Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53643
Automatic Translation
*1, *1,2, 1
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Introduction

הרעיון של הפעלת החיסון האמהית (MIA) מקורו מחקרים באפידמיולוגיה על הקשר בין זיהום אימהי עם אוטיזם וסכיזופרניה 1. בשל העדר של פתוגנים ויראליים שכפול לגילוי בשליה או במוח העוברי לאחר זיהום ויראלי אימהי 2,3, השפעת הזיהום על הצאצאים משערת להיגרם על ידי הפעלת המערכת האימהית החיסון ולא פתוגנים עצמם .

כדי להבהיר את היחס אפקט-ו-הגורם בין MIA והפרעות פסיכיאטריות, הזרקת מסונתז כימית, polyinosinic גדילי RNA כפול ויראלי לחקות: חומצה polycytidylic (פולי (אני: C)) לתוך מכרסמים בהריון כבר בשימוש נרחב כמו במודל חיה עבור MIA 4,5. פולי (אני: C) הוא מוכר על ידי קולטן לחיוג כמו 3 (TLR3), ומנהל מערכתי של פולי (אני: C) גורם לתגובה דלקתית חריפה ויראלי דמוי. אחד המנגנונים שבאמצעותם פולי (אני: C) יחסי ציבורליקויי neuropathologies התנהגותי oduces אצל צאצאיהם הם לגרום לחוסר איזון של ציטוקינים דלקתיים פרו ואנטי בציר האימהי-שליה-העוברי 6. כמה קבוצות אימצו את המודל MIA להבין את האטיולוגיה של הפרעות פסיכיאטריות 7, ובשל אינטרסים מגוונים בקרב קבוצות מחקר, בנקודות זמן שונות של הפעלה חיסונית שימשו להשיג הפרעות שונות על התפתחות המוח והתנהגויות 7.

המעבדה פול ה פטרסון במכון הטכנולוגי של קליפורניה מאמצת את האסטרטגיה של הזרקת פולי (אני: C) לעכברים בהריון עובריים 12.5 ימים (E12.5), אשר הוכיחה בהצלחה כי MIA הוא מסוגל גרימת התנהגותי, נוירולוגיות, ושינויים אימונולוגיים אצל צאצאיהם המשויכים אוטיזם וסכיזופרניה 8-11. העבודות הקודמות שלנו מראות כי צאצאי MIA להציג ליקויים התנהגותיים (למשל, impairmen החברתיt, גירעון תקשורת, התנהגות שחוזרת על עצמו, התנהגות כמו חרדה, ונסתרי עיכוב גירעון 8,10,12), חוסר איזון dysregulation וציטוקינים חיסוני 8,13,14, שינוי של ביטוי גנים במוח עוברי 15, אובדן של תאי פורקינג ב lobule VII של מוח קטן 11, שינוי של נכסים הסינפטי בהיפוקמפוס 9, אינטראקצית סביבת x גן 13, שינוי של חדירות מעי, ורכב חיידקים במעיים 16. יתר על כן, אסטרטגיות טיפוליות-מונעות מפותחות גם 13,16,17 מערכת מודל זה. גרימת MIA ב E12.5, ואחרים הראו כי MIA מייצרת ההפעלה microglial עוברית שינוי התפתחותי כולינרגית בקידמתו הבזליים 18, אינטראקציה ספציפית זן 19, המוח מוחין synaptosomal מומים ultrastructural, מומים hyperfunction שרשרת הנשימה במיטוכונדריה מוחין, downregulation של מולקולות synaptosomal מוחין 17 ,התנהגויות דיכאוניות דמוי, ירידת קוגניציה הגברה לטווח ארוך בהיפוקמפוס (LTP), והגירעון הנוירוגנזה בהיפוקמפוס מבוגר 20.

כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת של איך לגרום MIA ב E12.5 ידי פולי (אני: C), כמו גם פרדיגמות של איך ליישם מודל זה ללמוד את האטיולוגיה של אוטיזם וסכיזופרניה. חשוב לציין כי MIA הוא גורם סיכון עבור מגוון רחב של הפרעות 4, ותוצאותיה רגישות במיוחד את הזמן ואת שיטת האינדוקציה וכן הבעלים של הסכרים בהריון. ככזה, אפילו סתירות קלות בין מעבדות לעתים לגרום שחזור נמוך ו / או פנוטיפים שונים אצל צאצאיהם. השיטה שלנו היא תוכננה במיוחד עבור אלו המעוניינים ללמוד MIA כגורם סיכון סביבתי לאוטיזם וסכיזופרניה, ואת התיאור המפורט הניתנים יסייע לחוקרים לשפר השחזור של הנתונים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים בוצעו תחת האישור של המכון בקליפורניה של טיפול בבעלי חיים מוסדי טכנולוגית ועדת השימוש (IACUC).

