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Developmental Biology

बड़े पैमाने पर स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (Nanotomy) स्वस्थ और घायल Zebrafish मस्तिष्क की

Published: May 25, 2016 doi: 10.3791/53635
Automatic Translation
1, 1, 1, *2, *1
1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally

Abstract

बड़े पैमाने पर 2 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), या nanotomy, nanoscale संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के ऊतक चौड़ा आवेदन पत्र है। दूसरों के लिए और हम पहले से मानव त्वचा अग्नाशय टापू, टिशू कल्चर और पूरे zebrafish लार्वा 1-7 करने के लिए बड़े पैमाने पर ईएम लागू होता है। यहाँ हम उप सेलुलर और आणविक सुविधाओं की निष्पक्ष जांच के लिए ऊतक पैमाने पर स्कैनिंग ईएम के लिए एक सार्वभौमिक रूप से लागू विधि का वर्णन है। Nanotomy स्वस्थ और एक neurodegenerative zebrafish मस्तिष्क की जांच करने के लिए लागू किया गया था। हमारे विधि मानकीकृत ईएम नमूना तैयार प्रोटोकॉल पर आधारित है: फिक्सेशन glutaraldehyde और आज़मियम साथ, epoxy राल embedding द्वारा पीछा किया सेक्शनिंग और एक छेद ग्रिड पर ultrathin वर्गों, uranyl और नेतृत्व के साथ पोस्ट धुंधला द्वारा पीछा के बढ़ते ultrathin। बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम पच्चीकारी छवियों को एक स्कैनिंग ईएम स्कैनिंग संचरण ईएम (स्टेम) का उपयोग कर एक बाहरी बड़े क्षेत्र स्कैन जनरेटर से जुड़ा का उपयोग कर हासिल किया है। 50 जी पिक्सल मैं - बड़े पैमाने ईएम छवियों आमतौर पर ~ 5 हैंn आकार, और सबसे अच्छा zoomable एचटीएमएल फ़ाइलें, जो किसी भी वेब ब्राउज़र में खोला जा सकता है, ऑनलाइन भौगोलिक HTML नक्शे के लिए इसी तरह का उपयोग करके देखा। इस विधि (मानव) ऊतक, पूरे जानवरों के पार वर्गों के साथ-साथ टिशू कल्चर 1-5 के लिए लागू किया जा सकता है। इधर, zebrafish दिमाग एक गैर इनवेसिव न्यूरोनल पृथक मॉडल में विश्लेषण किया गया। हम एक ही डाटासेट ऊतक, सेलुलर और subcellular परिवर्तन जो न्यूरॉन्स और microglia, मस्तिष्क की मैक्रोफेज सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के भीतर कल्पना। इसके अलावा, nanotomy, एक ही ऊतक पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी (क्लेम) के साथ ईएम के सहसंबंध 8 की सुविधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में बड़े सतह क्षेत्रों में पहले से imaged, बाद में की नैनो शरीर रचना विज्ञान (nanotomy) में जिसके परिणामस्वरूप, बड़े क्षेत्र ईएम के अधीन किया जा सकता है ऊतकों। सभी में, nanotomy एक ऊतक विस्तृत मात्रात्मक तरीके से ईएम स्तर पर सुविधाओं की निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

Introduction

हाल ही में तकनीकी विकास बहुमुखी प्रतिभा, प्रयोज्यता और ईएम के मात्रात्मक प्रकृति में सुधार हुआ है, Ultrastructural विश्लेषण की एक पुनरुद्धार के लिए अग्रणी। अग्रिम सीधे ईएम स्तर 8-10 के लिए सूक्ष्म विश्लेषण के अन्य साधनों की तुलना करने के लिए 3 डी ईएम, बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम और बेहतर तरीके और सहसंबद्ध प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्लेम) के लिए अभिकर्मकों शामिल हैं। बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम विशेष रूप से यों या (उपन्यास) मानव विकृति के लिए रोग सुविधाओं की पहचान, बीमारी और टिशू कल्चर मॉडल के लिए पशु मॉडल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। देखने के लिए आम तौर पर छोटे से क्षेत्र के कारण यह एक ऊतक व्यापक पैमाने पर करने के लिए उच्च वृद्धि पर परिवर्तन सहसंबंधी, साथ ही unbiasedly और मात्रात्मक ultrastructural सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है।

मानव ऊतक या पशु मॉडल में विकृति का मूल्यांकन, haematoxylin और eosin (एच एंड ई) रंग formaldehyde तय एम्बेडेड आयल के वर्गों (FFPE) आज़ादी के रोग विश्लेषण के लिएमुकदमा मानक है। सरल इसके अलावा एच एंड ई धुंधला immunolabeling भी रोग असामान्यताएं की पहचान के लिए किया जाता है। इस तरह के ऊतकों ईएम स्तर, विशेष प्रकार की कोशिकाओं में विश्लेषण किया जा सकता है, और subcellular परिवर्तनों की पहचान की जा सकती है। बड़े पैमाने पर ईएम की निष्पक्ष प्रकृति रोग की अप्रत्याशित और उपन्यास सुविधाओं को खोजने के लिए अनुमति देता है। बड़े पैमाने पर रखकर वर्ग मिलीमीटर ईएम क्षेत्रों को देखे जा सकते हैं। हम और दूसरों को पहले से अग्नाशय टापू 4 चूहे के लिए nanotomy, सेल संस्कृति 2, 3 चूहे के मस्तिष्क, त्वचा और म्यूकोसा 7 और पूरे zebrafish लार्वा 1,5 (www.nanotomy.org) लागू होता है। Zebrafish में vivo इमेजिंग के लिए अत्यधिक उपयुक्त है, विशेष रूप में सेल प्रकार जो मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं 11 सहित स्तनधारी ऊतकों में उपयोग करने के लिए मुश्किल हो जाता है कल्पना करने के लिए कर रहे हैं। यहाँ nanotomy प्रक्रिया में विस्तार से वर्णन किया गया है, न्यूरोनल द्वारा metronidazole के रूपांतरण द्वारा सशर्त न्यूरोनल पृथक दौर से गुजर zebrafish सिर के राज्याभिषेक वर्गों के लिए लागूव्यक्त nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14। सभी कच्चे डेटा zoomable HTML फ़ाइलों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, ऊतक पैमाने पर परिवर्तन करने के लिए आणविक visualizing। कच्चे डेटा की प्रस्तुति के लिए दुनिया भर के विशेषज्ञों द्वारा अन्य कोणों से डेटासेट का निष्पक्ष विश्लेषण की अनुमति देता है।

Protocol

zebrafish लार्वा के साथ सभी प्रयोगों राष्ट्रीय और यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार ग्रोनिंगन विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. नमूना तैयार

  1. फिक्सेशन और एम्बेडिंग
    1. फिक्सेशन
      1. Tricaine (0.003%) में मछली के लार्वा चतनाशून्य धीरे poking द्वारा E3 (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4, 10 मिमी HEPES, पीएच 7.6) zebrafish पानी और संज्ञाहरण की गहराई के लिए परीक्षण करने के लिए जोड़ा विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक 200 μl विंदुक टिप के साथ गति नहीं रह पाया जाता है जब तक (चित्रा 1 ए)।
      2. 1.8% में agarose के रूप में वर्णित confocal या 2 फोटॉन इमेजिंग का उपयोग vivo इमेजिंग डेटा में प्राप्त करने के बाद correlative ईएम के लिए नमूने संसाधित करते समय, agarose में 5,15 तय लार्वा पीबीएस में 4% पीएफए ​​का उपयोग कर ट्राइटन X-100 (0.05%) शामिल हैं।
      3. agarose और के लिए प्रक्रिया से लार्वा कटबड़े पैमाने पर ईएम 5।
      4. पीबीएस में ताजा 4% paraformaldehyde प्लास्टिक ट्यूब में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ट्राइटन X-100 (0.05%) युक्त में लार्वा को ठीक करें।
        नोट: संस्कृति में विकसित कोशिकाओं (इन विट्रो) सीधे अगले कदम (1.1.1.5) में वर्णित है, glutaraldehyde में तय किया जा सकता है।
      5. समाधान निकालें और 100 μl 0.5% पीएफए, 2% glutaraldehyde (जीए), और 0.1 एम सोडियम cacodylate (7.4 पीएच) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर। नमूने कुल्ला दो बार 0.1 एम सोडियम cacodylate में।
      6. hindbrain को rostrally लार्वा सिर काट आज़मियम के प्रवेश की सुविधा के लिए। ठीक सीरिंज / संदंश का प्रयोग करें।
      7. 1% आज़मियम tetroxide में पोस्टफिक्स लार्वा (Oso 4) 2 घंटे के लिए पोटेशियम ferrocyanide (कश्मीर 4 [फे (सीएन) 6]) बर्फ पर 0.1 एम सोडियम cacodylate में /1.5% और डबल आसुत एच 2 ओ में कुल्ला 3 एक्स 5 मिनट
      8. इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में 20 मिनट incubations (50%, 70%, 3 बार 100%) से इथेनॉल में निर्जलीकरण।
    2. एम्बेड
      1. ईएम प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल मानक व्यंजनों के अनुसार epoxy राल तैयार करें।
        नोट: हम के रूप में epoxy राल का उपयोग करें: मिश्रण 19.8 छ glycid ईथर 100, 9.6 जी 2-dodecenylsuccinic एसिड एनहाइड्राइड और 11.4 छ methylnadic एनहाइड्राइड एक चुंबकीय उत्तेजक का उपयोग कर। 0.5 ग्राम DMP-30 (tris- (dimethylaminomethyl) फिनोल) जोड़ें और फिर मिश्रण।
      2. इथेनॉल में 50% epoxy राल में लार्वा रातोंरात सेते (वी / वी) जबकि घूर्णन (आरटी)।
      3. शुद्ध राल से पतला epoxy राल बदलें। 30 मिनट के लिए सेते ताजा राल फिर से जोड़ सकते हैं और एक और 30 मिनट के लिए सेते हैं। फिर राल ताज़ा और फिर आरटी पर 3 घंटा, 58 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए और कम दबाव (200 मिलीबार) के तहत आरटी पर एक और 1 घंटा से पीछा सेते हैं।
      4. एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन फ्लैट एम्बेडिंग नए नए साँचे में सिर ओरिएंट एक सुई का उपयोग या पूर्वकाल मोल्ड के रूप में की जरूरत है या पक्ष का सामना करना पड़ के साथ दंर्तखोदनी (चित्रा 1 बी)।
      5. भाजन epoxy res58 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में। epoxy राल है, तो अभी भी बहुत नरम एक और दिन भाजन और 58 डिग्री सेल्सियस पर कड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं। संदंश का उपयोग कर लागू करने का दबाव द्वारा टेस्ट कठोरता। यह आसानी से एक खरोज एक और दिन भाजन और 58 डिग्री सेल्सियस पर कड़ा करने के लिए अनुमति देते हैं छोड़ देता है। trimming और सेक्शनिंग करने के लिए आगे बढ़ना जब नमूना पूरी तरह से कठोर है।
      6. ठूंठ का उपयोग कर रेज़र ब्लेड (चित्रा 1 बी) से अतिरिक्त राल दूर ट्रिम।
  2. , सेक्शनिंग विषम, और बढ़ते
    1. सेक्शनिंग
      1. धारा epoxy राल ब्लॉक एक ultramicrotome का उपयोग कर।
      2. एक गिलास चाकू या एक हीरे histoknife toluidine नीले / बुनियादी fuchsin के लिए semithin वर्गों (500 एनएम) में कटौती करने के लिए उपयोग करें (चित्रा -1) सही स्थिति का पता लगाने के लिए धुंधला हो जाना।
      3. स्थानांतरण अर्द्ध पतली एक गिलास पाश्चर pipet जिसका टिप एक लौ में पिघलने द्वारा बंद कर दिया गया है के साथ उन्हें उठा द्वारा सूक्ष्म स्लाइड पर वर्गों। एक गर्म थाली यू पर सूखीntil पानी नहीं रह गया है। एक गर्म थाली पर पानी में 1% toluidine नीले रंग के साथ 10 सेकंड के लिए और 1% सोडियम tetraborate में 0.05% बुनियादी fuchsin के साथ 10 सेकंड के लिए पानी, दाग के साथ rinsing के बाद दाग। 40X 10X करने पर एक सामान्य प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ जांच करते हैं।
      4. जब उचित साइट / मस्तिष्क के भीतर उन्मुखीकरण तक पहुँच जाता है, ultrathin वर्गों में कटौती करने के लिए एक हीरे की चाकू के साथ epoxy राल ब्लॉक सेक्शनिंग जारी रखें (~ 70 एनएम, चित्रा 1E)
      5. में और मस्तिष्क के आसपास आसानी से पहचाना शारीरिक संरचनाओं का प्रयोग करें, घ्राण गड्ढ़े, आंखें, ग्रे, सफेद पदार्थ सीमाओं सहित, सेक्शनिंग ultrathin के दौरान ब्याज की क्षेत्र की पहचान करने के लिए और जब नमूना झुका हुआ है सेक्शनिंग कोण समायोजित करने के लिए।
      6. एक स्लॉट एल 2 एक्स 1 तांबे ग्रिड (चित्रा 1F), पर माउंट खंड ग्रिड सलाखों से निरंतर अधिग्रहण की अनुमति है। Formvar प्रयोग लेपित ग्रिड वर्गों का समर्थन है।
    2. विषम
      1. ग्रिड पर दाग ultrathin वर्गोंरेनॉल्ड्स द्वारा पीछा किया मेथनॉल में 2% uranyl एसीटेट में 2 मिनट के लिए एक और 2 मिनट 16 के लिए साइट्रेट का नेतृत्व।

2. छवि अधिग्रहण

  1. बड़े पैमाने पर स्टेम
    नोट: हम एक बाहरी जनरेटर स्कैन उच्च संकल्प 3,5,7,17 ​​पर देखने के कई बड़े क्षेत्रों प्राप्त स्टेम पता लगाने का उपयोग करने में सक्षम के साथ स्कैनिंग ईएम का उपयोग करें। आमतौर पर, एक छवि उत्पन्न इस तरह से ~ 100 संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (मंदिर) छवियों के देखने के क्षेत्रों के बराबर है, काफी सिलाई की राशि को कम करने।
    1. माइक्रोस्कोप में नमूना बढ़ते
      1. कई ग्रिड नमूना धारक में अनुभाग के साथ ग्रिड रखें और SEM के कक्ष में स्थानांतरित।
    2. स्टेम डिटेक्टर के संरेखण
      1. किरण के तहत नमूने के साथ ग्रिड रखो और इसे ऊपर ले जाएँ तो यह लगभग होगी। लेंस पोल से 5 मिमी। 20 केवी पर एक छवि का उपयोग करते हुए मोलमें लेंस डिटेक्टर।
      2. ग्रिड किनारे पर ध्यान दें और 4.0 मिमी के लिए काम कर दूरी समायोजित करें।
      3. एक सुरक्षित स्थान के लिए नमूना धारक ले जाएँ और स्टेम डिटेक्टर में लाने के लिए।
      4. में लेंस डिटेक्टर के साथ अधिकतम गति से समायोजन शिकंजा जबकि इमेजिंग मोड़ से छवि क्षेत्र में स्टेम डिटेक्टर के छेद केंद्र।
      5. ध्यान से वापस नमूना धारक जो सिर्फ लेंस ध्रुव और डिटेक्टर के बीच फिट होगा लाने के लिए।
      6. में लेंस डिटेक्टर के साथ एक छवि प्राप्त खंड क्षेत्र पर होना सुनिश्चित करने के लिए।
      7. स्विच का पता लगाने (लाभ मध्यम और सभी quadrants 'शून्य' पर सेट) स्टेम करने के लिए और एक छवि हासिल करने और क्षेत्र स्कैन करने के लिए चयन करें।
      8. 21 केवी त्वरण वोल्टेज बढ़ाने के लिए और फिर से (स्थिर छवि) बीम के स्थिरीकरण के लिए प्रतीक्षा करें और फिर 2 केवी के चरणों में 29 केवी के पास जाओ।
    3. छवियों को प्राप्त करने
      1. नमूना पूर्व चमकाना जूमिंग से (ई-बीम की वजह से चमक परिवर्तन को रोकने के लिए)तो पूरा क्षेत्र स्कैन करने के लिए बाहर छवि खिड़की फिट बैठता है।
      2. (उचित गतिशील रेंज डिटेक्टर लाभ एक कदम कम किया जा सकता है रखने के लिए) 120 माइक्रोन तक एपर्चर बदलने के।
      3. डी-ध्यान इतना छवि धुंधला है।
      4. कम कर क्षेत्र स्कैन विकल्प का उपयोग कर स्कैन क्षेत्र के रूप में संभव के रूप में तंग करते हैं।
      5. स्कैन गति सेट करें कि इस तरह के एक फ्रेम लगभग में जांच होती है। 1 - 2 सेकंड।
        नोट: आकार और ऊतक पर निर्भर करता है कि यह आम तौर पर 3 घंटा (1000 x 500 माइक्रोन) तक के लिए लेता है आधा घंटा (100 x 100 माइक्रोन FOV)।
      6. कम से कम 100X पर में ज़ूम और 10 सेकंड के लिए एक छोटे से क्षेत्र स्कैन।
        नोट: इस क्षेत्र के लिए उसके आसपास, पूर्व विकिरण के लिए पर्याप्त है की तुलना में चमक परिवर्तन नहीं करता है।
      7. वापस 30 माइक्रोन एपर्चर लाओ (और मध्यम पर लाभ स्टेम)
      8. नमूना ध्यान दें।
      9. (~ 40,000X बढ़ाई) wobbler का प्रयोग एपर्चर संरेखित करें।
      10. जबकि ध्यान में सबसे हल्का क्षेत्र / सुविधा का चयन, स्कैन गति सेट कि इस तरह के विवरणदिखाई दे रहे हैं।
      11. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में ध्यान से देख रहा है हिस्टोग्राम गतिशील रेंज में सभी पिक्सल रखने के द्वारा चमक और विपरीत समायोजित करें। अंधेरी क्षेत्र / सुविधाओं के लिए एक ही मत करो।
      12. वापस उज्ज्वल क्षेत्र में जाना और फिर से जाँच करें। सुरक्षित पक्ष पर होना तो वहाँ हिस्टोग्राम के दोनों किनारों पर कुछ जगह।
      13. बाहर ज़ूम करें जिससे पूरा क्षेत्र स्कैन करने के लिए इमेजिंग खिड़की फिट बैठता है, और बड़े क्षेत्र अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू करते हैं।
      14. स्क्रीन से एक क्षेत्र का चयन करके एक पच्चीकारी की स्थापना करने के लिए विज़ार्ड विकल्प का उपयोग करें। उपयोग पिक्सेल आकार 2 - 5 क्या विवरण आवश्यक हैं पर निर्भर करता है एनएम। स्टेम के लिए ध्यान केन्द्रित समय का उपयोग करें 3 μs।
      15. विकल्प का चयन करें "पिछले टाइल पर ऑटोफोकस", डिफ़ॉल्ट कंपनी सेटिंग्स के साथ बड़े पैमाने पर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग ऑटोफोकस चेक बॉक्स "निष्पादन करने से पहले सेटिंग की जाँच करें" और परिभाषित जहां डाटा को बचाने के लिए।
      16. प्रेस "अनुकूलन" माइक्रोस्कोप सेटिंग्स की जाँच करने के लिए।
        नोट: अब समय की जरूरत होगी शखुद। यह ऊपर 1 एक्स 0.5 मिमी क्षेत्रों के लिए 72 घंटा के लिए हो सकता है।
      17. खिड़की "अधिकतम टाइल संकल्प" प्रकार में 20,000 इसलिए व्यक्तिगत टाइल्स से बड़ा 20k एक्स 20k नहीं होगा, कुंद बढ़त प्रभाव को रोकने। प्रेस "अमल"।
      18. जब ध्यान केंद्रित करने और चमक / विपरीत (बी / सी) की जाँच के लिए पूछा, बाहरी जनरेटर स्कैन बंद कर और ध्यान से खुर्दबीन के सॉफ्टवेयर में ध्यान केंद्रित करने और दृष्टिवैषम्य समायोजित करें। बी / सी मत बदलो।
        नोट: चरण के लिए ले जाया जा सकता है और बढ़ाई बदल गया है, लेकिन बढ़ाई वापस वांछित पिक्सेल आकार करने के लिए स्थापित किया जाना है।
      19. फिर बाहरी जनरेटर स्कैन पर स्विच और प्रेस "जारी रखने के लिए"।

3. डेटा विश्लेषण

  1. बड़े पैमाने पर ईएम फ़ाइल दर्शक कार्यक्रम खोलें और फ़ाइल "मूसा की जानकारी" खुला। यह सभी टाइलों TIF फ़ाइलें खुल जाएगा। इस अधिमानतः नए अधिग्रहण नहीं बाधा डालती के लिए एक और वर्कस्टेशन पर किया जाता है।
  2. विकल्प 'Au चुनेंपूरे पच्चीकारी सिलाई के लिए (पैरामीटर आधे पर मोड ओवरलैप करते हैं, सीमा 0.90, शोर में कमी स्वत: सिलाई। मामले सिलाई मापदंड में में पूरा नहीं किया जा सकता, जूम और मैन्युअल स्थिति में टाइल जगह है और 'के रूप में जारी' पर क्लिक करें)।
  3. एक HTML फ़ाइल के रूप में निर्यात, या वैकल्पिक रूप से एक भी TIF के रूप में।
    नोट TIF के लिए निर्यात कि एक आकार घटाने की जरूरत हो सकती है। फ़ाइल का नाम बाद में माप सक्षम में अंतिम पिक्सेल आकार शामिल हैं।
  4. एक छवि संपादन प्रोग्राम में इसे खोलने के द्वारा TIF फ़ाइल में एनोटेशन प्रदर्शन करना। समानांतर में, इष्टतम संकल्प अवलोकन के लिए एक वेब ब्राउज़र में zoomable HTML फ़ाइल को खोलने के।

Representative Results

1 सप्ताह पुराने zebrafish लार्वा के सिर के राज्याभिषेक वर्गों के बड़े पैमाने पर ईएम डाटासेट कई ऊतक और एक बड़े पैमाने पर छवि में सेलुलर सुविधाओं से पता चलता (www.nanotomy.org)।

नियंत्रण मस्तिष्क वर्गों के Nanotomy घ्राण फाइबर बंडलों, न्यूरोनल नाभिक और synapses सहित न्यूरोनल उप डिब्बों (चित्रा 2A, www.nanotomy.org) सहित व्याख्यान चबूतरे अग्रमस्तिष्क के तंत्रिका ऊतक के विशिष्ट ultrastructural सुविधाओं का पता चलता है। सिर में कोशिका प्रकार है कि प्रतिष्ठित किया जा सकता निचले जबड़े में बड़े रिक्तिकाएं, घ्राण तंत्रिका कोशिकाओं के osmiophilic माइलिन, एक छोटे पोत के endothelial कोशिकाओं, संरचनाओं meninx (तानिका के zebrafish समकक्ष, झिल्लीदार परत कोषस्थीकरण शामिल है के साथ chondrocytes शामिल स्तनधारी मस्तिष्क)। Subcellular संरचनाओं अलग सेल में एपिडर्मिस की glycocalyx, विभिन्न परमाणु morphologies और foci शामिल एल प्रकार के और अंगों Golgi उपकरण, जालिका (ईआर), माइटोकॉन्ड्रिया और synaptic vesicles और बाद synaptic घनत्व भी शामिल है।

अप्रत्याशित रूप से वेंट्रिकल अस्तर कोशिकाओं के नाभिक मस्तिष्क में अधिक laterally छितरी अन्य कोशिकाओं की तुलना में बहुत इलेक्ट्रॉन घने हैं। इसके अतिरिक्त, इन वेंट्रिकुलर नाभिक अंधेरे foci है कि मस्तिष्क में अन्य कोशिकाओं में अनुपस्थित रहे हैं और आकार और हेट्रोक्रोमैटिन, जो phagocytic microglia (चित्रा 2) के नाभिक में पाया जाता है से संरचना में अलग दिखाई देते हैं। zebrafish के विकास में वेंट्रिकल अस्तर कोशिकाओं ज्यादातर रेडियल glial कोशिकाओं और neuronal progenitors, जो अधिक विभेदित कोशिकाओं की तुलना में एक बदल क्रोमेटिन स्थिति को प्रतिबिंबित कर सकते हैं शामिल हैं। ऊतक में स्टेम कोशिकाओं को आम तौर पर काफी दुर्लभ हैं, nanotomy ईएम इसलिए स्टेम कोशिकाओं के Ultrastructural सुविधाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ऊतक पैमाने के साथ स्टेम सेल मार्कर के लिए ऊतक लेबलिंग सहसंबंधी।

ve_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> बड़े पैमाने पर एक zebrafish लार्वा न्यूरोनल पृथक दौर से गुजर में एक राज्याभिषेक अनुभाग के ईएम (www.nanotomy.org) कई विशिष्ट ऊतकों, और सेलुलर और आणविक सुविधाओं का पता चलता नहीं मिला नियंत्रण पशुओं में। सेलुलर सुविधाओं phagocytic microglia और कोशिकाओं के आकार रिक्तिकाएं, संभावना मर कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, www.nanotomy.org) का प्रतिनिधित्व शामिल हैं। पिछला ईएम अध्ययनों रीढ़ 18,19 में microglia की पहचान की है। microglia की विशेषता सुविधाओं लम्बी नाभिक में शामिल , लंबे संकीर्ण cisternae, अपेक्षाकृत अंधेरे / घने कोशिका द्रव्य, और जैसे phagosomes, लिपिड बूंदों और लाइसोसोम के रूप में कई समावेशन, के साथ परमाणु लिफाफा, प्रमुख Golgi उपकरण, नि: शुल्क polyribosomes, बारीक जालिका (ईआर) के बगल में बद क्रोमेटिन के झुरमुटों। इन सभी पहचान, स्तनधारी ऊतकों में microglia के लिए जिम्मेदार ठहराया है, यह भी zebrafish दिमाग में इन कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, www.nanotomy.org) में पाए गए।

<पी वर्ग = "jove_content" fo: रख-together.within-पेज = "1"> आकृति 1
चित्रा 1: Zebrafish दिमाग पर बड़े पैमाने पर ऊतक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के कार्यप्रवाह। (ए) 7 दिन पुरानी zebrafish लार्वा। (बी) Zebrafish लार्वा epoxy राल में कंधे से कंधा मिलाकर एम्बेडेड प्रमुख हैं। सेक्शनिंग और नमूना orienting पतली सेमीफाइनल के लिए (सी) ग्लास चाकू। (डी) के दो प्रतिनिधि दिखा semithin toluidine नीला दाग अनुभाग पक्ष द्वारा साइड zebrafish लार्वा एम्बेडेड। (ई) हीरे की चाकू Ultrathin (70 एनएम) वर्गों में कटौती करने के लिए। (एफ) एक छेद ग्रिड पर पूरे zebrafish लार्वा मस्तिष्क खंड में (डी) छवि एडिट स्थिति से संकेत मिलता है। (G) माइक्रोस्कोपी प्रणाली इस अध्ययन में बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम के लिए इस्तेमाल किया। (एच) इमेज प्रोसेसिंग का प्रवाह। कृपया यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
। चित्रा 2: Nanotomy परिणाम:। Macromolecule से ऊतक (ए) 7 दिनों के बाद निषेचन नियंत्रण और (बी) में इलाज के दिमाग की Nanotomy (न्यूरोनल पृथक, चित्रा 1), न्यूरोनल के लिए विशिष्ट सुविधाओं दिखा अपक्षयी मस्तिष्क ablated (ख) इन phagocytic microglia, अंधेरे कोशिकाओं कोशिका मृत्यु और तंत्रिका ऊतक ((ए) और (बी)) के स्पंजी उपस्थिति के दौर से गुजर शामिल हैं। ऊपरी पैनल (5 से अनुकूलित): क्षेत्र के 10X बढ़ाया देखने बीच पैनल में संकेत दिया। मध्य पैनल: क्षेत्र के 10X आवर्धित दृश्य कम पैनल में संकेत दिया। (ए, मध्यम पैनल) (ए, कम पैनल) में neuropil दिखा अन्तर्ग्रथन के उच्च बढ़ाई दृश्य, synaptic पुटिकाओं (SVs) औरपोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व (पीडी)। (बी, मध्यम पैनल) अमीबीय microglia या संभवतः एक बृहतभक्षककोशिका (मध्यम पैनल, एम) ठेठ अमीबीय microglial सुविधाओं (कम पैनल) प्रमुख Golgi उपकरण (G) सहित दिखाने का उच्च बढ़ाई दृश्य, लाइसोसोमल रिक्तिकाएं (एल) सहित समावेशन। स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन (ऊपर), 5 माइक्रोन (मध्य) और 0.5 माइक्रोन (नीचे)। यह आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें , या पूरा डेटा ऑनलाइन यात्रा (nanotomy.org)।

Discussion

ईएम जैविक संदर्भ में अणुओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ सेलुलर संदर्भ के विश्लेषण की अनुमति देता है। बहरहाल, यह आमतौर पर देखने के क्षेत्र को सीमित करता है। बड़े पैमाने पर 3 डी ईएम विशेष रूप से nanoscale संकल्प 3 आयामी पुनर्निर्माण बनाने, जटिल डाटा प्रोसेसिंग 10 की आवश्यकता द्वारा मानचित्रण न्यूरोनल कनेक्टिविटी के लिए उपयुक्त है। इसके विपरीत, 2 डी बड़े पैमाने पर ईएम केवल एक ही अनुभाग और इमेजिंग डेटा की सिलाई की आवश्यकता है, और डेटा के आकलन के एक इंटरनेट ब्राउज़र के उपयोग के साथ किसी के द्वारा संभव है। हम और दूसरों को पहले से बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया ईएम ऊतकों और पूरे जानवरों का विश्लेषण करने के लिए। सबसे दृष्टिकोण, मंदिर और SEM आधारित सिलाई के लिए के रूप में अपने फायदे हैं। इधर, स्कैनिंग संचरण ईएम (स्टेम) का इस्तेमाल किया गया था कि उच्च संकल्प पर देखने के एक बड़े क्षेत्र की पीढ़ी की अनुमति देता है। आमतौर पर, एक स्टेम छवि लगभग 100 मंदिर छवियों, काफी सिलाई की मात्रा को कम करने की दृष्टि से खेतों के बराबर बड़े महसूस जब इमेजिंग हैउच्च संकल्प पर देखने के डी एस। उच्च संकल्प की जरूरत है, मंदिर फायदेमंद हो सकता है। स्टेम मंदिर से अधिक लाभ है कि गैर-विषम नमूने अच्छा ultrastructural विपरीत 6 के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, विधि यहाँ वर्णित बस वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन का पता लगाने (बीएसडी) पर वर्गों सिलिका वेफर्स पर मुहिम शुरू की है, कई माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए उपयोग का विस्तार करने के साथ उपयोग के लिए समायोजित किया जा सकता है। एचटीएमएल zoomable ऊतक ईएम फ़ाइलों डेटा कि अपनी पूरी सामग्री के लिए विश्लेषण नहीं हो सकता है किया गया है, वैज्ञानिक अनुसंधान के क्षेत्र में एल एम और ईएम डेटा (क्लेम) 8, प्रस्तुति प्रयोजनों के संयोजन साझा करने, रोगी डेटा का विश्लेषण करने के लिए, और शिक्षा के लिए, मात्रा का ठहराव के लिए बहुत उपयोगी होते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक SEM में बड़े पैमाने पर ईएम में है, लेकिन एक मंदिर में नहीं, सिलिका वेफर्स इस्तेमाल किया जा सकता है, जो दो मुख्य फायदे हैं: बीएसडी इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आम तौर पर और अधिक का पता लगाने के स्टेम से स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध है। दूसरा, बड़े वर्गों (> 1 मिमी 2 क्षेत्रों के बढ़तेब्याज) सीधा है। एकल slotted ग्रिड पर बढ़ते श्रम गहन और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। मंदिर, SEM और स्टेम के बीच विस्तृत तुलना कहीं और 6 विस्तृत है। बीएसडी इमेजिंग का एक नुकसान यह है कि, स्टेम की तुलना में, छवियों शोर बढ़ गई है। यह आंशिक रूप से पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय बढ़ रही है, बहुत लंबे समय तक अधिग्रहण के समय में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है।

हालांकि नमूना तैयार अपेक्षाकृत मानक ईएम प्रोसेसिंग (निर्धारण, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग) के लिए 5-7 की जरूरत है, यह कलाकृतियों का पूरी तरह से रहित बड़े ultrathin वर्गों में कटौती करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। वर्गों बहुत कमजोर हैं, आसानी से तोड़, गुना या इमेजिंग, जो आम तौर डाटासेट प्रति एकाधिक घंटे लगते दौरान नष्ट कर रहे हैं। हालांकि, कच्चे निष्पक्ष डेटा की ऑनलाइन साझा करने की वजह से, यह संभव प्रकाशित आंकड़ों के और अधिक आसानी से की तुलना, और नियंत्रण के रूप में खुला डोमेन में प्रकाशित डाटासेट का उपयोग करने के लिए होना चाहिए। वर्तमान में, ला में सक्षम कुछ ईएम उपकरणोंrge पैमाने पर विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं, और इसलिए इस तकनीक को आकर्षित कुछ हद तक सीमित है, हालांकि ज्यादातर इमेजिंग केन्द्रों सहयोगात्मक प्रयासों का स्वागत करते हैं।

बड़े पैमाने पर वर्गों के लिए ऊतक ठीक से नमूना भर में तय किया जाना है। यही कारण है कि तेजी से लेकिन मध्यम लगानेवाला पीएफए ​​का एक मिश्रण धीमी लेकिन मजबूत लगानेवाला जीए के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाता है। काटना और कलाकृतियों के बिना बड़े वर्गों उठा मुश्किल है। बीएसडी के साथ संयोजन में वेफर्स के साथ काम करना एक छेद ग्रिड पर वर्गों इकट्ठा करने के लिए की तुलना में आसान है। भारी धातु पद धुंधला शास्त्रीय ईएम की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है। चूंकि पूरे खंड imaged है हर विरूपण साक्ष्य दिखाई जाएगी। मंदिर उपयोगकर्ताओं को आम तौर यह मुश्किल माइक्रोस्कोप ऑपरेशन में अंतर की वजह से, एक SEM के लिए स्विच करने लगता है।

मात्रा का ठहराव और डेटा साझा - subcellular सुविधाओं बढ़ाता ही ईएम छवियों में मुश्किल है। संभावना में और बड़े पैमाने के बाहर ज़ूम करने के लिएछवियों को आसानी से ब्याज की कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं के अंदर nanoscale माप के द्वारा पीछा किया जा सकता है की पहचान के लिए अनुमति देता है। ये डेटासेट संकेत मिलता है कि विशेष प्रकार की कोशिकाओं में तेजी से पहचाना जा सकता है और इन बड़े ऊतक वर्गों में एक निष्पक्ष ढंग से मात्रा निर्धारित है, अलग अलग पैमानों पर पहचाने जाने विशेषताओं के आधार पर। उदाहरण के लिए microglia उनकी आकृति विज्ञान और घने कोशिका द्रव्य के आधार पर पहचाना जा सकता है। बाद में, व्यक्ति की कोशिकाओं पर zooming पर, इन कोशिकाओं के nanoscale subcellular और आणविक सुविधाओं ही डाटासेट के भीतर, मापा जा सकता है जैसा कि हम पहले एक बड़े पैमाने पर ईएम टिशू कल्चर डाटासेट 2 के भीतर ईआर चौड़ाई के लिए दिखाया। nanotomy का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि बड़े पैमाने पर ऑनलाइन डेटासेट की मेजबानी कर दूसरों डेटा, शायद अन्य सुविधाओं के लिए निरीक्षण करने की अनुमति देगा, और नई परिकल्पना पर अपने निष्कर्ष निकालना है।

भूखों मरना - मात्रात्मक ईएम की सुविधा के अलावा, बड़े पैमाने पर उन्हें यह आसान प्रकाश microsco सहसंबंधी बनाता हैईएम स्तर से 8 पिक लेबलिंग। वर्तमान उदाहरण में एक zebrafish पृथक मॉडल में phagocytic microglia की उपस्थिति दिखाया गया है। तंत्रिका विज्ञान में एक बड़ा सवाल क्या व्यक्तिगत कार्यों और योगदान microglia और phagocytic और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संभावित अन्य स्रोतों से हो रहा है। प्रारंभिक ईएम पढ़ाई के रोग 18 में microglia की विशिष्ट subcellular सुविधाओं से पता चला है। दुर्भाग्य से, यह चुनिंदा एक रोग की स्थापना में विशेष रूप से microglia लेबल करने के लिए मुश्किल है, के रूप में वे जीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान और समारोह में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बड़े ओवरलैप दिखा रहे हैं। इसलिए, यह स्पष्ट नहीं है कि कब और ultrastructural स्तर पर microglia मैक्रोफेज घुसपैठ निकाली गई एककेंद्रकश्वेतकोशिका सहित अन्य स्रोतों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। समझ इन कोशिकाओं के बीच मतभेद ultrastructural कार्यात्मक मतभेदों के विश्लेषण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करेगा कर रहे हैं। चयनात्मक ट्रांसजेनिक या अभिव्यक्ति मार्कर का मेल और भूखों मरना Det की अनुमति देता हैultrastructural सुविधाओं के ection विशिष्ट आबादी के लिए चयनात्मक।

निदान और प्रस्तुति और शिक्षा - nanoscale visualizing के लिए एक एकल डाटासेट ईएम डेटा के भीतर microscale करके बहुत एक व्यापक दर्शकों के लिए मदद की है। correlative और बड़े पैमाने पर ईएम के लिए वृद्धि की संभावनाओं और उपकरणों के साथ हम बुनियादी और चिकित्सा अनुसंधान में ईएम की एक पुनरुद्धार की आशा। हमारे विधि यहाँ का प्रतिनिधित्व एक zebrafish मस्तिष्क की चोट 5 मॉडल को लागू किया जाता है, लेकिन मधुमेह 4 के लिए और सेल संस्कृति 2 में मानव ऊतक 7, चूहे के मस्तिष्क 3 पर इस्तेमाल किया गया है, एक चूहे मॉडल में, और यह भी एक मंदिर के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता आधारित दृष्टिकोण 1 इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा दिखा। माइक्रोस्कोप ऑपरेटर नहीं रह अत्यधिक चयन किया जाता है रिकॉर्डिंग, और इसलिए पक्षपातपूर्ण छवियों, लेकिन सभी कई ultrastructural सुविधाओं दर्ज की गई है और दुनिया भर में विश्लेषण के लिए खुले हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

काम के बहुमत UMCG माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर (UMIC), जो NWO 175-010-2009-023 और ZonMW 91111006 द्वारा प्रायोजित है पर प्रदर्शन किया गया है; STW "माइक्रोस्कोपी घाटी 12718" BNGG करने के लिए। यह काम एक ZonMW VENI अनुदान, मैरी क्यूरी कैरियर एकीकरण अनुदान (न्यूरॉन्स मर बचत) और TJvH करने के लिए एक अल्जाइमर नीदरलैंड फैलोशिप द्वारा प्रायोजित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

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References

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Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

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