Summary
우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 - 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
콜라겐의 당 단백질 패밀리는 현대 조직 공학에서 사용되는 생체 물질의 주요 성분은 인체의 주요 구조 단백질을 나타내고있다. 그것은 특히 피부 모델에서, 결합 조직 및 후속 조직 응집력 차선의 형성의 결과로 악명 느린으로하는 기술 병목 시험관 안의 콜라겐 침착이다. 여기서는 콜라겐 침착의 극적인 향상을 초래 고분자 크롤 (MMC)을 생성하는 피부 배양 물을 차등 적 규모 자당 공중 합체의 첨가를 포함하는 방법을 설명한다. 특히, 피부 섬유 아세포는 컨트롤과 비교하여 MMC하에 콜라겐 I / IV / VII 및 피브로넥틴 상당한 양의 증착.
프로토콜은 또한 immunocy 의해 입증 배양 표면에 유지 된 세포 외 기질 (ECM)의 상당량이 노출 혼잡 세포층을 decellularize하는 방법을 설명tochemistry. 전체 매트릭스 질량 분포 패턴은 반사 간섭 현미경을 사용하여 연구 하였다. 구성과 형태를 변화의 흥미롭게도, 섬유 아 세포, 각질 세포와 공동 배양 생산 세포 유래 매트릭스 (CDM). CDM 따라서 더 많은 임상 적 응용 프로그램으로 이동, 코팅 또는 비계의 현재 사용은 일반적으로 이종 동물 소스에서 피할 수 이차 전지의 파종을위한 "바이오 인공 지지체"로 사용할 수 있습니다.
또한,이 프로토콜은 특히 더모 - 표피 접합부 (DEJ)에 ECM 증착을 강화하기에 충분 하였다는 3D-의 Organotypic 피부 공동 배양 모델 콜라겐 VII, 주성분의 침지 단계 MMC의 적용을 설명 의 원 섬유를 고정. 전자 현미경 대조군에 비해, MMC 개발 문화 브릴 고정구의 존재를 확인했다. 고정 원 섬유가 표피에 진피를 밧줄로이, 따라서 중요하다미리 형성된 성숙한 DEJ가 이식 안정성과 전반적인 상처 치유의 관점에서 피부 이식받는 사람을 도움이 될 필요. 또한, 배양 시간은 비용 절감, MMC를 사용하는 경우, 성숙한 구조물을 구하는 3 주 5주에서 응축시켰다.
Introduction
피부는 수분 손실과 병원균 항목을 방지하여 보호 장벽을 형성한다. 그것은 세 가지 주요 구성 요소로 구성된다; 간질 풍부한 진피 (1), 층상 표피 그 위에 2,3,4와 5,6 사이의 더모 - 표피 접합부. 진피는 주로 콜라겐과 탄성 섬유로 구성되어 있으며 드문 드문 섬유 아세포 (7)로 채워집니다. 대조적으로, 세포가 풍부한 표피 각질 세포의 여러 층으로 구성된다. 가장 안쪽 층의 각질 세포는 증식하고 갱신 끊임없이 피부의 가장 바깥 쪽 층으로 이동 겪는 각질화 층 결과들은 핵 및 세포질 물질을 잃은 말기 분화 각화 세포를 대체 새로운 기저 세포를 제공한다 박리.
진피 - 표피 접합부 기저막의 특정 유형은 tethe 도통 매트릭스 분자로 이루어지는 복합 구조진피에 표피를 RS. 진피의 콜라겐 I 섬유는 콜라겐 VII는 콜라겐 IV 풍부한 라미 densa에 고정되어 미세 섬유를 고정으로 인터레이스. 차례로 정박 필라멘트 (라미닌 5, 콜라겐 XVII 및 인테그린)를 기초 각질 세포의 hemidesmosomes와 라미 densa를 연결합니다. 기저 각질 세포 (지층 basale)는 미분과 suprabasal 층을 형성 계층화뿐만 아니라, 증식 및 갱신 능력을 가지고; 환경과 피부 접촉면을 나타내는 계층 spinosum 등, 지층 granulosum, 마지막 각질층. 각질화 층 기저층에서 욕실 경로 각질 cytokeratins의 발현 패턴을 전환하고 결국 세포 사멸을 거치며 각질화 스스로 싸는 봉투, 공유 트랜스 글 루타 미나 제 활동에 의해 가교되는 특정 단백질의 껍질.