1. הכנה עבור זוגות מתוזמן-הזדווגות

  1. השתמש לפחות 6 סכרים עבור ניסויים התנהגותיים ו -3 עבור ניתוח ביטוי גנים.
    הערה: משתמש כפול ממספר עכברות מוערכות, כמו שרק כ -50% מהעכברים יהיו פקוק מן-הזדווגות מתוזמן.
  2. השתמש עכברות ללא הריון מוקדם ועל פי 8-16 שבועות של גיל.
    הערה: עכברות שיש חשיפה מינית לפני עכברי זכרים אבל לא הייתה בהריון כשרים.
  3. בית נקבות העכברים יחד ומניחים הכלובים אחד ליד השני כדי לסנכרן מחזור הייחום שלהם. השתמש כלוב עכברים רגיל עם גובה של מעל 5.5 אינץ ורצפת אינץ 'מרובע פן 75 על מנת לאפשר דיור 5 עכברים בוגרים. לייבל כל עכברה באמצעות אגרוף באוזן.

2. הגדרת מתוזמן-מחצלתing זוג

  1. הגדרת שעות 0-2-הזדווגות מתוזמן לפני המחזור הכהה מתחיל. מניחים שתי עכברות בכלוב אחד. להוציא העכברים ולשקול אותם בנפרד. רשום את משקל הגוף של כל עכבר נקבה.
  2. יש לשים את סמן אחד זכר לתוך כל כלוב עם שני נקבות העכברים. השתמש הזדווגות שלישייה כדי למזער את השפעת הבלבול האבהית.

3. בדוק תוסף הנרתיק (E0.5)

  1. בדוק את hr נקבת עכברי 0-4 לאחר חושך המחזור מסתיים. הרם בעדינות את העכברה מבסיס הזנב ולאפשר בעכבר כדי לתפוס את רשת התיל, עליון כלוב, או קצה כלוב.
  2. חפש סימני תוסף הנרתיק: תוסף הנרתיק הוא מסה לבנבן גלוי פתח הנרתיק. אם התקע אינו מובן מאליו, בעדינות להכניס קצה פיפטה 200 μl לתוך פתח הנרתיק. התנגדות מן הקרישה מאשר היווצרות תוסף נרתיק. בדוק את תוסף הנרתיק פעם ביום.
    הערה: תוסף הנרתיק הוא רק אינדיקציה לכך הזדווגות התרחשה, ולכן לא גרםהריון uarantee. תוסף הנרתיק עלול להיות קשה לזהות זנים מסוימים של עכברים. פנה לעזרה מתוך מטפלת עכברים מנוסית כדי להגדיל את הדיוק של זיהוי תקע.
  3. הזז את העכברים הם מחוברים כלוב חדש וקבוצה לשכן אותם. הגדר את היום של הופעת תוסף נרתיק כמו 0.5 יום עוברי (E0.5).

4. ביום E10.5-11.5, בדקו הריון

  1. הרם בעדינות את בבסיס הזנב ולאפשר בעכבר כדי לתפוס את רשת תיל, העליון כלוב, או קצה הכלוב. שים את אזור הבטן כדי לבדוק סימנים של הריון, למשל, בליטה באזור הבטן (איור 1).
    הערה: הסימן של הריון הוא תמיד יותר מובן מאליו E11.5 מאשר E10.5.
  2. לשקול את העכברים כדי לוודא הריון. העכבר בהריון בדרך כלל שוקל כ 20% יותר כבד ב E10.5 ו -30% יותר כבד ב E12.5 בהשוואה לעכבר שאינן בהריון (איור 2). בית בודד העכברים בהריון בכלובים נקיים.

5. 20 מ"ג /ק"ג פולי (אני: C) הכנה

  1. השתמש לפחות 6 סכרים לכל קבוצה עבור ניסויים התנהגותיים ו -3 לכל קבוצה עבור ניתוח ביטוי גנים. הכן את הסכום המתאים של פולי (אני: C) פתרון.
  2. לשקול את פולי (אני: C) אבקת צינור חרוטי 50 מ"ל לעשות לריכוז סופי של 40 מ"ג / מ"ל. על מנת למזער ולתקנן את הלחץ שנגרם על ידי נפח הזרקה, להזריק 5 μl של פולי (אני: C) פתרון עבור כל גרם של משקל גוף העכבר (5 μl / g, או 5 מ"ל / ק"ג). כדי לגרום MIA, אנו מזריקים 20 מ"ג של פולי (אני: C) לק"ג.
    הערה: ריכוז פולי (אני: C) הפתרון הנדרש הוא (20 מ"ג / ק"ג) / (5 מ"ל / ק"ג) = 4 מ"ג / מ"ל. מאז פולי (אני: C) אבקת מכיל 10 פולי% (אני: C), אנחנו צריכים לעשות לריכוז סופי של (4 מ"ג / מ"ל) /0.1= 40 מ"ג / מ"ל ​​של פולי (אני: C) פתרון.
    זהירות: פולי (אני: C) אבקה קלה מאוד. תיזהר לא לאבד את כל אבקה בעת ההעברה מן המרית אל צינור החרוטים.
  3. מוסיף את הנפח המקביל של נתרן כלורי 0.9% (מלוח) לתוך האמבטיה חרוטידואר ולסגור את המכסה. ממס את האבקה על ידי הגלגול המלוח האגל בעדינות על פולי (אני: C) האבקה עד הפתרון הוא ברור. צנטריפוגה צינור החרוטים ב 800 XG דקות 1 (איור 3 ג). סנן את פולי (אני: C) פתרון על ידי 0.22 מיקרומטר הסינון. מעבירים את פולי (אני: C) הפתרון צינור 1.5 או 2 מ"ל microcentrifuge. אופציונלי: השתמש ספקטרופוטומטר למדוד את היחס 260/280 של פולי (אני: C) פתרון. ודא היחס הוא בין 1.54-1.82 (איור 3) כפי שתואר על ידי היצרן. הערה: המלח משמש כדי לפזר פולי (אני: C) אבקה ולשמש הזרקת בקרה צריכה להיות בכיתת סטרילית תרופות.

6. מלוחים או פולי (אני: C) הזרקה על E12.5

  1. לשקול את העכבר על הסקאלה והחזיר אותו לתוך הכלוב. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפח ההזרקה הן מליחים פולי (אני: C) עכברים: משקל גוף (ז) כפול 5 = נפח הזרקה הרצוי (μl). השתמש insul 0.3 מ"לב מזרק לצייר את הווליום של תמיסת מלח או 20 מ"ג / ק"ג פולי מחושב (אני: C) פתרון, למשל, 150 μl עבור עכבר 30 גרם.
  2. בעדינות להרים את העכבר על ידי בבסיס הזנב ולמקם אותו על גבי הכלוב. להתמודד עם העכבר בעדינות כדי למנוע תופעות של בלבול הנגרמות על ידי מתח. הכנס את המחט, שפוע עד, בערך בשעה 20 ° ביחס העכבר למרכז שתי פטמות העליונות (איור 4), ולהזריק את מלוחים או פולי (אני: C) פתרון. הערה: המחט צריכה להיות מוחלף עבור כל עכבר לאחר ההזרקה.
  3. מניחים את העכבר חזרה לכלוב בבית שלו. מניח את הכלובים בחדר תנועה שקט, נמוך כדי למנוע את תופעות בלבול האחרות.

7. היום שאחרי פולי (אני: C) הזרקה (E13.5)

  1. בדקו את העכברים שהוזרקו על למחרת. השתמש בקנה מידה למדוד משקל גוף.
    הערה: פולי (אני: C) מוזרקת עכברות הרות בדרך כלל משמין פחות מלוח מוזרק עכברים ביום שאחרי injשיקוף.
  2. נא לא להפריע העכברים עד הצאצאים נולדים.

מד 8. Offspring MIA

  1. על מנת למזער את ההשפעות של בלבול אינדוקצית MIA, פעל בהתאם להנחיות שלהלן, כדי לאמוד את השימוש של צאצאי MIA.
    1. אל תכלול את ההמלטות מן מוקדם או לידה מתעכבת, או אם גודל ההמלטה הוא קטן מ -5.
    2. להרדים את הגורים המופרזים על ידי ה- CO 2 אם גודל ההמלטה הוא גדול מ -10.

9. אופציונליים: לבחון את התגובה הדלקתית החריפה לאחר MIA

  1. להקריב את עכברי 3 שעות להריון לאחר מלוחה או פולי (אני: C) הזרקה בשיטה כמתואר בפרוטוקול הוועדה שאושרה לטיפול בבעלי החיים של המוסד.
    הערה: נקע בצוואר רחם בדרך כלל עדיף כפי שהוא ממזער את ההשפעה של CO 2 / המתת חסד תרופות על הסכר עובר.
  2. אסוף את הטחול של עכברים בהריון מבוגר ולבודד את השליה החזייה עובריתב תחת סטראו.
    1. לקבלת אוסף הטחול, להניח את העכבר על צלחת לנתיחה ולרסס 70% אתנול על אזור הבטן של עכברים בהריון. השתמש זוג מספריים סטרילי לעשות חתך אנכי במרכז אזור הבטן מתחת בית החזה דרך העור.
    2. הטחול יושב ברבע הבטן המעולה השמאל. שימוש במלקחיים כדי לבודד את הטחול. מגלגל את הטחול על מגבי משימה עדינים להסיר את רקמת השומן סביב האיבר. אסוף בערך 50 מ"ג של רקמת טחול ומניח אותם בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol כדי למנוע שפלת חומצות גרעין. אחסן את דגימות ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
    3. לקבלת אוסף השליה, משוך בעדינות את קרן הרחם מהגוף. מניח את קרן הרחם בצלחת פטרי המלאה בופר פוספט autoclaved (PBS) ולהשאיר את המנה על קרח. השתמש בשתי מלקחיים לקרוע את דופן הרחם ולחשוף את שק מי השפיר.
      1. בזהירות להשתמש במלקחיים כדי לפתוח את שק השפיר מבלי לפגוע השליה והעובר. הפרד את השליה של העובר ולחתוך את חבל הטבור קרוב השליה ככל האפשר. הסר את פסולת שק השפיר מהשליה. מניחים את השליה בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol. חנות המדגם ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
    4. לקבלת אוסף המוח העוברי, לאחסן העובר RNA לייצב חיץ משלב 9.2.2 עד לנתיחה. להקניט את קרום pial ומהחדר של המוח באמצעות # 5 מלקחיים עדינים תחת סטראו. מוציאים בזהירות את כל קרום מהמוח עוברי. מניחים את המוח העוברי בנפרד צינורות Eppendorf עם 500 RNA μl לייצב חיץ או TRIzol. חנות המדגם ב במקפיא -80 ° C עד השימוש.
  3. חלץ את RNA מרקמות ולהמיר את RNA ל cDNA. ניתוח ביטוי גנים Il6 ב cDNA ידי-t אמיתיIME PCR.
  4. חלץ את RNA מן הרקמות על ידי ביצוע הפרוטוקול לייצור TRIzol. אם הרקמות מאוחסנות במאגר ייצוב RNA. להפשיר את המדגם ומסובב למאגר. העברת רקמה על ידי טיפ eppendorf אחר עם 500 μl TRIzol ולהמשיך מיצוי RNA.
  5. השתמש ספקטרופוטומטר למדידת ריכוז, 260/280 ו 260/230 יחס של RNA. ודא היחסים הם מעל 2.0.
  6. לחסל את זיהום הדנ"א על ​​ידי טיפלו RNA עם DNase I. מערבבים 1 מיקרוגרם RNA, 1 μl חיץ התגובה 10X, 1 μl RNase ללא DNase, ומים חופשי nuclease לנפח סופי של 10 μl. דגירת תערובת האמן על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 1 פתרון DNase להפסיק μl כדי לסיים את התגובה. דגירה את התערובת על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  7. הפוך לתמלל את RNA ל cDNA. השתמש 20 תגובות μl, ועד 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל לכל תגובה. מערבבים 4 μl 5x שעתוק לאחור (RT) חיץ תערובת התגובה, 1 μl reverse טרנסקריפטאז, 11 תבנית RNA μl לאחר הטיפול עם DNase אני 4 μl nuclease ללא H 2 O לבצע פתרון 20 μl הסופי. לתכנת את תנאי Cycler תרמית עבור RT. תנאי הגנרית כוללים: שלב 1: 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 2: 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות; שלב 3: 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; שלב 4: להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס. לדלל את cDNA 5 פעמים. עבור אחסון לטווח קצר, אחסן את cDNA ב 4 ° C.. עבור אחסון לטווח ארוך, להקפיא את cDNA ב -20 ° C.
  8. ניתוח ביטוי גנים Il6 ב cDNA על ידי PCR בזמן אמת לנרמל את ביטוי הגנים Il6 כדי בטא אקטין ביטוי גנים.
    1. הכן תערובת אב Il6 וזיהוי β-אקטין. השתמש 25 התגובה μl, מיקס מאסטר עבור כל גן כולל 12.5 μl SYBR גרין מיקס, 0.5 μl של 10 פריימר מיקרומטר קדימה, 0.5 μl של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה ו -6.5 μl nuclease ללא H 2 O.
    2. מקום 5 μl 5x cDNA מדוללt בתחתית הבאר של צלחת תגובה 96-היטב אופטית. פיפטה 20 μl של תמהיל אמן זה טוב לעשות תערובת PCR 25 μl סופי. בשלושה עותקים כל גן עבור כל דגימה. חותם את הצלחת באמצעות סרט דבק אופטי. ספין למטה את הצלחת ב 800 XG 3 דקות ב 4 ° C השתמש בתכנית הרמה בזמן האמת PCR: שלב 1: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב 2: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות; שלב 3: 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות וטמפרטורה 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. להוסיף צעד נוסף עבור עקומת דיסוציאציה.

10. בדוק את חריגות ההתנהגות Offspring למבוגרים MIA (אופציונלי):

  1. לבצע את בדיקות התנהגות בגילי 8-12 שבועות. שנה את המצעים כלוב לפחות 3 ימים לפני הבדיקה. להסתגל העכברים לחדר בדיקות התנהגותיות לפחות 30 דקות לפני הבדיקה.
  2. עבור עיכוב prepulse (PPI), לרסן את העכברים גליל פרספקס עם חיישן piezo חשמלי מתחתיו. להסתגל העכברים אל PPIתא למשך 5 דקות. לחשוף את העכברים עם 6 ניסויים של 120 רעש לבן dB (בהלה).
  3. ואז לחשוף את העכברים עם תערובות אקראיות של 14 מחקרים של רעשי רקע, 14 מחקרים של רתיעה, 14 מחקרים של prepulse 5 dB (5 dB גבוה רעש רקע) + הרתיעה (PPI5), ו -14 ניסויים של prepulse 15 dB (15 dB גבוה מ רעשי רקע + רתיעה (PPI15).
  4. הממוצע את תגובת בהלה עבור 6 הניסויים הראשונים של 120 ניסויים dB. הממוצע את תגובת בהלה עבור גירויים בודדים אחרים. סמוי ערך עיכוב prepulse ידי (רתיעה - PPI5 או PPI15) / רתיעה.
  5. עבור בדיקת שדה פתוח, במקום את העכבר בפינה של זירת כיכר פתוחה (50 x 50 x 50 סנטימטרים 3). רשום את מסלולו של העכבר במשך 10 דקות באמצעות מצלמת רכוב תקרה. הגדר את מרכז הזירה כאזור מרכז (17 x 17 ס"מ 2). לכמת את המרחק, ערכי אזור המרכז, ואת משך זמן באזור המרכז ידני או על ידי תוכנת ניתוח אוטומטי מבוסס תמונה. עבור בדיקה לקבור שיש, לאקלם את העכבר לכלוב בדיקה עם עמוק 5 סנטימטר דחוס, נקיים, מצעי אורן אספן במשך 10 דקות. החזר את העכבר homecage שלה. למקם בעדינות 20 גולות זכוכית 1.5 ס"מ קוטר כחול כהה בצורה של 4 x 5 ההסדר. מניחים את העכבר חזרה לכלוב הבדיקה עם גולות במשך 10 דקות. ספירת גולות כי כבר קבור משך הבדיקה 10 דקות.

11. בדוק בנוירופתולוגיה המוח הקטן אצל צאצאיהם למבוגרים MIA (אופציונלי):

  1. להרדים את מליחי צאצאים בוגרים MIA על ידי הרדמה. Perfuse את העכבר עם 50 מ"ל PBS ולאחר מכן 50 מ"ל 4% paraformaldehyde דרך מערכת הלב וכלי הדם.
  2. הסר את המוח בזהירות postfix המוח paraformaldehyde 4% בין לילה ב 4 מעלות צלזיוס. שוטפים את המוח עם PBS שלוש פעמים ולאחסן את המוח ב- PBS עם אזיד הנתרן 0.02% ב מקרר 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: המוח postfixed ניתן לאחסן PBS עם 0.02% טפשאזיד ium במקרר עד חודש.
  3. סעיף המוח לתוך 50 מיקרומטר פרוסות דקות sagittally באמצעות vibratome. אסוף את החלקים במוח באמצעות עט מברשת רך. להפסיק את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים את הסעיפים מי חמצן 0.6% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. דגירת מקטעי נוגדן אנטי calbindin מדולל למאגר חסימה (סרום עיזים 10% עם יזיד הנתרן 0.1% Triton X-100 לבין 0.02% ב PBS) למשך הלילה בטמפרטורת חדר. ואז דגירה את הסעיפים המתאימים נוגדנים משני biotinylated מדולל חסימת חיץ עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. דגירת מקטעי DH avidin - חיץ peroxidase H מורכב Biotinylated לזהות את ביוטין עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. לפתח את החלקים באמצעות מצע peroxidase לדמיין את האנטיגן. שטפו את החלקים עם PBS שלוש פעמים בין השלבים. הר בסעיפים גבי שקופיות מיקרוסקופ. תמונת הסעיפים תחת מיקרוסקופ.

    6. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הזרקה של 20 מ"ג / קילו פולי (אני: C) ב E12.5 יכולה לעורר תגובה דלקתית חריפה בציר האימהי-שליה-עוברית לזרז השפעה כרונית להתפתחות מוח פנוטיפים התנהגותיים 12,13. רמות גבוהות של ציטוקינים מעודדי דלקת, Interleukin (IL) -6, הוא אינדיקטור אמין של תגובה דלקתית חריפה לאחר MIA. זמן השיא עבור ביטוי גנים Il6 בשליה והמוח של העובר נמצא hr 3 שלאחר פולי (אני: C) הזרקת 12,13. הראינו פולי (אני: C) גורם ביטוי גני Il6 גבוה ברחבי מוח טחול-שליה-העוברי האימהי (איור 5) (נתונים מותאמים וו et al, 2015.) 13. חוקרים יכולים לשלב פרדיגמה זו עם טיפול אחר כדי ללמוד את הגורמים שעשויים לשנות בתגובה דלקתית חריפה לאחר MIA, למשל, דיאטות אימהיות, עכברים שעברו מוטציה גנטי, תרופות נוגדות דלקת, וכו.

אף אוזן גרון "FO: keep-together.within-page =" 1 "> מצד שני, שינויים התנהגותיים הם גם סימני ההיכר של מודל MIA בדיקות התנהגותיות מספר יכולה להתנהל על הצאצאים הבוגרים MIA להפגין שונים אוטיסטים וסכיזופרנים דמוי. התנהגויות. באופן כללי, בהשוואה לצאצאים מלוחים, צאצא MIA יופיעו ערכי אזור המרכז פחות ומשך אזור מרכז קצר בילו מבחן שדה פתוח. הם גם להציג התנהגויות לקבור תכופות יותר בשיש לקבור בדיקת PPI הנמוך (איור 6) (נתונים מותאמים מ וו et al., 2015) 13. אובדן תאי פורקינג ב אונה במוח קטנה VII הוא סימן היכר אחר צאצאי MIA (Shi et al., 2009). כאשר מוכתמים נוגדן calbindin, יש פחות תאי פורקינג calbindin חיובי במוח הקטן האונה VII צאצאי MIA בהשוואה לצאצאי השליטה המלוחה (האיור 7).

3643 / 53643fig1.jpg "/>
איור 1. סימן עכברות הרות. עכבר אמצע הריון יכול להיות מזוהה על ידי הבליטה באזור הבטן שלה (חץ). זן עכבר C57BL מולד / 6 משמש כאן כדוגמא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. שינויים במשקל גוף בעכברי C57BL / 6N בהריון עוברי (E) 0.5-12.5 ימים. בהשוואת העכברים בהריון שאינו בהריון עם תקעי נרתיק נוכחי E0.5, את (א) משקל גוף (B) אחוז ממשקל הגוף עובר עלייה דרמטית ב E10.5 בעכברים בהריון. בהריון n = 10, שלא היו בהריון n = 5. הנתונים מוצגים כממוצע ± SE. *** P <0.001, ****p <0.0001. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. מדידה ספיגה של פולי (אני: C).. פתרון ודא היחס 260/280 הוא בין 1.54-1.82 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. פולים (אני: C) הזרקה העוברית (E) 12.5 ימים בעורפו העכבר בהריון בעדינות.. הזריקה ממוקמת נקודת האמצע של הפטמות העליונות. להזריק את המחט, שפוע עד, בערך בשעה 20 ° ביחס זווית אל העכבר. מולדת C57BL / 6 זן העכבר משמש כאן כדוגמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. פולים (אני: C) הזרקת מגביר ביטוי גני Il6 בציר מוח השליה-עוברי טחול של סכר נתונים מוצגים כממוצע ± SEM.. * P <0.05, ** p <0.01 (הנתונים במקור וו et al., 2015 שונה עבור סעיף 13). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. & #160;. MIA צאצאים בוגרים מציגים ליקויים התנהגותיים הקשורים endophenotypes של אוטיזם וסכיזופרניה במבחן השדה הפתוח, צאצא MIA (א) להיכנס למרחב המרכז בתדירות נמוכה יותר (B) להשקיע פחות זמן באזור המרכז. (ג) במהלך הבדיקה לקבור שיש, צאצא MIA לקבור יותר גולות מאשר להיות צאצא שליטה מלוח. הצאצאים MIA להפגין עיכוב prepulse (PPI) גרעון (D) prepulse 5 דציבלים (E) prepulse 15 dB. ממוצע ± SEM. * P <0.05, ** p <0.01 (הנתונים במקור וו et al., 2015 שונה עבור סעיף 13). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. MIA צאצאים בוגרים מציגים ליקויים נוירו הקשורים endophenotypes של אוטיזם. אובדן תאי פורקינג ב lobule VII הוכח בצאצאים מבוגרים MIA. חץ: תאי פורקינג Calbindin +. ML: שכבה מולקולרית, GCL: שכבת תאי גרגיר, PCL:. שכבת תאי פורקינג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MIA אינדוקציה בחלונות זמן שונים מדאיגה אירועי התפתחות המוח שונים במכרסמים, וכתוצאה מכך מובילה ליקויי neuropathologies התנהגותיים שונים אצל צאצאיהם. כאן, אנו תארנו פרוטוקול לגרום MIA בעכברים עם פולי (אני: C) הזרקה ב E12.5. שיטה זו של אינדוקצית MIA מובילה התנהגותי, נוירולוגיות, אימונולוגית, וחריגות עיכול הקשורים לאוטיזם וסכיזופרניה אצל צאצאיהם 8,10,11,16. חשוב לציין, כי MIA הוא גורם סיכון סביבתי, את הפנוטיפ של הצאצאים צפויים להיות וריאציה גבוהה מזו של עכברים ממודלים גנטיים של פרעות התפתחותיות. לכן, כדי במדויק ובעקביות ליצור אוטיזם פנוטיפים הקשורים סכיזופרניה באמצעות MIA, חשוב במיוחד כדי למזער משתנים נוספים שעשויים לבלבל את התוצאות.

ציר הזמן כמתואר בפרוטוקול צריך להיות מלווה קרובly. חלון זמן הזרקה נכון יבטיח כי MIA מדאיג בהתפתחות מוח צאצאים בשלב הרצוי. אינדוקציה של MIA ב E12.5 עכבר מתאים הפרעות לקראת סוף השליש הראשון להריון אדם 21 - תקופה שבה התפתחות המוח משמעותית מתרחשת, כולל פיתוח של תאי פורקינג ו putamen caudate, ו neurogenesis בשכבת קליפת המוח. חקירה נוספת יהיה צורך להוכיח את הקשר בין אובדן של תאים פורקינג ב MIA המוח הקטן ואת ההפרעות מוקדם של התפתחות המוח.

למרות שטיפול עקבי, בדיקה, ואפילו בעלי של סכרים שיצמצמו את השפעת הלחץ האמהי על פנוטיפ הצאצאים, פרוטוקול שלנו עדיין מכיל אזהרות כי החוקרים צריכים להיות מודעים. לדוגמא, אנו מייחדים בית הסכרים היום לפני הזריקה של פולי (אני: C) בכל שאר הריון. האסטרטגיה שלנו היא להשאיר את עכברות הרות בבית undisturbeסביבת ד. עם זאת, פעולה זו עלולה לגרום תגובת לחץ בסביבה האימהית. למרות שאנו לא יודעים אם תגובת לחץ נגרמת הבידוד הזה מפריעה להתפתחות של הצאצאים, השפעת MIA יכולה להיות שנצפתה על ידי ביצוע ההליך שלנו.

בנוסף, ברקע לכאביה הגנטי של העכברים צריך להיבחר ונבדקו בקפידה לזירוז MIA. עד כה, את ההשפעה של MIA משוכפלת בעיקר wild-type C57BL / 6N עכברים 8,10,13,16. אחרים גם הבחינו בתופעת MIA עכבר BTBR זן 19. הוכח פולי (אני: C) יכול לעורר תגובה חיסונית שונה בעכברים מהונדסים גנטי 13,22-24, אשר עשוי להציג תופעות בלבול נוספות לצאצאים.

במונחים של מספר ביולוגי משכפל, אנו משתמשים לפחות 6 המלטות לכל קבוצה עבור מבחני התנהגות או פיזיולוגיים 3 המלטות לכל קבוצה עבור ביטוי גנים, חלבונים, או חיסוניתגישות היסטוכימיה. אנחנו בודקים את כל הצאצאים בתוך חול במקום להשתמש צאצא אחד או שניים בתוך חול כדי למנוע הטיה ניסיונית. כמו כן, אנו מחשבים את הממוצע של הנתונים עבור כל הצאצאים בתוך חול, ולהשתמש ממוצע כי כנקודת נתונים אחד (כך n = מספר המלטות) כדי למנוע 13 סטטיסטיקה הולמת. הנתונים מכל מין הם אספו גם משום שאין הבדל מגדרים ברור נצפה במודל MIA 13.

הרציונל מאחורי מודד צאצאי MIA לפי גודל המלטה הוא לצמצם את השוני הנגרמת על ידי אבות אימהיים ואכפתית. גודל זבל הוכח לתאם עם התנהגויות סטריוטיפית C57BL / 6 עכברים 25. אנו משערים כי זה יכול להיות בגלל המשימה של משאבים במהלך הנקה אימהית ואכפתית. כדי למנוע זאת השפעה מבלבלת, גודל המלטת התקן הרצוי שלנו הוא 6-10 עבור C57BL / 6 עכברים.

גם כאשר בעקבות פרוטוקול מקרוב, הנסיין רשאי enלסתור תגובה חיסונית חלשה מדי או מוגזם חזק בעכברים להריון לאחר פולי (אני: C) הזרקה. כדי למנוע זאת, זה חיוני כדי לאמת את פעילות pyrogenic ו cytokinogenic של קבוצות שונות של פולי (אני: C). קבוצות והרבה שונים של פולי (אני: C) מאותה החברה עלולה להוביל לרמות שונות של תגובה דלקתית בעכברים; להדהים, הזרקת מינון זהה של פולי (אני: C) מ קבוצות שונות יכול לגרום עד 10 הבדלים של פי פלזמה IL-6 רמות 26. קביעת המינון יצווה של פולי (אני: C) עבור ניסוי MIA עוד יותר על ידי קריאת נתוני מדידת IL-6 נשים לא בהריון יכול לעזור להפחית את הווריאציה של החל מ אינדוקצית MIA.

אם יש צורך לשנות את המינון עבור קבוצות ספציפיות של פולי (אני: C), כמו כן, חשוב לשנות את הריכוז של פולי (אני: C) תמיסה להזרקה כך הנפח המוזרק נשאר פחות או 5 μl לגרם עכבר במשקל. לדוגמה, על פי manufהליך של acturer, פולי (אני: C) הוא מחדש כביכול ב ~ 10 מ"ג / מ"ל ​​מים להניב polynucleotide בתמיסה שנאגרו פוספט פיזיולוגיים. לעומת פתרון 40 מ"ג / מ"ל ​​שלנו, ריכוז נמוך מגדיל את נפחו של הזרקת ידי 4 קיפולים. עבור עכברים בהריון, נפח גדול של הזרקת חיץ עלול להגביר את הלחץ על העוברי ולהציג רצוי, בלבול תופעות לצאצאים. לכן, אנו בוחרים לפזר פולי (אני: C) אבקת נתרן כלורי 0.09% עם ריכוז סופי גבוה יותר על מנת לצמצם את היקף הזרקה.

IL-6 הוא נבחר להיות הסמן של תגובה דלקתית חריפה כי מחקר קודם זיהה איתות IL-6 כגורם קריטי בתיווך ההשפעות של MIA על התפתחות והתנהגות מוח. בעקבות פולי (אני: C) טיפול, IL-6 הוא ציטוקין שהוגברו ביותר הדם האמהי 10,12 השליה. והחשוב מכל, סמית et al. הראה כי מספרציטוקינים שהוגברו מאוד, רק IL-6 הציג הן תנאי הכרחי לזירוז של המוח MIA הקשורים וחריגות התנהגותיות. כלומר, הזרקה אימהית של אנטי-IL-6 עלולים למנוע מומים התנהגותיות transcriptomic נורמלים אצל צאצאיהם MIA, תוך נטרול ציטוקינים אחרים לא 10. יתר על כן, הזרקה אימהית של IL-6 רקומביננטי בלבד (ללא פולים (אני: C)) מתרבה תעתיק MIA הקשורים וחריגות התנהגותיות לראות במוח העוברי MIA והצאצאים 12,15.

בהשוואה לשיטות אחרות כדי לגרום MIA (למשל, lipopolysaccharide (LPS) או שפעת), פולי (אני: C) הוא בטוח יחסית ומספק דרך קלה לשלוט בעוצמת התגובה החיסונית. למרות התגובה הדלקתית שהושרה על ידי פולים אימהיים (אני: C) ממשל היא חריפה וחולף, השפעתו על התנהגויות הצאצאים והתפתחות המוח היא עמוקה. בסך הכל, פעם הטכניקה של גרימת MIA tפולי hrough (אני: C) הזרקה ב E12.5 היא שולטת, אפשר מכן להמשיך לבצע מבחני התנהגות וביולוגיים שונים כדי לבחון את שפעת גורם סיכון סביבתי זה על הצאצאים. במקביל, אפשר גם לשלב את השיטה עם שינויים גנטיים או טיפולים אחרים לפני, במהלך או אחרי הריון כדי לחקור את הסיבות וגישות טיפוליות ניתן אוטיזם וסכיזופרניה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

ברצוננו לכבד את פול ה פטרסון המנוח ד"ר על תרומתו התקדמות המודל MIA, אוטיזם, סכיזופרניה ומחקר. אנו מכירים סרקיס ק Mazmanian עבור אהדתו הגדולה על פרוטוקול זה; רובן מ באיון, איווט גרסיה-פלורס, קארן ג Lencioni, ולסלי א נוימן לסיוע מינהלי; עלי Khoshnan ויאן ג Ko על הסיוע על הצילומים; איליין י סיאו ונטליה Malkova עבור עצתם על אינדוקציה MIA; ג'פרי ס Cochrane, חואקין גוטיירז, קוואן פ לי, חיימה רודריגז, לורנה ג סנדובל, ונטלי א Verduzco לגידול צאן המומחה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי פרס מרכז NIH קונטה (NIH 5P50MH086383-04, לפול ח פטרסון); Autism Speaks (# 7670, לפול ח פטרסון); סימונס קרן (# 322,839, כדי סרקיס ק Mazmanian); אימון NIH גרנט (NIH / NRSA T32GM07616 כדי ק-HC); מלגת מחקר לתואר ראשון קיץ Caltech (SURF) (כדי ZY); Amgen חוקרים תוכנית בקלטק (כדי ZY); ו fr אחוות דוקטוריםאום הלאומית למדע המועצה, טייוואן (המל"ל 101-2917-I-564-039, לו'-LW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt SIGMA P9582
0.9% sodium chloride INJ. USP HOSPIRA NDC 0409-4888-10
MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" COVIDIEN 8881600145
50 ml conical screw cap tubes USA SCIENTIFIC 1500-1211
Nanodrop 1000 spectrophotometer THERMO SCIENTIFIC 1000 Optional
Stereomicroscope Wild Heerbrugg M5A Optional
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm Roboz RS-5045 Optional
RNAlater RNA stabilization reagent Qiagen 76104 Optional
TRIzol reagent Life Technologies 15596-026  Optional
RQ1 Rnase-free DNase Promega M610A Optional
iScript cDNA synthesis kit Bio-Rad 170-8891 Optional
FastStart universal SYBR green master mix with ROX  Roche 4913922001 Optional
Real-time PCR ABI 7300 Optional
Primer: Il6 forward Life Technologies TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC Optional
Primer: Il6 Reverse Life Technologies TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC Optional
Primer: beta-actin forward Life Technologies AGAGGGAAATCGTGCGTGAC Optional
Primer: beta-actin Reverse Life Technologies CAATAGTGATGACCTGGCCGT Optional
MicroAmp optical 96-well reaction plate Life Technologies 4306737 Optionl
MicroAmp optical adhesive film  Life Technologies 4311971 Optionl
EthoVision Noldus EthoVision Optionl
SR-LAB apparatus (PPI) San Diego Instruments  SR-LAB Optionl
Marbles PENN-PLAX Blue gem stones marbles Optionl
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Life Technologies 21600-069 Optionl
Paraformaldehyde MACRON 2621-59 Optionl
Vibratome Leica VT1000 S Optionl
Sodium azide Sigma S2002 Optionl
Triton x-100 Sigma X100 Optionl
Hydrogen peroxide solution Sigma 18312 Optionl
Goat serum Vector Laboratories S-1000 Optionl
Rabbit anti-calbindin antibody Abcam ab11426 Optionl
Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody Vector Laboratories BA-1000 Optionl
VECTASTAIN ABC Kit Vector Laboratories PK-4000 Optionl

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
  2. Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
  3. Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
  4. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
  5. Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
  6. Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
  7. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
  8. Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
  9. Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
  10. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  11. Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
  12. Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
  13. Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
  14. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
  15. Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
  16. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  17. Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
  18. Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
  19. Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
  20. Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
  21. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  22. Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
  23. Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
  24. Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
  25. Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
  26. Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 109 זיהום אימהי הפעלת חיסון האמהית (MIA) Polyinosinic: חומצת polycytidylic (פולי (אני: C)) עוברי 12.5 ימים (E12.5) אינטרלאוקין 6 (IL-6) אימהי-placental- ציר העובר תאים פורקינג המוח הקטן למוח האחורי אוטיזם סכיזופרניה הפרעות התנהגותיות
אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L.… More

Chow, K. H., Yan, Z., Wu, W. L. Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C). J. Vis. Exp. (109), e53643, doi:10.3791/53643 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter