefsel als grote oppervlakken eerder afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie vervolgens kan worden onderworpen aan een groot gebied EM, resulterend in de nano-anatomie (nanotomy) van weefsels. In totaal nanotomy maakt onpartijdige detectie van faciliteiten in EM niveau in een weefsel-brede kwantificeerbare wijze.
Introduction
Recente technische ontwikkelingen hebben de veelzijdigheid, toepasbaarheid en kwantitatieve aard van EM verbeterd, wat leidt tot een opleving van ultrastructurele analyse. Voorschotten omvatten 3D EM, grootschalige 2D EM en verbeterde methoden en reagentia voor gecorreleerde lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie (CLEM) naar andere vormen van microscopische analyse te vergelijken rechtstreeks naar de EM-niveau 8-10. Grootschalige 2D EM is bijzonder geschikt te kwantificeren of te identificeren (roman) ziekte functies voor humane pathologie, studeren diermodellen voor de ziekte en weefselkweek modellen. Vanwege de gewoonlijk kleine gezichtsveld moeilijk om veranderingen bij een sterke vergroting te correleren aan een weefsel niveau, alsmede unbiasedly en kwantitatief analyseren ultrastructurele kenmerken.
Voor pathologische analyse van menselijk weefsel of de beoordeling van de pathologie in diermodellen, hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde delen van formaldehyde gefixeerd paraffine ingebedde (FFPE) tisSue is de norm. Naast eenvoudige H & E kleuring immunokleuring wordt ook uitgevoerd pathologische afwijkingen te identificeren. Als dergelijke weefsels kunnen worden geanalyseerd op het niveau EM specifieke celtypen, en subcellulaire veranderingen kunnen worden geïdentificeerd. De onpartijdige aard van grootschalige EM maakt het vinden van onverwachte en nieuwe kenmerken van de ziekte. Door grootschalige EM gebieden tot vierkante millimeter kunnen worden gevisualiseerd. Wij en anderen eerder toegepaste nanotomy om pancreaseilandjes 4 rat, celkweek 2, rattenhersenen 3, huid en slijmvliezen 7 en hele zebravis larven 1,5 (www.nanotomy.org). Zebravis zijn zeer geschikt voor in vivo beeldvorming, in het bijzonder op celtypen die moeilijk toegankelijk zijn in zoogdierlijke weefsels zoals hersenen immuuncellen 11 visualiseren. Hier nanotomy de procedure wordt in detail beschreven, toegepast op coronale secties van zebravis heads ondergaan voorwaardelijke neuronale ablatie door omzetting van metronidazol door neuronaleuitgedrukt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle ruwe data wordt gepresenteerd als zoomable HTML-bestanden, het visualiseren van moleculaire tot weefsel schaal verandert. De presentatie van de ruwe data maakt onpartijdige analyses van de datasets vanuit andere invalshoeken door experts over de hele wereld.
Protocol
Alle experimenten met de zebravis larven werden goedgekeurd door de Animal Experimentation Comité van de Rijksuniversiteit Groningen op basis van nationale en EU-richtlijnen.
1. Monstervoorbereiding
- Fixatie and Embedding
- bevestiging
- Verdoven vislarven in tricaïne (0,003%) toegevoegd aan de E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 mM HEPES, pH 7,6) zebravis water en test voor de diepte van de anesthesie door porren voorzichtig met een 200 ul pipetpunt onder dissectie microscoop totdat beweging wordt niet meer gedetecteerd (Figuur 1A).
- Bij het verwerken van monsters voor correlatieve EM na overname in vivo imaging data via confocale of 2 foton beeldvorming in 1,8% agarose beschreven, 5,15 fix larven in agarose gebruikt 4% PFA in PBS dat Triton-X-100 (0,05%).
- Gesneden larven uit agarose EN WERKWIJZE VOORgrootschalige EM 5.
- Fix larven in vers 4% paraformaldehyde in PBS dat Triton-X-100 (0,05%) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in plastic buizen.
