Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Крупномасштабное Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Nanotomy) здоровых и оскорбленные данио мозга

Published: May 25, 2016 doi: 10.3791/53635
Automatic Translation
1, 1, 1, *2, *1
1Cell Biology, UMC Groningen, 2Clinical Genetics, Erasmus MC Rotterdam
* These authors contributed equally

Abstract

Крупномасштабное 2D электронной микроскопии (ЭМ), или nanotomy, является тканевым широкое применение резолюции наноразмерных электронной микроскопии. Другие и мы ранее примененные крупномасштабную EM кожным островков поджелудочной железы человека, культуры тканей и целом данио личинок 1-7. Здесь мы опишем универсально применимым методом тканевой шкалы сканирующей ЭМ для непредвзятого обнаружения суб-клеточных и молекулярных особенностей. Nanotomy был применен для исследования здоровых и нейродегенеративного данио мозг. Наш метод основан на стандартных протоколов подготовки образцов EM: Фиксирование с помощью глутаральдегида и осмия, а затем на основе эпоксидной смолы вложения, ультратонкие секционирования и монтаж ультратонких сечений на одной-дырочных сеток с последующим окрашиванием с помощью почтовой уранила и свинца. Крупномасштабные 2D EM мозаики изображения получены с помощью сканирования EM, соединенный с внешним генератором развертки большой площади с помощью EM передачи сканирования (STEM). Масштабные EM изображения, как правило, ~ 5 - 50 G пикселей Iп размер, и лучше всего просматривать с помощью масштабируемые HTML-файлы, которые можно открыть в любом веб-браузере, похожие на интернет-географических карт HTML. Этот метод может быть применен к (человеческой) ткани, сечениях целых животных, а также для культуры ткани 1-5. Здесь данио мозги были проанализированы в неинвазивной нейрональной модели абляции. Мы визуализации в рамках одного набора данных ткани, клеточных и субклеточных изменений, которые могут быть определены количественно в различных типах клеток, включая нейроны и микроглии, макрофагов мозга. Кроме того, nanotomy облегчает корреляцию ЭМ с световой микроскопии (CLEM) 8 на той же ткани, как и большие площади поверхности предварительно визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии, могут быть впоследствии подвергнуты большой площади ЕМ, в результате чего в нано-анатомии (nanotomy) из тканей. В целом, nanotomy позволяет непредвзятого обнаружение признаков на уровне EM в ткани масштабе количественному образом.

Introduction

Последние технические разработки улучшили универсальность, применимость и количественный характер EM, что привело к возрождению ультраструктурным анализа. Достижения включают 3D EM, крупномасштабные 2D EM и усовершенствованные способы и реагенты для коррелированных световой микроскопии и электронной микроскопии (Клем) для сравнения другие режимы микроскопического анализа непосредственно на уровень EM 8-10. Крупномасштабное 2D EM особенно подходит для количественного определения или идентификации (роман) признаки болезни для патологии человека, изучения животных моделей для болезней и тканевых культур моделей. Из-за обычно небольшого поля зрения трудно соотносить изменения при большом увеличении в ткани широких масштабах, а также и беспристрастно проанализировать количественно ультраструктурные особенности.

Для патологического анализа человеческой ткани или оценки патологии на животных моделях, гематоксилином и эозином (H & E) цветных секций формальдегида фиксированной парафином (FFPE) ТИСSue является стандартом. Помимо простых H & E окрашивание иммуномечение также проводится для выявления патологических отклонений. Если такие ткани могут быть проанализированы на уровне EM, специфические типы клеток и субклеточных изменения могут быть идентифицированы. Несмещенная характер крупномасштабного EM позволяет находить неожиданные и новые признаки болезни. Крупномасштабными можно визуализировать EM площадью до квадратных миллиметров. Мы и другие ранее примененные nanotomy крысы панкреатические островки 4, клеточная культура 2, 3 мозга крысы, кожи и слизистых оболочек 7 и весь данио личинок 1,5 (www.nanotomy.org). Данио очень хорошо подходят для работы с изображениями в естественных условиях, в частности , для визуализации типов клеток , которые трудно получить доступ в тканях млекопитающих , включая мозг клетки иммунной системы 11. Здесь процедура nanotomy описана подробно, применительно к корональных секций данио головок, проходящих условного нейронную абляции путем превращения метронидазола нейроннымивыразил нитроредуктаза (www.nanotomy.org) 5,12-14. Все исходные данные представлены в виде масштабируемой HTML-файлов, визуализации молекулярных до масштабных изменений тканей. Представление исходных данных позволяет беспристрастные анализ наборов данных из других углов экспертами по всему миру.