의 복잡한 구조를 포함, 피부와 체외에서의 레이어를 재 작성 피부 - 표피 접합부 및 피부 세포 외 기질, 그리고 각화 과정을 모방하기는 어려운 작업 한 흥미 과학자와 생명 공학자가 있습니다. 예를 들어 피부 조직 공학에서 상당한 진보가 있었다, 환자의 조직 검사에서 피부 세포를 성공적으로 추출 및 환자 유래 피부 세포 (8)을 사용하여 피부의 Organotypic 문화의 생성. 그러나, 문제는 미해결 피부 세포 외 기질 단백질의 불량한 분비 자체와 관련된 차선 피부 모델의 결과를 유지. 또한, 시간은 잠재적으로 거대 crowders의 혼입으로 단축 할 수있는 기간을 현재의 프로토콜을 사용하여 3 차원의 Organotypic 피부 공존 배양을 생성하기 위해 요구되는 4 ~ 8 주 사이에서 변한다. 배양 시간을 줄이면, 시약 비용을 절감 세포 노화의 발생을 감소시키고, 환자의 대기 시간은 제품이 임상에서 사용되어야 줄인다.
t "> 거대 분자는 (MMC) 크롤 배제 부피 효과. 이러한 표준 수성 배양 조건 9-13 하에서 지각 인 프로 콜라겐의 단백질 분해 절단을 포함한 효소 반응 속도에 영향을 미친다. MMC 하에서, 효소 반응을 생성하기 위해, 배지에 특정 고분자를 도입하는 것을 포함 혼잡 제어 (10)와 비교하여 프로 콜라겐 절단 혼잡 문화 I 분자 콜라겐의 양이 증가하는 경우에, (14, 15)가 발생 시약의 양을 증가시키지 않고 재촉된다. 콜라겐 프로 콜라겐의 전환으로 콜라겐의 형성을 허용 48 시간 동안 MMC 배양 어셈블리, 섬유 아세포는 최대 4 주 11,16,17 모니터링 솟아 섬유 아세포 배양에 비해 I를 훨씬 더 많은 콜라겐을 얻었다. ECM의 형성, 안정화 및 리모델링에 영향을 미치는 효소의 활동 또한 MMC에 효과 외에도 직접적으로 개선하고 콜라겐을 조절하는 것으로 나타났다섬유화 18,19.우리는 특히 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포에 피부 세포에 의한 세포 외 기질 (ECM) 생산을 강화하기 위해 여기에 방법을 제시한다. 또, 단층 배양에서 생산 MMC 농축 ECM은 decellularized 순수한 세포 - 유래 매트릭스 (CDM)으로 사용될 수 있음을 보여준다.
우리는 시각화하는 비 전통적인 방법을 사용하고 완전히 MMC 배양 피부 세포에 의해 퇴적 된 ECM을 주셔서 감사합니다. 간섭 반사 현미경은 전형적으로 세포 - 매트릭스 상호 작용 또는 세포 간 유리 접점을 연구에 사용된다. 이 기술은 유리 표면 상에 증착 된 매트릭스의 총량을 확인하기 위해 시스템에서 사용 하였다. 간섭 반사 현미경 존재 및 MMC의 부재에서, 세포 외 기질 성분과 패턴의 측면에서 정보의 대부분의 양을 얻기 위해 면역 형광에 결합시켰다.
OrganotypiC 피부 공동 배양 삼차원 환경에서 시험 관내에서 피부 모델에 전형적인 방법이다. 이차원 공동 배양 중요한 정보를 제공 할 수 있지만,이 데이터를 변환하고 다시 본래 입체 구조 인 생체 내 환경에 적용 할 때 한계가있다. 피부 각질 세포, 특히, 편광하고 항상성 및 세포 부착에 필수적인 혀끝과 기저 세그먼트를 포함한다. 또, 케라틴 1 케라틴 (10)과 필라 그린 등 기저층 상기 케 라티노 사이트, 일반적인 suprabasal 단백질의 발현 및 각질 층화 말단 분화 과정에만 존재한다. 말단 분화 전형적인 단층 배양 물에서 거의 존재로서 suprabasal 단백질 발현은 보통 이러한 배양 시스템에서 달성되지 않는다. 따라서,의 Organotypic 문화는 문화 매체에 빠져들 시작,하지만 keratinocyt 구동 공기 - 액체 인터페이스에 해제된다전자 차별화. 이 층화 마커, 심지어 각화 및 표피 생리 일반적으로 더 나은 반사의 발현을 초래한다. 다른 그룹은 이전에 성공적으로 피부의 Organotypic 공동 배양을 생성하고 있지만, 기능적 더모 - 표피 접합 영역의 설정이 문제가되고있다. 여기, 우리는 압축 된 시간 내에, 향상된 기저막과의 Organotypic 피부의 공동 문화를 배양하고 이러한 구조의 성숙을 손상시키지 않고 새로운 방법을 제시한다. 이 체외 모델링을위한 피부 모방 체, 피부 생물학의 연구와 심사 분석의 구색을 제공한다.
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Protocol
1. Macromolecular의 크라우 딩 2D 피부 세포 배양에
- 종자 50,000 세포 (차 섬유 아세포 또는 기본 각질 세포 또는 기본 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화) 24 웰 플레이트의 웰 당. 대응하는 셀 타입 성장 배지 1 ㎖ 종자 세포.
- 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
- 오래된 미디어를 취소하고 1 ml의 신선한 미디어는 거대 분자 crowders 100 μM의 아스 코르 빈산을 함유 교체합니다. 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 항생제로 보충 37.5 밀리그램의 DMEM으로 구성된 / ml의 피콜 70, 25 ㎎ / ㎖ 피콜 (400)를 사용하여 섬유 아세포 미디어 (FM)를 구성된 크라우 칵테일을 사용합니다. 무 혈청 미디어, KSFM 또는 CNT-57에서 각질 세포를 성장. FM 50 % 및 50 %의 혈청이없는 배지의 혼합물에 공동 배양을 유지한다.
- 매 2 일 미디어 변화에, 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터 6 일 동안 문화를 품어.
피부 세포 배양 2. 형광 면역 염색
- 1X PBS로 두 번 세포 배양을 씻으십시오.
- 메탄올 또는 파라 포름 알데히드 (항체 사양에 따라) 중 하나와 세포 배양을 수정합니다.
- 메탄올 고정하십시오
- 나누어지는 500도 각으로 냉 메탄올 ㎕의 10 분 -20 ° C에서 품어. 대기음은 정착액 및 메탄올 폐기물을 폐기합니다. 층류 흄 후드의 공기 건조.
- 파라 포름 알데히드 고정하십시오
- 분취 액을 각 웰에 2 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL 및 15 분 동안 실온에서 배양한다. 대기음은 정착액 및 파라 포름 알데히드 폐기물을 폐기합니다.
- 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척.
- 분취 액을 각 웰에 1X PBS 1 ㎖.
- 메탄올 고정하십시오
- 항체를 사용하여 형광 면역 염색
- 분취 액을 각 웰에 (1X PBS에 희석) 3 % 소 혈청 알부민 500 μl를. 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션0 분. 차단 솔루션을 기음과 폐기합니다.
- 차 항체
- 나누어지는 200 차 항체의 μL : 판에서 직접 영상의 경우 : 각 웰에 (1 100 희석 10 %의 염소 혈청) 용액을 실온에서 90 분 동안 품어.
- 나누어지는 차 항체의 50 μL (1 : 100 희석 10 %의 염소 혈청) 솔루션을 파라 필름의 평면 조각 위에 커버 슬립하십시오. 솔루션에 직면 셀 사이드 (세포 커버 슬립의 일부)과 함께 파라 필름에 커버 슬립을 놓습니다. 아니 거품, 전체 셀 측을 커버. 실온에서 90 분 동안 인큐베이션.
- 대기음 차 항체 솔루션 및 폐기.
- 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척.
- 이차 항체
- 나누어 차 항체 200㎕를 : 직접 플레이트를 영상화 : 각 웰에 (400 희석 한 10 % 염소 혈청) 용액 및 알루미늄 FO로 플레이트를 덮고, 실온에서 30 분간 부화 위원장.
- 나누어지는 차 항체의 50 μL (1 : 400 희석 10 %의 염소 혈청) 솔루션을 파라 필름의 평면 조각 위에 커버 슬립하십시오. 솔루션에 직면 셀 사이드 (세포 커버 슬립의 일부)과 함께 파라 필름에 커버 슬립을 놓습니다. 아니 거품, 전체 셀 측을 커버. 알루미늄 호일로 파라 필름을 덮고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 대기음 차 항체 솔루션 및 폐기.
- 세 세척, 세척 당 5 분, 1X PBS로 세척. 분취 액을 각 웰에 1X PBS 1 ㎖.
- 설치
- 플레이트에서 직접 이미징의 경우 : 설치하지 않습니다. 현미경으로 진행합니다.
- 장착 된 커버 유리 슬라이드에 미디어를 장착에서 : 커버 슬립의 이미징. 알루미늄 호일로 덮여 용기에 드라이 하룻밤. 현미경으로 진행합니다.
- 40 배 / 1.30 오일 목표와 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 이미지를 획득.
- 1X PBS로 두 번 세포 층을 씻으십시오.
- 나누어지는 각 웰 (6 웰 플레이트 형식)에 용해 버퍼 100 ㎕ (자료 목록 참조). 미세 원심 분리 튜브에 세포 스크레이퍼 전송 용액 세포층 긁어.
- 4 ° C에서 30 분 동안 15,330 XG에 원심 분리기 솔루션입니다. 다른 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
- 샘플 버퍼 5 μl의 환원제 2㎕의 각 시료 13 μL를 혼합 (자재 목록 참조). 10 분 동안 95 ℃에서 가열 된 샘플.
- 1 분 15,330 XG에 원심 분리기 샘플을 응축 물을 수집합니다. 로드 프리 캐스트 PAGE 겔에 샘플과 약 1 시간 동안 100 V에서 실행합니다.
- 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 분리 전송할 종이 조각 (동일 크기의) 스펀지의 겔 막을 샌드위치. 겔, 멤브레인, 서류와 스폰지 사이에 기포가 없는지 확인에스. 샌드위치 카세트를 닫고 2 시간에서 70 V의 전송을 실행합니다.
- 전송이 완료된 경우, 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 10 ml의 개양귀비 빛 S. 워시 막과 막 부화 확인하십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 5 % 우유 10 mL로 차단. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오.
- 90 분 10 ml의 차 항체 (1,000 희석 5 % 우유에 마우스 항 - 콜라겐 VII, LH 7.2, 1)에 품어. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오.
- 30 분 동안 10 ㎖ 차 항체 (: 2000 희석 5 % 우유 염소 항 - 마우스 HRP, 1)와 인큐베이션. 0.1 % PBS-트윈 20, 세 번 세척 당 10 분으로 막을 씻으십시오.
- 카세트에 막을 전송하고 ECL 검출 시약 1 ㎖를 추가합니다. 멤브레인을 통해 명확하고 얇은 플라스틱 시트를 놓습니다.
- 화학 발광을 검출하기 위해, 플라스틱 시트 위에 감광성 필름을 배치하고 카세트를 닫는다. 이 후-5 분, 카세트에서 필름을 제거하고 개발자에 배치합니다.
4. 만들기 및 세포 유래의 매트릭스를 사용하여
- 종자 50,000 세포 (차 섬유 아세포 또는 기본 각질 세포 또는 기본 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화) 24 웰 플레이트의 웰 당.
- 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
- 오래된 미디어를 취소하고 신선한 미디어는 거대 분자 crowders 100 μM의 아스 코르 빈산을 함유 교체합니다. 크라우 칵테일 10 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 보충 된 DMEM으로 구성 37.5 mg의 구성 / ml의 피콜 70 및 25 ㎎ / ㎖의 피콜 400 아세포 미디어 (FM). 각질 세포는 혈청이없는 미디어, KSFM 또는 CNT-57에서 재배된다. 50 % FM 50 % KSFM 또는 CNT-57의 혼합물에 공동 문화를 유지한다.
- 2 일마다 미디어를 변경, 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터 6 일 동안 문화를 품어.
- 세포 유래 마트를 얻을 세포층을 Decellularize× (F-매트 = 섬유 모세포와 각질 형성 세포의 공동 문화에서 유래 섬유 아세포 유래 행렬, K-매트 = 각질 세포 유래 매트릭스, 공동 매트 = 매트릭스).
- 1X PBS로 두 번 세포 층을 씻으십시오.
- 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의 250 μl를 추가합니다. 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션. 흡인 세포 용 해물.
- 단계를 반복 4.5.2 세 번.
- 워시 증류수 H 2 O에 두 번 행렬을 세포 유래 1X PBS에서 세포 유래 행렬을 유지합니다. 매트릭스 1 주까지 4 ℃에서 저장할 수 있습니다.
- (F-매트 위에 케 라티노 시드, 예를 들어) 2 차 세포 현탁액을 준비합니다.
- 대기음 1X PBS.
- 셀에서 파생 된 매트릭스 (F-매트)의 상단에 50,000 각질을 시드. 세포가 5 % CO 2에서 37 °의 C 배양기에서 하룻밤을 준수 할 수 있습니다.
참고 : 분석 실험이 부착 세포에서 직접 수행 할 수있다.
셀 - 5. 특성파생 매트릭스
- 형광 면역 염색 : 프로토콜 2를 참조하십시오.
- 간섭 반사 현미경
- 프로토콜 4.1-4.5 다음 커버 글라스에에 씨앗 세포.
- 세포 유래의 행렬을 획득 한 후, 프로토콜 2.2에 따라 샘플을 수정합니다.
참고 : 항체 염색는 선택 사항입니다. 필요한 경우, 프로토콜 2.3을 참조하십시오. - 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 화상 취득을 수행한다. 74mm에서 핀홀을 설정합니다.
- 필터에 대한 빨강 채널 uorescence FL에 대한 간섭을 다시 FL ection 현미경 (IRM) 채널과 BP 575-615 IR에 대한 LP 505을 사용합니다. 사용 IRM 채널에 대한 NT 80/20 및 HFT 405/488/561, NFT (565), 빔 스플리터에 대한 빨강 채널 uorescence FL에 대한 판. 빨강 채널과 HeNe633 IRM으로 채널에 대한 5.0 %의 전력에서 (파장 633 ㎚) uorescence FL에 대한 DPSS 561-10 (파장 561 ㎚) 1.1 %의 전력에서 다음 레이저를 사용합니다.
6. 3D의 Organotypic 피부 공동 문화
- 셀 문화 삽입 (6 웰 플레이트 형식), 섬유 아 세포 캡슐화와 콜라겐 젤을 캐스팅.
- 나누어지는 추운 비커에 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 I 10 ㎖.
- 차가운 DMEM의 1 ML을 추가합니다. 산성 콜라겐을 중화하기 위해 1 M의 NaOH의 0.5 ML을 추가합니다. (1,200,000 섬유 아 세포를 포함하는) 섬유 아세포 현탁액의 0.5 ML을 추가합니다.
- 6 웰 플레이트 내에서 세포 배양 삽입에, 감기 피펫에 솔루션을 전송합니다. 전체 솔루션의 12 ml를 균등하게 6 세포 배양 삽입으로 구분된다.
- 1 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 젤을 품어.
- 겔이 고체화 후, FM의 겔 잠수함. 거대 분자 crowders을 포함, 24 시간 후, 기존의 미디어를 버리고 새로운 용지로 교체합니다. 세포 배양 인서트의 외부로 세포 배양 인서트의 내부에 2 ㎖의이 용액의 부피를 추가한다.
- 24 시간 후,콜라겐 젤 위에 각질을 시드.
- 를 Trypsinize 37 ° C에서 5 분 동안 0.125 % 트립신 / 킬레이트 제를 사용하여 각화. 셀을 제거하고 혈청이 포함 매체와 트립신을 중화하기 위해 조심스럽게 플라스크의 측면을 누릅니다. 세포를 카운트하고 각질 세포 현탁액을 제조 (겔 당 30 만 각질 세포를 200 ㎕의 매체에 현탁).
- 세포 배양 삽입에서 흡인 된 미디어. 젤 위에 각질을 추가합니다.
- 1 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 젤을 품어.
- 케 라티노 사이트는 겔 표면에 부착 한 후,이 용액에 KSFM 또는 함께 겔 잠수함 CNT-57 세포 배양 인서트의 외부 FM의 세포 배양 삽입물 내부에 2 ㎖의.
- 거대 분자 crowders을 포함, 24 시간 후, 기존의 미디어를 버리고 새로운 용지로 교체합니다.
- 침수 문화 7 일 후, 공기 - 액체 인터페이스 문화를 올립니다.
- 셀 문화 인 이동깊은 웰 플레이트에 ERT. 세포 배양 삽입의 외부에 10 ml의 성층화 미디어를 추가합니다. 세포 배양 삽입 건조의 내부를 유지합니다.
- 5 % CO 2에서 37 ° C를 인큐베이터에서 문화를 품어하고, 다음 14 일 동안, 3 일마다 미디어를 변경합니다.
주 : 공기 - 액체 계면에서 2 주 후에 피부 당량 (냉동 또는 포르말린 고정 스냅 어느) 성숙 및 수확 할 수있다.
7. 수확 및 특성의 Organotypic의 피부 등가물
- 대기음 계층화 미디어.
- 핀셋을 사용하여 종이 타월에 문화가 삽입 전송하고 삽입물의 기지에서 남은 용지를 멀리 줘봐.
- 메스를 사용하여 배양 인서트의 내주면을 따라 절단.
- (애완 동물 막과 함께)에의 Organotypic 피부의 공동 문화를 수정합니다.
- 스냅 동결
- cryomold로 겔 구조를 전송합니다. 10월와 cryomold의 내부를 커버화합물. 10 초 동안 액체 질소에 cryomold를 놓습니다.
- 핀셋을 사용하여, 액체 질소에서 냉동 cryomold을 제거 알루미늄 호일에 포장 및 -80 ° C의 냉동고에 냉동 샘플을 저장합니다.
- 제 7 ㎛의 단면 두께로하는 저온 유지 장치로 샘플을 동결.
- 포르말린 고정
- '생검 카세트'로 '조직 검사 스폰지 패드'를 놓습니다. 젤 스폰지 패드로 구성 전송합니다. 겔 구조의 상단에 부드럽게 다른 스폰지 패드를 놓습니다. 카세트를 닫습니다.
- 완전히 실온에서 48 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린에 카세트 잠수함. 카세트를 제거하고 포르말린 폐기물을 폐기합니다.
- 먼저 에탄올 시리즈 탈수 한 후 점차적으로 왁스 샘플을 침투하여 왁스 블록에 고정 샘플을 포함. 제 마이크로톰와 왁스 블록.
- 스냅 동결
- 스킨 상당의 특성
- 면역 염색
- 냉동 섹션의 경우 :
- 실온에서 1 시간 동안 (1X PBS에 희석) 10 %의 염소 혈청에서 섹션을 인큐베이션. 1X PBS에 세척 부분은 염소 혈청을 제거합니다.
- 일차 항체와 함께 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 100 희석), 실온에서 90 분 동안. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오.
- 이차 항체로 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 400 희석), 실온에서 30 분 동안을 알루미늄 호일로 덮인 용기. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오.
- 마운트는 커브 글라스에 미디어를 장착하여, 슬라이드. 알루미늄 호일 커버 샘플과 밤새 건조 할 수 있습니다.
- 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 이미지.
- 포르말린 고정 파라핀 포함 된 섹션의 경우 :
- 왁스 제거 섹션 (및 재수) 물과 에탄올의 비율을 내림차순 (크실렌 - 100 % 에탄올- 90 % 에탄올 - 80 % 에탄올 - 70 % 에탄올 - 물). 완벽한 솔루션 샘플을 잠수함. 각각의 탈 왁스 단계는 3 분이어야합니다.
- 30 분 동안 1 % 과산화수소 중에서 섹션을 인큐베이션. 5 분 동안 1X PBS 섹션을 씻으십시오.
- 20 분 동안 120 ° C에 구연산 용액 섹션 (10 ㎖ 시트르산 용액을 90 ml의 물에 용해) 부화. 슬라이드는 실온에서 하룻밤 냉각시킵니다. , 1X PBS로 세 번 세척 당 5 분 섹션을 씻으십시오.
- 실온에서 1 시간 동안 (1X PBS에 희석) 10 %의 염소 혈청에서 섹션을 인큐베이션. 1X PBS에 세척 부분은 염소 혈청을 제거합니다.
- 일차 항체와 함께 인큐베이션 부 (1 : 10 %의 염소 혈청 100 희석), 실온에서 90 분 동안. , 1X PBS로 세 번 세척 당 10 분 섹션을 씻으십시오.
- 실온에서 30 분 동안 (희석하지 않은) HRP 표지 된 폴리머와 섹션을 인큐베이션. 1X PBS, 세 번 세척 당 10 분으로 섹션을 씻으십시오.
- 미세 원심 튜브에 1 ㎖의 결합원체 1 방울과 DAB 기판 (3,3'- 디아 미노 벤지딘). 15 초 동안이 솔루션 섹션을 품어 - 5 분 (갈색 색상 = 긍정적 인 신호).
- 반응을 중지 흐르는 물에 섹션을 세척합니다.
- 5 분 동안, 헤 마톡 실린과 핵 Counterstain과. 흐르는 물에 섹션을 씻어.
- 1 분 산성 알코올 용액 섹션을 인큐베이션. 흐르는 물에 섹션을 씻어.
- 2 분 동안, 스콧의 수돗물 용액에 섹션을 품어. 흐르는 물에 섹션을 씻어.
- 옵션 : 1 분 동안 에오신 섹션을 품어하고 흐르는 물에 씻는다.
- 크실렌 에탄올 상승 비율의 탈수 부 (- 80 % 에탄올 - 70 % 에탄올을 90 % 에탄올 - 100 % 에탄올 - 크실렌). 샘플이 완전히 스테이지 당 3 분 동안 침수되어 있는지 확인합니다.
- 마운트는 커브 글라스에 장착 미디어를 사용, 슬라이드. 공기 건조 하룻밤.
- 40 배 / 1.30 오일 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 이미지.
- 냉동 섹션의 경우 :
- 투과 전자 현미경 (앵커 피 브릴을 시각화하기 위해)
- 72 시간 동안 2.5 %의 글루 타르 알데히드에 샘플을 수정합니다.
- 1X PBS에서 워시 샘플, 세 번 세척 당 10 분.
- 작은 조각 (1mm 3)으로 잘라. 실온에서 1 시간 동안 1 % 오스뮴 테트 록 사이드, pH를 7.4에서의 포스트 픽스 샘플. 증류수에 세척 샘플.
주의 : 오스뮴 화이는 독성 및 독성 및 흄 후드에서 신중하게 처리해야한다. - (- 50 % 에탄올 - 75 % 에탄올 - 95 % 에탄올 - 100 % 에탄올 - 아세톤, 25 % 에탄올) 단계 당 20 분 동안 상승 에탄올 시리즈를 통해 탈수 샘플.
- 100 % 아세톤에 시료를 침지하여 침투 : 아랄 다이 트 수지 (1 : 1)를 밤새 6 : 1이어서 1 시간 동안 3 일에 한 다음 실온에서 30 분, 대. 40 ° C에서 1 시간 동안 신선한 아랄 다이 트 수지의 제 2 변화이어서 실온에서 2 시간, 신선한 아랄 다이의 수지 샘플을 담근다. 세 번째 신선한를 남겨45 ° C에서 1 시간 동안 raldite 수지 변화는 50 ℃에서 1 시간 동안 네번째 신선한 아랄 다이 수지 변화를 떠난다.
- 중합 가능하도록 24 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션.
- 유리 칼을 사용하여 단면 시료를 1 ㎛ 두께의 얇은 부분 반을 얻었다. 메틸렌 블루와 얼룩 부분은 조직 학적 관찰합니다. 제 70 nm 인 매우 얇은 섹션을 구하여 구리 그리드 상에 각 부분을 수집하는 샘플.
- 10 분 동안 3 % 납 시트르산 용액을이어서 15 분 동안 5 % 우라 닐 아세테이트 용액으로 염색 섹션.
- 30,000X의 확대 한 투과 전자 현미경 (100 kV의) 이미지를 획득.
- 면역 염색
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Representative Results
고분자 쇄도 특히, ECM 증착을 향상시킬 수 있었다 섬유 아세포 배양 제어 비해 더 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴 증착 (도 1, 세포층을도 1a, 콜라겐 I, 1B, 콜라겐 IV, 1C, 피브로넥틴). 탈세 포화되면, 각질 세포 (그림 1, 매트릭스)에 비해 섬유 아세포는 콜라겐 I, IV 및 피브로넥틴의 주요 예금자가 있다고 분명했다.
도 2에서, 섬유 아세포보다 각질 콜라겐 VII의 주요 생산자 있다고 관찰되었다. 이것은 (베니 등, 2015) 시험 관내에서 성공적으로 증착 된 콜라겐 VII의 첫 번째 보고서입니다.
세포 - 유래 매트릭스를 사용하여 특정 antibod 면역을 나타내었다이거 야. 이 고전적인 방법이지만, 그것의 전체의 ECM을 시각화하고 완전히 거대 분자 crowders의 효과를 평가하는 중요했다. 간섭 반사 현미경 (IRM)를 사용하여, 행렬의 전체 범위 (그림 3) 체포됐다. IRM은 이미지 항체 염색 오버레이는 ECM의 총량에 대해서, 해당 ECM 성분의 상대적인 양을 나타낸다.
차원 비트로 피부 모델에서, MMC는 성숙의 Organotypic 피부 공 배양 (도 4)을 얻었다 3 주 5주에서 배양 시간 축합. 헤 마톡 실린 및 에오신 염색는 완전히 차별화 된 표피 부족 혼잡 제어 문화에 비해 삼주에서, 거대 분자 crowders와 문화가하는 pluri 성층 표피와 기질이 풍부한 진피로 구성되어 있음을 보여 주었다. 또한, 강렬하고 지속적인 콜라겐 VII의 면역 염색은 마에서 검출되었다제어 문화에 약한 여드름 콜라겐 VII의 면역 염색에 비해 붐비는 세포 배양의 1- 표피 접합부. 투과 전자 현미경 (도 5)의 기능 콜라겐 VII 보여주는의 Organotypic 문화에서 브릴 고정구의 존재를 보여 주었다.
도 1 : 혼합 고분자 크롤 (mMMC)은 시험관 내에서 진피 - 표피 접합부 성분의 증착을 개선 (A) 콜라겐 I 증착이 좋 broblasts에서만 mMMC (세포층 행렬)에 의해 강화된다.. 공동 문화의 크롤은 과학 broblasts에 의해 콜라겐 I 생산을 자극 각질 가장 콜라겐 I과 쇼를 생산하고 있습니다. (B) 과학 broblasts에 의해 콜라겐 IV 증착 군집에 의해 강화된다. 이 붐비는 공동 문화에서 더욱 명확하게 볼 수 있습니다. 참고로, keratinocyt주로 세포 관련 콜라겐 IV 쇼 또는 세포 내 콜라겐 IV,하지만하지 않는 pericellular 행렬 스테인드 말이지. 공동 문화에서는 두 종류의 세포는 콜라겐 IV는 각질 세포 섬을 살려주는 과학 broblasts와 주로 관련되는으로 분리. (C) 피브로넥틴 증착은 파이 broblasts 함께 볼과 강하게 내부 (셀 층과 매트릭스) 군집에 의해 강화되었다. 공동 문화에서 과학 bronectin의 망상 메시는 각질 세포의 섬을 살려주 만 Fi를 broblasts과 연관이 있었다. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 수치는 중추 신경 자극제 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 혼합 된 고분자 크롤 (mMMC가)의 증착을 용이하게과학 BRIL 건물 콜라겐 VII 정박. 콜라겐 VII 증착 (A) 망상 증착 패턴 만 mMMC에서 과학 broblasts에 분명하다. 공동 문화에서 세포 외 콜라겐 VII 강하게 각질 섬 사이에 과학 broblast 식민지와 연결되어 있습니다. 각질 세포는 pericellular 및 세포 내 콜라겐 VII가 더 강하게 mMMC의 존재로 표현을 보여줍니다. 세포 용해 후, 콜라겐 VII 발자국은 mMMC 처리 Fi를 broblast 문화에서 과학 북동 세분화 층에서 볼 수 있습니다,하지만 식별 Fi를 brillar 증착는 공동 문화에서 검색됩니다. 용해 세포 층 (B) 면역 블롯 분석은 붐비는 과학 broblasts 및 각질 세포 배양 모두가 솟아 대조군에 비해 유의하게 더 많은 콜라겐 VII가 포함되어 있음을 보여준다. 검색된 콜라겐 VII는 주로 pericellular 파생됩니다. (C) B의 농도계 분석 mMMC가 셀 준 양을 증가 시킨다는 것을 보여준다파이 broblasts 8 배 및 각질 세포의 2 배 정도 (D) 콜라겐 VII. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 수치는 중추 신경 자극제 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 그림 3 : 간섭 재 FL ection 현미경 (IRM) 개별 ECM 성분 (콜라겐 IV와 과학 bronectin)의 분석에 mMMC에서 문화가 강화 된 세포 외 증착에 의해 시각으로 섬유 아세포 발자국 더 많은 총 ECM이 포함되어 있습니다. 전체 ECM 증착을 시각화하기 위해 IRM은 항체 염색은 한계가 있었다 모든 ECM을 정량화하기 위해 사용되었다. IRM 명확 제어 상태에 비해 mMMC 하에서 전체 매트릭스 양과 패턴을 보였다. 스케일 바는 20 μm의 =. 이 그림은있다에서 베니 등. 수정, 2015 년 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 혼합 된 고분자가 잠긴 단계 (mMMC)를 크롤 링 피부 등가물의 피부 - 표피 접합부 (DEJ)의 성숙을 향상 섬유 아세포 함유 콜라겐 젤 위에 각질 세포에 접종 1 주일 동안 잠수를 유지하고, 다음에 해제 공기 - 액체 인터페이스입니다. 고전 프로토콜에서, 콜라겐 VII (녹색) 문화 3 주 총 후 결석했지만, 오주 후 피부 등가물에 출연했다. 반면, mMMC에서, 콜라겐 VII는 이미 삼주 후 강하게 분명 더욱 강하게 표준 문화와 비교 오주 후 염색했다. 헤 마톡 실린 및 에오신 (20 배 확대) 염색 C파이에 피부 상당이 빠른 프로토콜, strati Fi를 양이온 및 만기 유지 가속화되었다고 rmed. 스케일 바 = 100 μm의. 이 수치는 중추 신경 자극제 등의 알에서 수정되었습니다. 2015 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. mMMC와 3 주 문화 프로토콜 이후의 Organotypic 공동 문화의 초기 진피 - 표피 접합부의 mMMC 미세 구조 연구에서 생성 된 피부 등가물의 과학 brils 정박의 드 노보 형성의 증거 (A, B)는 고정 유사한 구조를 제안한다 문화 3 주 후에 비 혼잡 피부 등가물 (C)에 결석 과학 brils (화살표). 이 그림은 fr과 수정 된톰 베니 외. 2015 년은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System - HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100 U/ml penicillin and 100 U/ml streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4 mg/ml hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5 mg/ml transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
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