Opmerking: de cellen in kweek (in vitro) kan direct worden vastgesteld in glutaaraldehyde, zoals beschreven in de volgende stap (1.1.1.5). - Verwijderen oplossing en voeg 100 ul 0,5% PFA, 2% glutaraldehyde (GA), en 0,1 M natriumcacodylaat (pH 7,4). Bewaar de nacht bij 4 ° C. Spoel monsters tweemaal in 0,1 M natriumcacodylaat.
- Snijd larvale kop rostraal aan de achterhersenen penetratie van osmium vergemakkelijken. Gebruik fijne spuiten / tang.
- Postfix larven in 1% osmiumtetroxide (OsO 4) /1.5% kaliumferrocyanide (K 4 [Fe (CN) 6]) in 0,1 M natriumcacodylaat op ijs gedurende 2 uur en spoel 3 x 5 min in dubbel gedistilleerd H 2 O.
- Dehydrateer in ethanol door 20 min incubatie in toenemende concentraties ethanol (50%, 70%, 3 maal 100%).
- Inbedding
- Bereid epoxyhars volgens standaard recepten gebruikt in EM labs.
Opmerking: We gebruiken epoxyhars als volgt: meng 19,8 g glycid ether 100, 9,6 g 2-dodecenylbarnsteenzuur anhydride en 11,4 g methylnadic anhydride met een magneetroerder. Voeg 0,5 g DMP-30 (tris (dimethylaminomethyl) fenol) en meng opnieuw. - Incubeer overnacht larven in 50% epoxyhars in ethanol (v / v) onder draaiing (RT).
- Vervang verdunde epoxy hars met zuivere hars. Incubeer gedurende 30 minuten, voeg verse hars opnieuw en incubeer gedurende nog 30 min. Vernieuwt de hars en incubeer 3 uur bij KT, gevolgd door 15 min bij 58 ° C en nog 1 uur bij kamertemperatuur onder lage druk (200 mbar).
- Oriënteren de koppen in commercieel verkrijgbare silicium plat inbedding mallen onder een dissectie microscoop met een naald of tandenstoker met de voorste naar de zijde van de mal of naar behoefte (Figuur 1B).
- Polymeriseren epoxy resin de nacht bij 58 ° C. Als epoxyhars nog te zacht mogelijk andere dag polymeriseren en harden bij 58 ° C. Test stijfheid door druk behulp van een tang. Als dit laat gemakkelijk een inkeping zodat andere dag polymeriseren en harden bij 58 ° C. Wanneer specimen volledig is uitgehard overgaan tot het trimmen en snijden.
- Knip overtollige hars van de stomp met behulp van scheermesjes (Figuur 1B).
- Bereid epoxyhars volgens standaard recepten gebruikt in EM labs.
- bevestiging
- Snijden, Contrasterende, en montage
- snijden
- Sectie epoxyhars blok met behulp van een ultramicrotoom.
- Gebruik een glazen mes of een diamant histoknife om semithin secties (500 nm) voor toluidine blauw / basisch fuchsine snijden (figuur 1D) kleuring om de juiste positionering te detecteren.
- Transfer semi-dunne secties op microscopische dia's door ze aan te raken met een glas Pasteur pipet waarvan de tip werd gesloten door smelten in een vlam. Droog op een hete plaat until geen water wordt gelaten. Vlek voor 10 sec met 1% toluidine blauw in het water op een hete plaat en na het spoelen met water, beits voor 10 sec met 0,05% basic fuchsine in 1% natriumtetraboraat. Onderzoek met een normale lichtmicroscoop bij 10x naar 40x.
- Wanneer de juiste locatie / oriëntatie binnen de hersenen bereikt, blijven snijden het blok epoxyhars met een diamanten mes ultradunne coupes (~ 70 nm Figuur 1E)
- Gebruik gemakkelijk herkenbaar anatomische structuren in en rond de hersenen, met inbegrip van olfactorische pits, ogen, grijs-witte stof grenzen, naar de regio van belang tijdens ultradunne snijden identificeren en om het snijden hoek aan te passen wanneer het monster wordt gekanteld.
- Mount hoofdstuk over single slot L2 x 1 koperen roosters (Figuur 1F), om overname ononderbroken door roosterstaven mogelijk te maken. Gebruik Formvar gecoate roosters bij de afdelingen te ondersteunen.
- contrasterende
- Vlek ultradunne secties op het nets gedurende 2 minuten in 2% uranyl acetaat in methanol gevolgd door Reynolds loodcitraat nog eens 2 min 16.
- snijden
2. Image Acquisition
- Large Scale STEM
Let op: We maken gebruik van scanning EM met een externe scan generator in staat is het verwerven van meerdere grote gezichtsveld met een hoge resolutie met behulp van 3,5,7,17 STEM detectie. Kenmerkend een beeld gegenereerd Zo is gelijk aan het gezichtsveld van ~ 100 Transmission Electron Microscope (TEM) beelden aanzienlijk verminderen van de hoeveelheid stiksel.- Montage Sample in Microscope
- Plaats rooster met sectie in het raster monsterhouder meervoudige en over te dragen in de kamer van de SEM.
- Uitlijning van de STEM Detector
- Zet het raster met het monster onder de balk en bewegen dus het ongeveer zal zijn. 5 mm van de lens pool. Verwerven van een afbeelding bij 20 kV met behulpde in-lens detector.
- Focus op raster rand en aan te passen werkafstand tot 4,0 mm.
- Beweeg de monsterhouder naar een veilige positie en brengen in de STEM detector.
- Centreer het gat van de STEM detector in het beeldveld door de schroeven aanpassingen tijdens beeldvorming bij maximale snelheid in de lens detector.
- breng voorzichtig de rug van de monsterhouder die net past tussen de lens pool en de detector.
- Verwerven van een beeld met de in-lens detector om zeker te zijn op de sectie gebied.
- Schakelaar om detectie (winst op middellange en alle kwadranten ingesteld op 'minus') STEM en het verwerven van een beeld en selecteer het gebied dat moet worden gescand.
- Raise versnelling spanning tot 21 kV en te wachten voor de stabilisatie van de balk (stabiel beeld weer) en ga dan naar 29 kV in stappen van 2 kV.
- Het verwerven van afbeeldingen
- Pre-bestralen van het monster (helderheid veranderingen veroorzaakt door de elektronenbundel te voorkomen) door in te zoomenuit, zodat dit gebied moet worden gescand past het venster afbeelding.
- Verander opening tot 120 micrometer (om de juiste dynamische bereik van de detector winsten hebben één stap worden verlaagd te houden).
- De scherpstelling zodat het beeld is wazig.
- Maak het gescande gebied zo strak mogelijk met behulp van de scan optie verminderd omgeving.
- Stel scansnelheid, zodanig dat een frame wordt gescand in ong. 1 - 2 sec.
Opmerking: Afhankelijk van de grootte en weefsels neemt dit meestal ½ uur (100 x 100 urn FOV) naar maximaal 3 uur (1000 x 500 pm). - Zoom in op zijn minst 100X en scan een kleine ruimte voor 10 sec.
Opmerking: Wanneer dit gebied niet helderheid te wijzigen ten opzichte van zijn omgeving, pre-bestraling is voldoende. - Breng terug de 30 pm diafragma (en STEM winst op gemiddeld)
- Focus van het monster.
- Lijn diafragma met behulp van de wobbler (bij ~ 40,000X vergroting).
- Terwijl in focus selecteert u de lichtste gebied / functie, stelt scansnelheid zodanig dat de detailszichtbaar.
- In de microscoop software aan te passen helderheid en het contrast door zorgvuldig te kijken naar het histogram alle pixels in het dynamische bereik te houden. Doe hetzelfde voor de donkerste gebied / features.
- Ga terug naar de lichte ruimte en opnieuw controleren. Wees op de veilige kant, dus er is wat ruimte aan beide zijden van het histogram.
- Uitzoomen zodat dit gebied moet worden gescand past bij de beeldvorming raam, en start het grote gebied acquisitie programma.
- Gebruik de optie wizard om het opzetten van een mozaïek van een gebied te selecteren in het scherm. Gebruik pixelgrootte 2-5 nm, afhankelijk van welke gegevens nodig. Gebruik verblijftijd 3 ps voor STEM.
- Kies optie 'autofocus op eerdere tegel ", gebruik dan de grootschalige acquisitie software autofocus met standaardinstellingen bedrijf, check box" te controleren instelling voorafgaand aan de uitvoering "en bepalen waar de gegevens op te slaan.
- Druk op "optimaliseren" naar microscoop instellingen te controleren.
Opmerking: Nu is de tijd die nodig zal zijn sheigen. Dit kan tot 72 uur gedurende 1 x 0,5 mm gebieden. - In venster type "maximale resolutie tegel" zal 20.000, zodat individuele tegels niet groter zijn dan 20k x 20k, het voorkomen van botte kant effecten. Druk op "uitvoeren".
- Toen hem werd gevraagd voor het controleren van de scherpstelling en Helderheid / Contrast (B / C), schakelt externe scan generator en zorgvuldig focus en astigmatisme te passen in de microscoop software. Niet veranderen B / C.
Opmerking: Het podium kan worden verplaatst en vergroting veranderd, maar vergroot moet naar de gewenste pixelgrootte ingesteld. - Schakel externe scan generator weer en druk op "doorgaan".
- Montage Sample in Microscope
3. Gegevensanalyse
- Open grootschalige EM file viewer programma en open het bestand "mozaïek info". Dit alles zal de betegelde tif-bestanden te openen. Dit wordt bij voorkeur uitgevoerd op een ander werkstation naar nieuwe acquisities niet belemmeren.
- Kies optie 'auom te borduren hele mozaïek (parameters overlappen mode op de helft, stikken drempel 0,90, ruisonderdrukking automatisch. In het geval stiksels criteria kan niet worden voldaan, zoom in en handmatig tegel te plaatsen in de positie en klik op 'continue as is').
- Exporteren als een HTML-bestand, of als alternatief als een enkele TIF.
Merk op dat voor TIF exporteren downscaling nodig zou zijn. Neem de laatste pixelgrootte in de bestandsnaam waarmee metingen later. - Voer aantekeningen in het TIF-bestand door het te openen in een beeldbewerkingsprogramma. Tegelijkertijd opent de inzoombare html-bestand in een webbrowser voor optimale resolutie observatie.
Representative Results
Grootschalige EM dataset van coronale secties van het hoofd van de 1-weken oude zebravis larven vertoont veel weefsel en cellulaire functies beeld een enkele grote schaal in (www.nanotomy.org).
Nanotomy controle hersensecties toont typische ultrastructurele eigenschappen van neuraal weefsel van de rostrale voorhersenen inbegrip olfactorische vezelbundels, neuronale kernen en neuronale deelcompartimenten waaronder synapsen (Figuur 2A, www.nanotomy.org). Celtypen de kop die onderscheiden kunnen worden omvatten chondrocyten met grote vacuolen in de onderkaak, osmiophilic myeline van de olfactorische zenuwcellen, endotheelcellen van een klein schip, structuren omvatten de meninx (de zebravis tegenhanger van de hersenvliezen, de membraneuze laag omhulling de hersenen van zoogdieren). Subcellulaire structuren omvatten de glycocalyx van de opperhuid, verschillende nucleaire morfologie en brandpunten in verschillende cel l soorten en organellen waaronder Golgi apparaat, endoplasmatisch reticulum (ER), mitochondria en synaptische blaasjes en post-synaptische dichtheden.
Onverwacht de kernen van cellen die het ventrikel zeer electron dichtheid in vergelijking met andere cellen meer zijdelings verspreid in de hersenen. Bovendien zijn deze ventriculaire kernen tonen donkere foei die afwezig zijn in andere cellen in de hersenen en lijken verschillende omvang en structuur van de heterochromatine, die is gevonden in kernen van fagocyterende microglia (figuur 2). Epitheelcellen van de hartkamer in de ontwikkeling van de zebravis omvatten voornamelijk radiale gliacellen en neuronale voorlopercellen, die een veranderde chromatine staat dan meer gedifferentieerde cellen kunnen weerspiegelen. Stamcellen in weefsel algemeen vrij zeldzaam, nanotomy weefsel labeling voor stamcel markers met weefsel schaal EM kan dus worden gebruikt om ultrastructurele eigenschappen van stamcellen te identificeren correleren.
ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Grootschalige EM (www.nanotomy.org) van een coronale sectie in een zebravis larve neuronale ablatie ondergaat onthult veel specifieke weefsels en cellulaire en moleculaire kenmerken niet gevonden in de controle dieren. Cellulaire functies omvatten fagocytische microglia en vacuolen van de grootte van de cellen, waarschijnlijk die stervende cellen (Figuur 2B, www.nanotomy.org). Vorige EM studies hebben vastgesteld microglia in gewervelde dieren 18,19. Karakteristieke kenmerken van microglia omvatten langwerpige kernen , massa's van fragmentarisch chromatine naast de nucleaire envelop, prominent Golgi-apparaat, gratis polyribosomen, korrelig endoplasmatisch reticulum (ER) met lange smalle cisternae, relatief donker / dichte cytoplasma, en tal van insluitsels, zoals phagosomes, vetdruppels en lysosomen. Al deze kenmerken, toegeschreven aan microglia in zoogdierlijke weefsels werden ook gevonden in deze cellen in de zebravis hersenen (Figuur 2B, www.nanotomy.org). <p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figuur 1: Workflow van grootschalige Tissue Electron Microscopy op zebravis Brains. (A) 7 dagen oude zebravis larven. (B) zebravis larvale kop ingebed naast elkaar in epoxyhars. (C) Glas mes voor semi-dunne snijden en oriënteren van het monster. (D) Representatieve semithin toluidine blauw gekleurde coupe toont twee side-by-side ingebedde zebravis larven. (E) Diamond mes om ultradunne (70 nm) coupes. (F) Uitgegeven afbeelding (D) van volledige zebravis larven hersenpreparaat op één gat raster om de positionering te geven. (G) microscopie systeem dat wordt gebruikt voor grootschalige 2D EM in dit onderzoek. (H) Stroom van beeldverwerking. klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 2: Nanotomy. Resultaten: Van de macromolecule weefsel (A) Nanotomy van hersenen van 7 dagen na de bevruchting controle en (B) behandeld (neuronale ablatie; figuur 1), met specifieke kenmerken van het neuronale geablateerd degeneratieve hersenen (B) De volgende omvatten fagocytische microglia, donkere cellen celdood en sponsachtig uiterlijk van zenuwweefsel ((A) en (B)) ondergaan. Bovenste panelen (aangepast van 5): 10x vergroting van het gebied aangegeven in het midden panelen. Midden-panelen: 10x vergroting van het gebied aangegeven in onderste panelen. (A, middelste paneel) Hoge vergroting uitzicht op neuropil toont synaps in (A, onderste paneel), synaptische blaasjes (SV) enpostsynaptische dichtheid (PD). (B, Middenpaneel) Hoge vergroting Gezien amoeboid microglia of eventueel een macrofaag (middenpaneel, M) met typische amoeboid microgliale kenmerken (onderste paneel) zoals opvallende Golgi (G), insluitsels zoals lysosomale vacuolen (L). Schaalbalken: 50 pm (top), 5 urn (midden) en 0,5 urn (onder). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken , of bezoek de volledige gegevens online (nanotomy.org).
Discussion
EM maakt analyse van de cellulaire context met hoge resolutie beeldvorming van macromoleculen in biologische context. Nochtans beperkt dit typisch het gezichtsveld. Grotere schaal 3D EM is in het bijzonder geschikt voor het in kaart brengen van neuronale verbindingen door het creëren nanoschaal resolutie 3-dimensionale reconstructies, vereisen complexe gegevensverwerking 10. Daarentegen 2D grootschalige EM vereist slechts één sectie en stikken van de beeldgegevens, en evaluatie van de gegevens kan door iedereen met toegang tot een internetbrowser. Wij en anderen voorheen grootschalige EM weefsels en gehele dieren analyseren. Zoals voor de meeste benaderingen, TEM en SEM-gebaseerde stitching hebben hun eigen voordelen. Hier, scanning transmissie EM (STEM) werd gebruikt die generatie van een groot gezichtsveld maakt het mogelijk met een hoge resolutie. Kenmerkend beeld een STEM is gelijk aan het gezichtsveld van ongeveer 100 TEM beelden aanzienlijk verminderen van de hoeveelheid stiksel bij beeldvorming grote fields gezien met een hoge resolutie. Als hogere resolutie vereist is, kunnen TEM voordelig zijn. STEM heeft het voordeel boven TEM dat niet-contrast monsters kunnen worden gebruikt met goede ultrastructurele contrast 6.
Daarnaast kan de hier beschreven werkwijze eenvoudig worden aangepast voor gebruik met terugverstrooide elektronen detectie (BSD) op gedeelten aangebracht op silica wafers, bredere inzet van meerdere microscoopsystemen. HTML-zoomable weefsel EM-bestanden zijn zeer nuttig voor het kwantificeren, het delen van gegevens die niet zijn geanalyseerd om de volledige inhoud, een combinatie van LM en EM data (CLEM) 8, presentatie doeleinden in het wetenschappelijk onderzoek naar de patiënt te analyseren en voor het onderwijs. Als alternatief, in grootschalige EM in een SEM, maar niet in een TEM, silica wafers kunnen worden gebruikt, waarbij twee voordelen heeft: BSD kan worden gebruikt, die meer in het algemeen op rasterelektronenmicroscoop dan STEM detectie. Ten tweede, de montage van grote delen (> 1 mm 2 gebieden vanrente) is eenvoudig. Montage op enkele sleuven grids is arbeidsintensief en technisch uitdagend. Gedetailleerde vergelijking tussen TEM, SEM en STEM wordt elders 6 gedetailleerd. Een nadeel van BSD beeldvorming is dat, in vergelijking met STEM, afbeeldingen zijn toegenomen lawaai. Dit kan ten dele worden gecompenseerd door verhoging van de pixel verblijftijd resulteert in veel langere opnametijden.
Hoewel voor de monstervoorbereiding relatief standaard EM verwerking (fixatie, inbedden en snijden) nodig 5-7 is het technisch moeilijk om grote ultradunne coupes totaal geen artefacten gesneden. Secties zijn erg kwetsbaar, gemakkelijk breken, vouwen of worden vernietigd tijdens de beeldvorming, die doorgaans duurt meerdere uren per dataset. Vanwege het online delen van de ruwe onpartijdige data, zou het mogelijk worden om gemakkelijker te vergelijken met gepubliceerde gegevens en gebruik dataset gepubliceerd in het open domein als controles. Op dit moment, enkele EM-apparaten in staat laRGE-schaal analyse in gebruik zijn, en dus de toegankelijkheid van deze techniek is enigszins beperkt, hoewel de meeste imaging centra gezamenlijke inspanningen van harte welkom.
Voor grootschalige luiken bevat weefsel door het monster goed zijn bevestigd. Daarom is een mengsel van de snelle maar matige PFA fixatief wordt gebruikt in combinatie met de langzame maar sterk fixeermiddel GA. Snijden en het oppakken van grote delen zonder artefacten is moeilijk. Werken met wafels in combinatie met BSD is eenvoudiger in vergelijking met het verzamelen van hoofdstukken over een gat grids. Heavy metal na kleuring is kritischer ten opzichte van de klassieke EM. Omdat de hele sectie wordt afgebeeld zullen elke artefact zichtbaar. TEM gebruikers vinden meestal moeilijk om naar een SEM, vanwege het verschil in werking microscoop.
Kwantificering en delen van gegevens - Het kwantificeren van subcellulaire kenmerken is moeilijk in enkele EM beelden. De mogelijkheid om in en uit te zoomen op grote schaalbeelden maakt gemakkelijk identificatie van cellen van belang, dat kan worden gevolgd door nanoschaal metingen in de cellen. Deze datasets geven aan dat specifieke celtypen kunnen snel worden geïdentificeerd en gekwantificeerd onpartijdige wijze in deze grote weefselcoupes, gebaseerd op kenmerken detecteerbaar verschillende schalen. Bijvoorbeeld microglia kunnen worden geïdentificeerd op basis van hun morfologie en dichte cytoplasma. Vervolgens, na het inzoomen op de afzonderlijke cellen, nanoschaal subcellulaire en moleculaire kenmerken van deze cellen kan worden gemeten in dezelfde dataset, zoals we eerder toonden voor ER breedte binnen een grootschalig EM weefselkweek dataset 2. Een bijkomend voordeel van nanotomy is dat de hosting van grootschalige datasets online zal toestaan dat anderen de gegevens, misschien voor andere functies te inspecteren, en hun conclusies te trekken over nieuwe hypothese.
CLEM - Naast het faciliteren van kwantitatieve EM, grootschalige EM maakt het makkelijker om het licht Micr correlerenpic etikettering EM level 8. In het onderhavige voorbeeld de aanwezigheid van fagocyterende microglia in een zebravis ablatie model weergegeven. Een belangrijke vraag in de neurowetenschappen is wat de afzonderlijke functies en de bijdragen van microglia en mogelijke andere bronnen van fagocytische en immuuncellen. Vroege EM studies hebben aangetoond subcellulaire onderscheidende kenmerken van microglia ziekte 18. Helaas is het moeilijk om selectief labelen microglia met name in een pathologische omgeving, omdat zij grote overlap met andere immuuncellen in genexpressie, morfologie en functie vertonen. Daarom is het onduidelijk of en wanneer microglia op het ultrastructurele niveau verschillen van immuuncellen uit andere bronnen, waaronder monocyten afgeleide infiltrerende macrofagen. Begrijpen of er ultrastructurele verschillen tussen deze cellen uitgangspunt voor analyse van functionele verschillen toe. De combinatie van selectieve transgene of expressie merkers en CLEM maakt detectie van ultrastructurele functies selectief aan specifieke bevolkingsgroepen.
Diagnose & presentatie en onderwijs - Door het visualiseren van nanoschaal tot microschaal binnen één dataset EM data wordt aanzienlijk vergemakkelijkt voor een breed publiek. Met de toegenomen mogelijkheden en instrumenten voor correlatieve en grootschalige EM verwachten we een herleving van EM in fundamenteel en medisch onderzoek. Onze methode hier voorgesteld wordt toegevoerd aan een zebravis hersentraumamodel 5, maar is gebruikt op menselijk weefsel 7, rattenhersenen 3, in een diermodel voor diabetes 4 en in celkweek 2, en kan ook worden gebruikt in combinatie met een TEM gebaseerde benadering 1 toont de veelzijdigheid van deze methode. De microscoop operator is niet meer de opname sterk geselecteerd, en dus bevooroordeeld beelden, maar al talrijke ultrastructurele functies worden geregistreerd en geopend voor de wereldwijde analyse.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De meerderheid van het werk is uitgevoerd op het UMCG Microscopie en Imaging Center (UMIC), die wordt gesponsord door NWO en ZonMW 175-010-2009-023 91.111.006; STW "Microscopie Valley 12718" naar BNGG. Dit werk werd gesponsord door een ZonMW VENI-subsidie, een Marie Curie carrière integratie subsidie (besparing stervende neuronen) en een Alzheimer Nederland fellowship aan TJvH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| low melting point agarose | VWR | 444152G | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| triton-X-100 | Sigma | X100 | |
| glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
| sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
| osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
| potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
| ethanol | VWR | 20821.365 | |
| uranyl acetate | Merck | 8473 | |
| sodium tetraborate | Merck | 1063808 | |
| toluidene blue | Merck | 1273 | |
| basic fuchsin | BDH | 340324 | |
| lead citrate | BDH | discontinued | |
| EPON | |||
| 2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
| methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
| glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
| DMP-30 | Polysciences | 553 | |
| standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
| diamond knife | Diatome Inc. | ||
| copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
| double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
| scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
| ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
| atlas external scan generator | Fibics |
References
- Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
- Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
- Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
- van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
- Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
- Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
- Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
- van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
- Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).