Protocol

Все эксперименты с данио личинок были одобрены экспериментирования животных комитета Университета Гронингена в соответствии с национальными и европейскими руководящими принципами.

1. Подготовка образцов

  1. Закрепление и встраивание
    1. фиксация
      1. Анестезировать личинок рыб в Tricaine (0,003%) добавляется к E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, 10 мМ HEPES, рН 7,6) данио воды и испытание для глубины анестезии тыкая осторожно не с 200 мкл кончика пипетки под микроскопом рассечение , пока движение больше не обнаруживается (рис 1А).
      2. При обработке образцов для корреляционного EM после получения в данных естественных изображений с помощью конфокальной или изображений 2 фотона в 1,8% агарозном , как описано, 5,15 личинки фикс в агарозе с использованием 4% PFA в ФБР , содержащем Triton-X-100 (0,05%).
      3. Вырезать личинок из агарозы и процессакрупномасштабная EM 5.
      4. Закрепить личинок в свежем 4% параформальдегида в PBS, содержащем Triton-X-100 (0,05%) в течение 2 ч при комнатной температуре в пластиковых пробирках.
        Примечание: Клетки , выращенные в культуре (in vitro) может быть непосредственно закреплен в глутаровый альдегид, как описано на следующей стадии (1.1.1.5).
      5. Удалить раствор и добавляют 100 мкл 0,5% PFA, 2% глутаральдегида (GA) и 0,1 М какодилате натрия (рН 7,4). Хранить в течение ночи при температуре 4 ° С. Полоскание образцы дважды в какодилате 0,1 М натрия.
      6. Обрежьте личиночной головы ростральным в мозге для облегчения проникновения осмия. Используйте тонкие шприцы / пинцета.
      7. Личинки Postfix в 1% осмия (OsO 4) /1.5% ферроцианида калия (K 4 [Fe (CN) 6]) в 0,1 М какодилате натрия на льду в течение 2 ч и сполоснуть 3 х 5 мин в бидистиллированной H 2 O.
      8. Высушить в этаноле при 20 мин инкубирования в возрастающих концентрациях этанола (50%, 70%, 3 раза в 100%).
    2. Вложение
      1. Подготовка эпоксидной смолы в соответствии со стандартными рецептами, используемых в лабораториях EM.
        Примечание: Мы используем эпоксидной смолы следующим образом: смешивают 19,8 г glycid эфир 100, 9,6 г ангидрида 2-додеценилянтарная кислоты и 11,4 г methylnadic ангидрида с использованием магнитной мешалки. Добавьте 0,5 г DMP-30 (трис- (диметиламинометил) фенол) и снова перемешать.
      2. Выдержите личинок в течение ночи в 50% эпоксидной смолы в этаноле (об / об) при вращении (RT).
      3. Заменить разбавленный эпоксидных смол с чистой смолой. Инкубировать в течение 30 мин, добавить свежую смолу снова и инкубировать в течение еще 30 мин. Опять же обновить смолу, а затем инкубируют 3 ч при комнатной температуре, а затем 15 мин при 58 ° C и еще в течение 1 ч при комнатной температуре при низком давлении (200 мбар).
      4. Сориентируйте головы в коммерчески доступных кремниевых встраиванию плоские формы под микроскопом рассечение с помощью иглы или зубочистки с передней обращенной к стороне формы или по мере необходимости (Фигура 1В).
      5. Полимеризуется эпоксидные Резв течение ночи при 58 ° C. Если эпоксидная смола еще слишком мягкая позволяют еще один день полимеризуется и затвердевает при 58 ° C. Испытание жесткости, применяя давление с помощью щипцов. Если это легко оставляет отступы позволяют другой день полимеризуется и затвердевает при 58 ° C. Когда образец полностью отвержденного приступить к подрезки и секционирования.
      6. Срежьте лишнюю смолу из заглушек с помощью лезвия бритвы (рис 1B).
  2. Секционирование, Контрастные и монтирование
    1. секционирование
      1. Блок смолы Раздел эпоксидной смолы с использованием ультрамикротомом.
      2. Используйте стеклянную нож или алмазный histoknife сократить полутонких секции (500 нм) для толуидиновым синий / основного фуксина (рис 1D) окрашивания для обнаружения правильного позиционирования.
      3. Передача полу-тонкие срезы на микроскопических слайдов, выбирая их с стеклянной Пастера пипеткой наконечник которого был закрыт путем плавления в пламени. Сушить на горячей плите ˙Until воды не осталось. Окрашивают в течение 10 сек с 1% толуидиновым синим в воде на горячей плите, и после промывки водой, морилку в течение 10 сек с помощью 0,05% основного фуксина в 1% тетраборат натрия. Осмотрите с нормальным световым микроскопом при 10х до 40х.
      4. Когда надлежащее место / ориентации в головном мозге достигается, по- прежнему секционирования блок эпоксидной смолы с помощью алмазного ножа вырезать ультратонких срезов (~ 70 нм; рис 1E)
      5. Используйте легко идентифицируемых анатомических структур внутри и вокруг головного мозга, в том числе обонятельных ямок, глаз, границы серо-белого вещества, чтобы определить область интереса во время ультратонкие секционирования и для регулировки угла секционирования, когда образец наклонен.
      6. Крепление секции на однослотовых L2 х 1 медные сетки (рис 1F), чтобы обеспечить бесперебойное приобретение сетевыми баров. Используйте формвар сетки с покрытием для поддержки секций.
    2. Контрастные
      1. Пятно ультратонкие срезы на сеткеs в течение 2 мин в 2% ацетата уранила в метаноле с последующим Рейнольдс цитратом свинца в течение еще ​​2 мин 16.

2. Получение изображения

  1. Крупномасштабная STEM
    Примечание: Мы используем EM сканирования с генератором внешнего сканирования , способного приобрести несколько больших полей зрения при высоком разрешении 3,5,7,17 ​​с помощью функции обнаружения STEM. Как правило, одно изображение генерируется таким образом эквивалентно полях зрения ~ 100 просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) изображений, значительно уменьшая количество стежков.
    1. Пример монтажа в микроскоп
      1. Поместите сетку с сечением в множественным держателе образца сетки и передать в камеру РЭМ.
    2. Выравнивание детектора STEM
      1. Поместите сетку с образцом под балкой и переместить его вверх так будет ок. 5 мм от полюса объектива. Приобретать изображение при 20 кВ с использованиемв-линзе детектора.
      2. Фокус на сетке края и настроить рабочее расстояние до 4,0 мм.
      3. Переместите держатель образца в безопасное положение и принести в детекторе STEM.
      4. Сосредоточьте отверстие детектора STEM в изображении поля, поворачивая Регулировки винты во время формирования изображения на максимальной скорости с детектором в-объективом.
      5. Осторожно вернуть держатель образца, который будет соответствовать только между объективом полюса и детектором.
      6. Приобретать изображение с помощью детектора в линзы, чтобы быть уверенным, что на площади сечения.
      7. Переключение в режим обнаружения (STEM усиливающую среду и все квадранты, установленные на "минус") и получить изображение и выберите область для сканирования.
      8. Повышение ускоряющего напряжения до 21 кВ и ждать стабилизации луча (стабильного изображения снова), а затем перейдите к 29 кВ с шагом 2 кВ.
    3. Получение изображений
      1. Предварительно облучать образец (для предотвращения изменения яркости, вызванные электронным пучком) путем увеличения масштабатак, в полной области для сканирования соответствует окно изображения.
      2. Изменение диафрагмы до 120 мкм (для поддержания надлежащего динамического диапазона коэффициенты усиления детектора должен быть уменьшен на один шаг).
      3. Де-фокус, чтобы изображение размыто.
      4. Сделайте область сканирования как можно туго с помощью опции сканирования уменьшенной площади.
      5. Заданная скорость сканирования таким образом, что кадр сканируется в прибл. 1 - 2 сек.
        Примечание: В зависимости от размера и ткани это, как правило, занимает ½ ч (FOV мкм 100 х 100), чтобы до 3 ч (1000 х 500 мкм).
      6. Увеличение по крайней мере, 100х и отсканировать небольшую область в течение 10 сек.
        Примечание: Если эта область не изменяется яркость по сравнению с его окрестности, дорадиационного достаточно.
      7. Верните диафрагму в 30 мкм (и STEM прибыль от среды)
      8. Фокус образца.
      9. Совместите отверстие с помощью воблера (при ~ 40,000X увеличении).
      10. В то время как в фокусе выбрать легкий область / функцию, установите скорость сканирования таким образом, что деталивидны.
      11. В программном обеспечении микроскопа регулировать яркость и контрастность, внимательно наблюдая за гистограмму, чтобы сохранить все пиксели в динамическом диапазоне. Сделайте то же самое для темной области / функций.
      12. Вернитесь к яркой области и проверьте еще раз. На всякий стороне, таким образом есть некоторое пространство на обеих сторонах гистограммы.
      13. Уменьшить поэтому полная область сканирования подходит окно изображения, и запустить большую программу приобретения площадь.
      14. С помощью опции мастера, чтобы создать мозаику, выбрав область с экрана. Используйте размер пикселя 2 - 5 нм в зависимости от того, какие детали необходимы. Используйте Выдержка времени 3 мкс для щупов.
      15. Выберите опцию "автофокусировка на предыдущей плитки", использовать большие масштабы приобретения программного обеспечения автофокусировку с настройками по умолчанию компании, установите флажок "проверить настройки перед выполнением" и определить, где для сохранения данных.
      16. Нажмите кнопку "оптимизации" для проверки параметров микроскопа.
        Примечание: Теперь время, необходимое будет шсвоя. Это может быть до 72 ч в течение 1 х 0,5 мм областях.
      17. В окне типа "максимальное разрешение плитки" 20000 так что отдельные плитки не будет больше, чем 20k 20k х, предотвращая тупых краевых эффектов. Нажмите кнопку "выполнить".
      18. Когда его спросили, для проверки фокусировки и яркости / контрастности (B / C), выключите генератор внешнего сканирования и тщательно настроить фокус и астигматизма в программном обеспечении микроскопа. Не следует изменять B / C.
        Примечание: Ступень может быть перемещен и увеличение изменилось, но увеличение должно быть установлено обратно до нужного размера пикселя.
      19. Включите генератор внешнего сканирования еще раз и нажмите "Продолжить".

3. Анализ данных

  1. Открыть крупномасштабную EM файл программы просмотра и откройте файл "мозаичную данные". Это позволит открыть все плиточные TIF-файлы. Это предпочтительно выполняется на другой рабочей станции, чтобы не перекрывать новые приобретения.
  2. Выберите опцию 'а.е.сшить всю мозаику (параметры режима перекрытия на половину, сшивая порог 0,90, снижение уровня шума автоматически. В случае, если критерии сшивание не может быть выполнено, увеличивать и уменьшать масштаб вручную поместить плитку в нужном положении и нажмите кнопку "Продолжить как есть").
  3. Экспорт как HTML-файл, или в качестве альтернативы в качестве единого TIF.
    Обратите внимание, что для TIF экспортировать разукрупнение может понадобиться. Включите окончательный размер пикселя в имени файла позволяя производить измерения позже.
  4. Выполните аннотации в TIF файл, открыв его в программе редактирования изображений. Параллельно с этим, откройте файл масштабируемой HTML в веб-браузере для оптимального наблюдения разрешения.

Representative Results

Крупномасштабное EM набор данных корональных разделов главы 1-недельных данио личинок показывает, что многие ткани и клеточных функций в одном большом масштабе изображения (www.nanotomy.org).

Nanotomy участков мозга управления выявляет типичные ультраструктурные особенности нервной ткани рострального переднего мозга , включая обонятельные пучков волокон, нейронные ядер и нейронные подразделам отсеков , включая синапсов (рис 2А, www.nanotomy.org). Типы клеток в голове, которые могут быть выделены, включают хондроциты с большими вакуолей в нижней челюсти, нехарактерные для нормы миелина обонятельных нервных клеток, эндотелиальные клетки небольшого судна, структуры включают мозговую оболочку (данио аналог мозговым оболочкам, мембранную слой облицовками мозга млекопитающих). Субклеточные структуры включают гликокаликса эпидермиса, различные ядерные морфологию и очаги в различных CEL Типы л и органеллы, включая аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ER), митохондрий и синаптических везикул и постсинаптических плотностей.

Неожиданным ядрах клеток, выстилающих желудочек очень плотна электронов по сравнению с другими клетками, диспергированных более латерально в головном мозге. Кроме того, эти желудочков ядер показывают темные очаги, которые отсутствуют в других клетках в головном мозге и появляются разные по размеру и структуре от гетерохроматина, который находится в ядрах фагоцитарной микроглии (рис 2). Клетки, выстилающие желудочек в развивающихся данио включают главным образом радиальных глиальных клеток и нервных клеток-предшественников, которые могут отражать измененное состояние хроматина, чем более дифференцированных клеток. Как стволовые клетки в ткани, как правило, довольно редки, nanotomy соотносить маркировки тканей для маркеров стволовых клеток с масштабом ткани поэтому EM могут быть использованы для идентификации ультраструктурные особенности стволовых клеток.

ve_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Масштабный EM (www.nanotomy.org) корональной секции в данио личинки, подвергающегося нейронную абляции показывает много специфических тканей, а также клеточные и молекулярные особенности не найдены у контрольных животных. Клеточные особенности включают фагоцитарную микроглии и вакуолей размер клеток, вероятно , представляющие умирающие клетки (рис 2B, www.nanotomy.org). Предыдущие исследования выявили EM микроглии у позвоночных 18,19. Характерные особенности микроглии включают удлиненные ядра , сгустки пятнистый хроматина рядом с ядерной оболочкой, видный Гольджи, свободный полирибосом, зернистый эндоплазматический ретикулум (ER) с длинной узкой цистернами, относительно темной / плотной цитоплазмы, а также многочисленные включений, таких как фагосомах, липидных капель и лизосом. Все эти отличительными чертами, приписываемые микроглии в тканях млекопитающих, также были обнаружены в этих клетках в данио мозге (рис 2B, www.nanotomy.org).

<р класс = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-странице = "1"> Рисунок 1
Рисунок 1: Технологическая схема Крупномасштабное Tissue электронной микроскопии на данио рерио Brains. (А) 7 дневного возраста данио личинка. (В) рыбок данио личиночной головы внедренные бок о бок в эпоксидной смоле. (С) стеклянный нож для полуавтоматической -thin секционирования и ориентирование образца. (D) , представитель полутонких толуидиновым синим в пятнах разрезе , показывающий две бок о бок внедренный данио личинок. (Е) Алмазный нож , чтобы прорезать сверхтонкие (70 нм) секций. (F) , отредактированное изображение в (D) из всей данио личиночной секции мозга на одной дырочной сетке для указания местоположения. (G) система микроскопии используется для крупномасштабного 2D EM в данном исследовании. (Н) Поток обработки изображений. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.

фигура 2
. Рисунок 2: Nanotomy . Результаты: Из макромолекулы ткани (А) Nanotomy мозгов в течение 7 дней контроля после оплодотворения и (В) , обработанных (нейронный абляция; Рисунок 1), показывающий особенности , специфичные для нейронального абляции дегенеративные мозга (Б) Эти включают фагоцитарную микроглии, темные клетки претерпевают гибель клеток и губчатую появление нервной ткани ((а) и (в)). Верхние панели (адаптировано из 5): 10X увеличенный вид области указывается в средней панели. Средние панели: 10X увеличенный вид области указывается в нижних панелях. (A, средняя панель) Высокий Увеличение нейропиля показывая синапса в (A, нижняя панель), синаптические везикулы (SVS) ипостсинаптической плотности (ПД). (B, Средняя панель) Высокий коэффициент увеличения амебоидной микроглии или , возможно , макрофаг (средняя панель, M) , показывающая типичные амебоидных функции микроглии (нижняя панель) , включая видного Гольджи (G), в том числе включения лизосомальных вакуолей (L). Шкала баров: 50 мкм (вверху), 5 мкм (средний) и 0,5 мкм (снизу). Эта цифра была изменена с 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этого рисунка , или посетить полный данных в онлайновом режиме (nanotomy.org).

Discussion

EM позволяет анализировать сотовой связи с высокой разрешающей способностью макромолекул в биологическом контексте. Тем не менее, это, как правило, ограничивает поле зрения. Изображение большего масштаба 3D EM особенно подходит для подключения карт нейрональной путем создания наноуровне резолюцию 3 мерных реконструкций, требующих обработки 10 сложных данных. В отличие от 2D больших масштабах EM требуется только один раздел и строчка данных изображений, а также оценка данных можно любым лицом, имеющим доступ к интернет-браузер. Мы и другие ранее использовали крупномасштабную EM для анализа тканей и целых животных. Что же касается большинства подходов, ТЕМ и SEM на основе строчкой имеют свои собственные преимущества. При этом передача сканирование EM (STEM) был использован, что позволяет генерировать большое поле зрения при высоком разрешении. Как правило, один STEM изображение эквивалентно полей зрения приблизительно 100 ПЭМ изображений, что значительно сокращает количество сшивания при визуализации большого FIELDS зрения с высоким разрешением. Если более высокое разрешение требуется, ПЭМ может быть выгодным. STEM имеет преимущество по сравнению с ТЕМ , что не-контрастируют образцы могут быть использованы с хорошим ультраструктурным контраста 6.

Кроме того, способ, описанный здесь, может быть просто отрегулировать для использования с обратно рассеянного обнаружения электронов (BSD) на секции, установленной на кремнеземных вафель, расширение использования на нескольких системах микроскопа. HTML-масштабируемой ткани EM файлы очень полезны для количественной оценки, совместное использование данных , которые не могут быть проанализированы с целью его полного содержания, сочетая LM и данные EM (Клем) 8, презентационных целей в области научных исследований, чтобы проанализировать данные пациента, так и для образования. В качестве альтернативы, в крупномасштабном ЭМ в SEM, но не в ПЭМ, кремнезем облатки могут быть использованы, которая имеет два основных преимущества: BSD могут быть использованы, что более обычно доступны на РЭМ, чем STEM обнаружения. Во- вторых, монтаж больших участков (> 1 мм 2 областяхИнтерес) прост. Монтаж на отдельных щелевых сеток является трудоемким и технически сложной задачей. Подробное сравнение между TEM, SEM и STEM подробно описана в другом месте 6. Недостатком визуализации BSD является то, что, по сравнению с штанговые изображения увеличили шум. Это может быть частично компенсировано за счет увеличения времени пиксела задержки, в результате чего значительно более длительного времени приобретения.

Хотя для подготовки образца относительно стандартной обработки EM (фиксации, вложения и секционирования) требуется 5-7, это технически сложно вырезать большие участки сверхтонких полностью лишенные артефактов. Разделы очень хрупкие, легко ломаются, складки или разрушаются во время формирования изображения, которая обычно занимает несколько часов в наборе данных. Тем не менее, из-за онлайнового обмена сырых непредвзятых данных, оно должно стать возможным сравнить более легко опубликованным данным, и использовать опубликованный набор данных в открытой области в качестве контроля. В настоящее время несколько EM устройств, способных Лос-АнджелесеRGE-масштабный анализ используются, и, следовательно, доступность этого метода несколько ограничена, хотя большинство центров обработки изображений приветствуем совместные усилия.

Для крупных участков ткани должна быть надлежащим образом закреплены по всему образцу. Поэтому смесь быстрой, но умеренной фиксаторе PFA используется в сочетании с медленным, но сильным фиксирующим средством GA. Резка и собирание больших разделов без артефактов трудно. Работа с вафель в сочетании с BSD легче по сравнению со сбором секций на одиночных сетках отверстий. Тяжелый металл пост окрашивание является более важным по сравнению с классической EM. Поскольку вся секция визуализируется каждый артефакт будет виден. Пользователям ПЭМ обычно трудно переключиться на SEM, из-за разницы в работе микроскопа.

Количественное и обмен данными - Количественная субклеточных особенности трудно в одиночных изображений EM. Возможность увеличивать и уменьшать масштаб крупномасштабныхИзображения легко позволяет идентифицировать клетки, представляющие интерес, которые могут быть с последующим измерением наноразмерных внутри клеток. Эти наборы данных показывают, что определенные типы клеток могут быть быстро идентифицированы и количественно непредвзято в этих больших участков ткани, основанные на особенностях обнаруживаемых в различных масштабах. Например микроглии могут быть идентифицированы на основе их морфологии и плотной цитоплазмой. Впоследствии, при наезде на отдельных клетках, наноразмерные субклеточные и молекулярные особенности этих клеток могут быть измерены в пределах того же набора данных, как мы ранее показали ширины ER в крупномасштабной EM тканевой культуры набора данных 2. Дополнительным преимуществом является то, что nanotomy хостинг крупных наборов данных в Интернете позволит другим проверять данные, возможно, для других функций, и сделать свои выводы о новой гипотезе.

CLEM - Помимо облегчения количественного EM, крупномасштабный EM облегчает соотносить свет microscoПИК маркировка уровня EM 8. В настоящем примере присутствие фагоцитирующих микроглии в данио модели абляции показана. Главный вопрос в нейробиологии является то, что отдельные функции и вклады микроглии и потенциальных других источников фагоцитирующих и иммунных клеток. Ранние исследования EM показали отличительные особенности субклеточных микроглии при болезни 18. К сожалению, трудно селективно маркировать микроглии, в частности, в патологической обстановке, так как они демонстрируют большое перекрытие с другими иммунными клетками в экспрессии генов, морфологии и функции. Таким образом, остается неясным, является ли и когда микроглии на ультраструктурным уровне отличаются от иммунных клеток из других источников, в том числе и моноцитов, полученных инфильтрации макрофагами. Понимание того, есть ли ультраструктурные различия между этими клетками будет служить отправной точкой для анализа функциональных различий. Комбинируя селективные трансгенные или экспрессии маркеров и CLEM позволяет йепрогиб ультраструктурных признаков селективным по отношению к определенным группам населения.

Диагностика и презентация и образование - Визуализируя наноразмеров к Microscale в пределах одного набора данных EM данных в значительной степени способствует широкой аудитории. С увеличением возможностей и инструментов для соотносительной и крупномасштабных EM мы ожидаем, что возрождение ЭМ в области базовых и медицинских исследований. Наш метод представлен здесь применяется к травмам модели данио мозга 5, но был использован на ткани человека , 7, мозга крысы 3, в крысиной модели диабета 4 и в клеточной культуре , 2, а также может быть использован в сочетании с ТЕМ основанное подход 1 , показывающий универсальность этого метода. Оператору микроскоп больше не запись очень выбрали, и, следовательно, предвзятые изображения, но все многочисленные ультраструктурные особенности регистрируются и открыты для анализа во всем мире.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Большая часть работы была выполнена в UMCG микроскопии и обработки изображений Центр (UMIC), авторами которого являются НМП 175-010-2009-023 и ZonMw 91111006; STW "Микроскопия долина 12718" в BNGG. Эта работа была организована за счет гранта ZonMw Veni, грант карьеры интеграции Мари Кюри (спасительной умирающих нейронов) и общение болезни Альцгеймера Nederland к TJvH

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
low melting point agarose VWR 444152G
tricaine Sigma E10521
triton-X-100 Sigma X100
glutaraldehyde Polysciences 1909
sodium cacodylate Sigma C0250
osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19114
potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) Merck 4984
ethanol VWR 20821.365
uranyl acetate  Merck 8473
sodium tetraborate Merck 1063808
toluidene blue Merck 1273
basic fuchsin BDH 340324
lead citrate BDH discontinued
EPON
2-dodecenylsuccinicacid anhydride  Serva 20755
methylnadic anhydride Serva 29452
glycid ether 100 Serva 21045
DMP-30  Polysciences 553
standard flat embedding mold Electron Microscopy Sciences 70901
diamond knife Diatome Inc.
copper grids  Electron Microscopy Sciences
double sided carbon tape  Electron Microscopy Sciences
scanning EM Zeiss Supra55 Zeiss
ultramicrotome Leica EM UC7 Leica
atlas external scan generator  Fibics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faas, F. G., et al. Virtual nanoscopy: generation of ultra-large high resolution electron microscopy maps. J Cell Biol. 198, 457-469 (2012).
  2. Kuipers, J., et al. FLIPPER, a combinatorial probe for correlated live imaging and electron microscopy, allows identification and quantitative analysis of various cells and organelles. Cell Tissue Res. 360, 61-70 (2015).
  3. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Lindsey, L. F., Harris, K. M. Automated transmission-mode scanning electron microscopy (tSEM) for large volume analysis at nanoscale resolution. PLoS One. 8, e59573 (2013).
  4. Ravelli, R. B., et al. Destruction of tissue, cells and organelles in type 1 diabetic rats presented at macromolecular resolution. Sci Rep. 3, 1804 (2013).
  5. van Ham, T. J., et al. Intravital correlated microscopy reveals differential macrophage and microglial dynamics during resolution of neuroinflammation. Dis Model Mech. 7, 857-869 (2014).
  6. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 15477, 202-207 (2015).
  7. Sokol, E., et al. Large-Scale Electron Microscopy Maps of Patient Skin and Mucosa Provide Insight into Pathogenesis of Blistering Diseases. J Invest Dermatol. 135, 1763-1770 (2015).
  8. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: Ultrastructure lights up! Nat Methods. Nat Methods. 12, 503-513 (2015).
  9. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12, 51-54 (2015).
  10. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
  11. Oosterhof, N., Boddeke, E., van Ham, T. J. Immune cell dynamics in the CNS: Learning from the zebrafish. Glia. 63, 719-735 (2015).
  12. van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22, 830-836 (2012).
  13. Davison, J. M., et al. Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish. Dev Biol. 304, 811-824 (2007).
  14. Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 13365-13370 (2009).
  15. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB J. 24, 4336-4342 (2010).
  16. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. 17, 208-212 (1963).
  17. Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
  18. Stensaas, L. J., Reichert, W. H. Round and amoeboid microglial cells in the neonatal rabbit brain. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 119, 147-163 (1971).
  19. Mori, S., Leblond, C. P. Identification of microglia in light and electron microscopy. J Comp Neurol. 135, 57-80 (1969).

Tags

Биология развития выпуск 111 Масштабный электронная микроскопия сканирующая Е.М. nanotomy данио количественный Е.М. коррелировать микроскопия
Крупномасштабное Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (Nanotomy) здоровых и оскорбленные данио мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuipers, J., Kalicharan, R. D.,… More

Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (111), e53635, doi:10.3791/53635 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter