Introduction
Begreppet moderns immunaktivering (MIA) härstammar från epidemiologiska studier på föreningen av moderns infektion med autism och schizofreni en. På grund av frånvaron av detekterbara replikering virala patogener i moderkakan eller fostrets hjärna efter moderns virusinfektion 2,3, är effekten av infektionen på avkomman hypotes vara orsakade av aktivering av moderns immunsystem snarare än de patogener själva .
Att belysa förhållandet mellan orsak och verkan mellan MIA och psykiatriska sjukdomar, injektion av kemiskt syntetiserade, viral härma dubbelsträngat RNA polyinosinic: polycytidylsyra (poly (I: C)) till gravida gnagare har använts i stor utsträckning som djurmodell för MIA 4,5. Poly (I: C) är erkänd av Toll-like receptors 3 (TLR3), och systemisk administrering av poly (I: C) inducerar viral liknande akut inflammatorisk respons. En av de mekanismer genom vilka poly (I: C) produces beteendeavvikelser och neuropatologier hos avkomman är genom att orsaka en obalans av pro- och antiinflammatoriska cytokiner i moderns-placenta och foster axeln 6. Flera grupper har antagit MIA modell för att förstå etiologin av psykiska störningar 7, och på grund av de olika intressen bland forskargrupper har olika punkter av immunaktivering tid använts för att uppnå olika störningar på hjärnans utveckling och beteenden 7.
Paul H. Patterson laboratorium vid California Institute of Technology antar strategin att injicera poly (I: C) till dräktiga möss på embryonala 12,5 dagar (E12.5), som framgångsrikt har visat att MIA kan inducera beteende, neurologiska, och immunologiska förändringar i avkomman som är förknippade med autism och schizofreni 8-11. Våra tidigare arbeten visar att MIA avkomma visa beteendestörningar (t.ex. sociala impairment, kommunikation underskott, repetitivt beteende, ångest-liknande beteende, och latent inhibition underskott 8,10,12), immun dysreglering och cytokiner obalans 8,13,14, förändring av fostrets hjärna genuttryck 15, förlust av Purkinje cell i lobule VII av lillhjärnan 11, förändring av synaptiska egenskaper i hippocampus 9, gen x miljöinteraktion 13, förändring av tarm permeabilitet, och tarmfloran sammansättning 16. Dessutom är terapeutiska och profylaktiska strategier också utvecklats från detta modellsystem 13,16,17. Genom att framkalla MIA vid E12.5, har andra visat att MIA producerar foster microglial aktivering och kolinerga utvecklings förändring i basal framhjärna 18, stamspecifik interaktion 19, hjärnan cerebral synaptosomala ultra avvikelser, cerebrala mitokondriella andningskedjan hyper abnormalties, nedreglering av cerebrala synaptosomala molekyler 17 ,depressiva liknande beteenden, försämring av kognition och hippocampus långsiktig potentiering (LTP), och underskott av vuxna hippocampus neurogenesis 20.
Här ger vi en detaljerad metod för hur man framkalla MIA vid E12.5 av poly (I: C), liksom paradigm för hur man tillämpar denna modell för att studera etiologin av autism och schizofreni. Det är viktigt att notera att MIA är en riskfaktor för en mängd olika sjukdomar 4, och dess resultat är extremt känsliga för tiden och metoden för induktion samt hållningen av de gravida dammar. Som sådan, även mindre inkonsekvenser mellan laboratorier ofta resulterar i låg reproducerbarhet och / eller olika fenotyper hos avkomman. Vår metod är speciellt utformad för dem som är intresserade av att studera MIA som en miljö riskfaktor för autism och schizofreni, och den detaljerade beskrivningen kommer att hjälpa forskare att förbättra reproducerbarheten av deras uppgifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll utfördes under godkännande av California Institute of Technology Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Förberedelse för Begränsad-parning par
- Använd åtminstone 6 dammar för beteendeförsök och tre för genuttryck analys.
OBS: Använd dubbla antalet beräknade honmöss, eftersom endast ca 50% av mössen kommer att pluggas från tidsinställd-parning. - Använd honmöss utan tidigare graviditet och vid 8-16 veckors ålder.
OBS: Kvinna möss som har före sexuell exponering för hanmöss, men har inte varit gravid är acceptabla. - Hus honmöss tillsammans och placera burarna bredvid varandra för att synkronisera sin brunstcykel. Använda en vanlig möss bur med en höjd på över 5,5 inches och en 75 kvadratinch inre golv att tillåta huset hos 5 vuxna möss. Märk varje hona mus med hjälp av ett öra punch.
2. Installera Begränsad-mattaIng Pair
- Ställ in tidsinställd-parning 0-2 timmar innan den mörka cykeln börjar. Placera två honmöss i varje bur. Ta ut mössen och väga dem individuellt. Spela in kroppsvikten hos varje hona mus.
- Placera en manlig mus i varje bur med två honmöss. Använd trio parning för att minimera fader förbryllande effekt.
3. vaginal Plug Check (E0.5)
- Kontrollera honmöss 0-4 timmar efter den mörka cykeln avslutas. Lyft försiktigt honmus från basen av svansen och låta musen för att ta tag i trådgallret, bur topp, eller en bur kant.
- Sök efter tecken på vaginal plugg: vaginal plugg är en synlig vitaktig massa i slidöppningen. Om kontakten är inte självklart, försiktigt in en 200 mikroliter pipettspets i slidöppningen. Motstånd från koagulering bekräftar vaginal plugg bildning. Kontrollera vaginal plugg gång per dag.
OBS: Vaginal kontakten är bara ett tecken på att parning har skett, och därför inte guarantee graviditet. Vaginal plugg kan vara svårt att identifiera i vissa stammar av möss. Söka hjälp från en erfaren möss vårdgivare att öka noggrannheten av plug identifiering. - Flytta pluggade möss en ny bur och grupp hysa dem. Definiera dagen av vaginal plugg utseende som embryonala 0,5 dag (E0.5).
4. Den E10.5-11.5, Check för graviditet
- Lyft försiktigt basen av svansen och låta musen för att ta tag i trådgallret, bur topp, eller en bur kant. Observera buken för att kontrollera om tecken på graviditet, till exempel, en bula i buken (Figur 1).
OBS: tecken på graviditet är alltid mer uppenbar vid E11.5 än E10.5. - Väg mössen för att kontrollera graviditet. Den gravida mus väger i allmänhet ca 20% tyngre vid E10.5 och 30% tyngre vid E12.5 jämfört med en icke-gravid mus (Figur 2). Enda hus dräktiga möss i rena burar.
5. 20 mg /kg Poly (I: C) Beredning
- Använd åtminstone 6 dammar per grupp för beteendeförsök och tre per grupp för genuttryck analys. Framställning av motsvarande mängd av poly (I: C) lösning.
- Väg poly (I: C) pulver i en 50 ml koniskt rör för att göra en slutlig koncentration av 40 mg / ml. I syfte att minimera och standardisera den stress som orsakas av injektionsvolym, injicera 5 pl av poly (I: C) lösning för varje gram muskroppsvikt (5 | il / g, eller 5 ml / kg). För att inducera MIA, vi injicerar 20 mg poly (I: C) per kg.
OBS: Koncentrationen av poly (I: C) lösning behövs är (20 mg / kg) / (5 ml / kg) = 4 mg / ml. Eftersom poly (I: C) pulver innehåller 10% poly (I: C), måste vi göra en slutlig koncentration av (4 mg / ml) /0.1= 40 mg / ml poly (I: C) lösning.
VARNING: Poly (I: C) pulver är mycket lätt. Var noga med att inte förlora någon pulver vid överföring från spateln till den koniska röret. - Lägga till motsvarande volym av 0,9% natriumklorid (saltlösning) i den koniska tube och stäng locket. Lös pulvret genom att försiktigt rulla saltlösning droppen över poly (I: C) pulver tills lösningen är klar. Centrifugera den koniska röret vid 800 xg i 1 min (fig 3C). Filtrera poly (I: C) lösning av 0,22 | j, m filter. Överföra poly (I: C) lösning till en 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugrör. Valfritt: Använd en spektrofotometer för att mäta 260/280 förhållandet mellan poly (I: C) lösning. Säkerställa förhållandet är mellan 1,54 till 1,82 (Figur 3) såsom beskrivits av tillverkaren. OBS: saltlösning som används för att lösa upp poly (I: C) pulver och tjäna som kontrollinjektion bör vara steril och farmaceutisk kvalitet.
6. Saltlösning eller Poly (I: C) Injektion på E12.5
- Väg musen på vågen och lägger tillbaka in i buren. Använd följande formel för att beräkna volymen av injektion för både saltlösning och poly (I: C) möss: kroppsvikt (g) multiplicerat med 5 = injektion önskad volym (l). Använd en 0,3 ml Insuli sprutan för att dra upp den beräknade volymen av koksaltlösning eller 20 mg / kg poly (I: C) lösning, till exempel, 150 pl för en 30 g mus.
- plocka försiktigt upp musen genom svansroten och placera den på toppen av buren. Hantera musen försiktigt för att undvika störande effekter inducerade av stress. In nålen, avfasa upp, vid ungefär 20 ° i förhållande till musen in i centrum av dess två övre nipplarna (Figur 4), och injicera saltlösning eller poly (I: C) lösning. OBS! Nålen ska bytas för varje mus efter injektion.
- Placera musen tillbaka till sin hembur. Placera burar i en lugn, låg trafik rum för att undvika andra confounding effekter.
7. Dagen efter Poly (I: C) Injection (E13.5)
- Kontrollera de injicerade möss på följande morgon. Använd en skala för att mäta kroppsvikt.
OBS: Poly (I: C) injicerades dräktiga möss vanligtvis få mindre vikt än saltlösning injicerade möss på dagen efter injektion. - Stör inte mössen tills avkomman föds.
8. Gauge av MIA Avkommor
- För att minimera störande effekterna av MIA induktion följa riktlinjerna nedan för att mäta användningen av MIA avkomma.
- Uteslut kullar från prematura eller fördröjd födsel, eller om kullstorleken är mindre än fem.
- Avliva de överdrivna valpar från CO2 om kullstorleken är större än 10.
9. Valfritt: Undersök akut inflammatorisk respons efter MIA
- Offra dräktiga möss tre timmar efter saltlösning eller poly (I: C) injektion med den metod som beskrivs i institutionens djurvård kommitté-godkänt protokoll.
OBS: Halsdislokation ofta att föredra eftersom det minimerar effekten av CO 2 / dödshjälp droger på dammen och embryot. - Samla mjälte från vuxna dräktiga möss och isolera moderkakan och foster behåin under stereomikroskop.
- För mjälte samling, lägg musen på dissekering plattan och spraya 70% etanol på buken av gravida möss. Använda ett par steril sax för att göra ett vertikalt snitt i mitten av buken nedanför bröstkorgen genom huden.
- Mjälten sitter i vänster överlägsen buken kvadranten. Använd pincett för att isolera mjälten. Rulla mjälten på grannlaga uppgift vindrutetorkare för att ta bort fettvävnad runt orgeln. Samla cirka 50 mg mjälten vävnad och placera dem i en Eppendorf-rör med 500 l RNA stabilisera buffert eller TRIzol att förhindra nukleinsyra nedbrytning. Lagra proverna vid -80 ° C frys tills användning.
- För placenta samling, försiktigt dra ut livmodern hornen från kroppen. Placera livmoderhornen i en petriskål fylld med autoklaverat fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lämna skålen på is. Använd två pincett för att riva upp livmoderväggen och exponera fostersäcken.
- Använd försiktigt pincett för att öppna fostersäcken utan att skada moderkakan och fostret. Separera moderkakan från fostret och klippa navelsträngen så nära moderkakan som möjligt. Avlägsna fostersäcken skräp från moderkakan. Placera moderkakan individuellt i Eppendorf-rör med 500 l RNA stabiliserar buffert eller TRIzol. Lagra provet vid -80 ° C frys tills användning.
- För fostrets hjärna insamling, lagra fostret i RNA stabilisera buffert från steg 9.2.2 tills dissekering. Retas av pial membran från ventrikeln av hjärnan med hjälp av känsliga # 5 pincett under stereomikroskop. Försiktigt bort allt membranet från fostrets hjärna. Placera fetala hjärnor individuellt i Eppendorf-rör med 500 l RNA stabiliserar buffert eller TRIzol. Lagra provet vid -80 ° C frys tills användning.
- Extrahera RNA från vävnaden och omvandla RNA till cDNA. Analysera IL6-genexpression i cDNA genom real time PCR.
- Utdrag RNA från vävnaderna genom att följa tillverkningen protokollet av TRIzol. Om vävnaderna lagras i RNA-stabilisering buffert. Tina provet och centrifugera ner bufferten. Överför vävnaden genom spetsen till en annan Eppendorf med 500 pl TRIzol och fortsätta RNA-extraktion.
- Använda en spektrofotometer för att mäta koncentrationen, 260/280 och 260/230 förhållandet av RNA. Se till att förhållandena är över 2,0.
- Eliminera DNA-kontaminering av behandlat RNA med DNase I. Mix 1 | j, g RNA, 1 il 10 X reaktionsbuffert, 1 | al RNase-Free DNase, och nukleasfritt vatten till en slutlig volym av 10 | il. Inkubera Master Mix vid 37 ° C under 30 minuter. Tillsätt 1 pl DNas stopplösning för att avsluta reaktionen. Inkubera blandningen vid 65 ° C under 10 min.
- Omvänt transkribera RNA till cDNA. Använda 20 | il reaktioner, och upp till 1 | j, g av totalt RNA per reaktion. Blanda 4 pl 5x omvänd transkription (RT) reaktionsblandningen buffert, 1 pl reverse transkriptas, 11 | il RNA-mall efter behandlingen med DNas I och 4 pl nukleasfritt H2O för att göra en slutlig 20 pl lösning. Programmera värmecykeln villkoren för RT. Ett generiskt tillstånd omfattar: Steg 1: 25 ° C under 5 min; Steg 2: 42 ° C under 30 min; Steg 3: 85 ° C under 5 min; Steg 4: Håll vid 4 ° C. Späd cDNA 5 gånger. För kortvarig förvaring, lagra cDNA vid 4 ° C. För långtidsförvaring, frysa cDNA vid -20 ° C.
- Analysera IL6-genexpression i cDNA genom realtids-PCR och normalisera IL6 genuttryck till p-aktin genexpression.
- Gör en Master Mix för IL6 och β-aktin upptäckt. Använd 25 pl reaktion, Master Mix för varje gen innehåller 12,5 l SYBR Green Mix, 0,5 pl 10 nM framåt primer, 0,5 pl 10 nM omvänd primer och 6,5 l nukleasfritt H2O
- Placera 5 pl 5x utspädd cDNA ent är botten av brunnen av optisk 96-brunnars reaktionsplatta. Pipettera 20 | il av huvudblandning till varje brunn för att göra en slutlig 25 | il PCR-blandning. Tredubbla varje gen för varje prov. Förslut plattan med hjälp av optisk limfilm. Centrifugera ner plattan vid 800 xg i 3 minuter vid 4 ° C Använd standardprogrammet för realtids-PCR: Steg 1: 50 ° C under 2 min; Steg 2: 95 ° C under 10 min; Steg 3: 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och temperaturen 60 ° C under 1 min. Lägg till ytterligare steg för dissociation kurva.
10. Undersök beteendestörningar i MIA Vuxet barn (tillval):
- Utför beteendetester i åldrarna 8-12 veckor. Ändra buren strö minst 3 dagar före testet. Acklimatisera mössen till beteendetestning rummet minst 30 min före testet.
- För prepulse inhibition (PPI), hålla tillbaka mössen i plexiglascylinder med en piezoelektrisk sensor under den. Acklimatisera mössen till PPIkammare under 5 min. Exponera mössen med 6 försök med 120 dB vitt brus (spritta).
- Sedan utsätta möss med randomiserade blandningar av 14 studier av bakgrundsljud, 14 försök med skrämma, 14 prövningar av prepulse 5 dB (5 dB högre än bakgrundsljud) + spritta (PPI5), och 14 försök med prepulse 15 dB (15 dB högre än bakgrundsbrus + startle (PPI15).
- Genomsnitt spritta svar under de första 6 försök på 120 dB prövningar. Genomsnitt spritta svar för de övriga enskilda stimuli. Dold värdet till prepulse inhibition av (skrämma - PPI5 eller PPI15) / skrämma.
- För öppen fälttest, placera musen i hörnet av ett öppet torg arena (50 x 50 x 50 cm 3). Spela in banan för mus under 10 min genom en takmonterad kamera. Definiera mitten av arenan som centrum zonen (17 x 17 cm 2). Kvantifiera den tillryggalagda sträckan, mittzon poster och tid i mittzon manuellt eller genom bildbaserad automatisk analysprogram. För marmor nedgrävning test acklimatisera musen till en test bur med komprimerad 5 cm djup, ren, Aspen tall sängkläder för 10 minuter. Återgå musen till sin homecage. Placera försiktigt 20 marinblå 1,5 cm diameter glas kulor i stil med 4 x 5 arrangemang. Placera musen tillbaka till test bur med kulor i 10 min. Räkna kulorna som har begravts i 10 min test varaktighet.
11. Undersök Cerebellar Neuropathology i MIA Vuxet barn (tillval):
- Euthanize saltlösning och MIA vuxen avkomma av bedövningsmedel. BEGJUTA musen med 50 ml PBS och därefter 50 ml 4% paraformaldehyd through det kardiovaskulära systemet.
- Ta bort hjärnan noggrant och postfix hjärnan i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C. Skölj hjärnan med PBS tre gånger och lagra hjärnan i PBS med 0,02% natriumazid i ett 4 ° C kylskåp fram till användning.
OBS: Den postfixerades hjärnan kan lagras i PBS med 0,02% sodium azid i kylen i upp till en månad. - § hjärnan i 50 um tunna skivor sagittally använder vibratome. Samla hjärnan sektioner med hjälp av en mjuk borste penna. Avsluta den endogena peroxidasaktiviteten genom inkubering av sektionerna i 0,6% väteperoxid under 30 min vid rumstemperatur.
- Inkubera avsnitt i anti-calbindin antikropp utspädd i blockeringsbuffert (10% getserum med 0,1% Triton X-100 och 0,02% natriumazid i PBS) över natten vid rumstemperatur. inkubera sedan sektionerna i motsvarande biotinylerad sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert under 2 h vid rumstemperatur.
- Inkubera sektionerna i avidin DH - Biotinylerad peroxidas H komplex buffert för att detektera biotin i 1 h vid rumstemperatur. Utveckla sektionerna med peroxidassubstrat att visualisera antigenet. Tvätta delarna med PBS tre gånger i mellan stegen. Montera sektionerna på objektglas. Bild sektionerna under mikroskop.
- Brown, A. S. Epidemiologic studies of exposure to prenatal infection and risk of schizophrenia and autism. Dev Neurobiol. 72 (10), 1272-1276 (2012).
- Fatemi, S. H., et al. The viral theory of schizophrenia revisited: abnormal placental gene expression and structural changes with lack of evidence for H1N1 viral presence in placentae of infected mice or brains of exposed offspring. Neuropharmacology. 62 (3), 1290-1298 (2012).
- Shi, L., Tu, N., Patterson, P. H. Maternal influenza infection is likely to alter fetal brain development indirectly: the virus is not detected in the fetus. Int J Dev Neurosci. 23 (2-3), 299-305 (2005).
- Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nat Rev Neurol. 10 (11), 643-660 (2014).
- Meyer, U. Prenatal poly(i:C) exposure and other developmental immune activation models in rodent systems. Biol Psychiatry. 75 (4), 307-315 (2014).
- Meyer, U., Feldon, J., Yee, B. K. A review of the fetal brain cytokine imbalance hypothesis of schizophrenia. Schizophr Bull. 35 (5), 959-972 (2009).
- Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain Behav Immun. 24 (6), 881-897 (2010).
- Hsiao, E. Y., McBride, S. W., Chow, J., Mazmanian, S. K., Patterson, P. H. Modeling an autism risk factor in mice leads to permanent immune dysregulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12776-12781 (2012).
- Ito, H. T., Smith, S. E., Hsiao, E., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters nonspatial information processing in the hippocampus of the adult offspring. Brain Behav Immun. 24 (6), 930-941 (2010).
- Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
- Shi, L., et al. Activation of the maternal immune system alters cerebellar development in the offspring. Brain Behav Immun. 23 (1), 116-123 (2009).
- Hsiao, E. Y., Patterson, P. H. Activation of the maternal immune system induces endocrine changes in the placenta via IL-6. Brain Behav Immun. 25 (4), 604-615 (2011).
- Wu, W. L., et al. The interaction between maternal immune activation and alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor in regulating behaviors in the offspring. Brain Behav Immun. , (2015).
- Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain Behav Immun. 31, 54-68 (2013).
- Garbett, K. A., Hsiao, E. Y., Kalman, S., Patterson, P. H., Mirnics, K. Effects of maternal immune activation on gene expression patterns in the fetal brain. Transl Psychiatry. 2, e98 (2012).
- Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
- Naviaux, R. K., et al. Antipurinergic therapy corrects the autism-like features in the poly(IC) mouse model. PLoS One. 8 (3), e57380 (2013).
- Pratt, L., Ni, L., Ponzio, N. M., Jonakait, G. M. Maternal inflammation promotes fetal microglial activation and increased cholinergic expression in the fetal basal forebrain: role of interleukin-6. Pediatr Res. 74 (4), 393-401 (2013).
- Schwartzer, J. J., et al. Maternal immune activation and strain specific interactions in the development of autism-like behaviors in mice. Transl Psychiatry. 3, e240 (2013).
- Khan, D., et al. Long-term effects of maternal immune activation on depression-like behavior in the mouse. Transl Psychiatry. 4, e363 (2014).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
- Abazyan, B., et al. Prenatal interaction of mutant DISC1 and immune activation produces adult psychopathology. Biol Psychiatry. 68 (12), 1172-1181 (2010).
- Meyer, U., et al. Adult behavioral and pharmacological dysfunctions following disruption of the fetal brain balance between pro-inflammatory and IL-10-mediated anti-inflammatory signaling. Mol Psychiatry. 13 (2), 208-221 (2008).
- Vuillermot, S., et al. Prenatal immune activation interacts with genetic Nurr1 deficiency in the development of attentional impairments. J Neurosci. 32 (2), 436-451 (2012).
- Bechard, A., Nicholson, A., Mason, G. Litter size predicts adult stereotypic behavior in female laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (4), 407-411 (2012).
- Harvey, L., Boksa, P. A stereological comparison of GAD67 and reelin expression in the hippocampal stratum oriens of offspring from two mouse models of maternal inflammation during pregnancy. Neuropharmacology. 62 (4), 1767-1776 (2012).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektion av 20 mg / kg poly (I: C) vid E12.5 kunde framkalla en akut inflammatorisk reaktion i moderns-placenta och foster axeln och fälla en kronisk effekt för hjärnans utveckling och beteende fenotyper 12,13. Förhöjda nivåer av en proinflammatoriska cytokiner, interleukin (IL) -6, är en tillförlitlig indikator på akut inflammatorisk respons efter MIA. Topptiden för IL6 genuttryck i moderkakan och fostrets hjärna är på tre timmar efter poly (I: C) injektion 12,13. Vi har visat att poly (I: C) inducerar högre IL6 genuttryck över moderns mjälte-placenta-fostrets hjärna (figur 5) (Data anpassade från Wu et al, 2015). 13. Forskare kan kombinera detta paradigm med annan behandling för att studera de faktorer som kan förändra akut inflammatorisk respons efter MIA, t.ex. moderns kost, genetiska muterade möss, antiinflammatoriska läkemedel, etc.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Å andra sidan, beteendeförändringar är också utmärkande för MIA modell Flera beteendetester kan utföras på MIA vuxna barn att visa olika autistic och schizofren-liknande. beteenden. Generellt jämfört med koksalt avkomma, MIA avkomma visa färre mittzon poster och kortare mittzon varaktighet tillbringade i öppna fälttest. De visar också oftare nedgrävning beteenden i marmor begraver testet och lägre PPI (Figur 6) (Data anpassade från Wu et al., är 2015) 13. Förlust av Purkinje-celler i cerebellum lobule VII ett annat kännetecken för MIA avkommor (Shi et al., 2009). När färgades med calbindin antikropp, finns det färre calbindin-positiva Purkinje-celler i cerebellum lobule VII i MIA avkommor jämfört med saltlösningskontrollen avkommor (Figur 7).3643 / 53643fig1.jpg "/>
Figur 1. tecken på dräktiga möss. Mid-dräktighet mus kan identifieras genom bula i buken (pil). Inavlade C57BL / 6 musstam används här som ett exempel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. kroppsvikt förändringar hos gravida C57BL / 6N möss från embryonala (E) 0.5-12.5 dagar. Vid en jämförelse av gravida och icke-gravida möss med vaginala pluggar närvarande vid E0.5, den (A) kroppsvikt och (B) procent av kroppsvikten genomgår en dramatisk ökning på E10.5 hos gravida möss. Gravida n = 10, icke-gravid n = 5. Data presenteras som medelvärden ± SE. *** P <0,001, ****p <0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. absorbansmätning av poly (I: C).. Lösning Kontrollera att 260/280 förhållandet mellan 1,54-1,82 klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Poly (I: C) injektion vid embryonala (E) 12,5 dagar Scruff den gravida musen försiktigt.. Injektionsstället ligger i mitten av de övre bröstvårtor. Injicera nålen, avfasa upp, vid ungefär 20 ° vinkel i förhållande till musen. inavlade C57BL / 6 musstam används här som ett exempel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Poly (I: C) injektion ökar IL6 genuttryck i mjälten-placenta-fetal hjärnaxel dammen Data presenteras som medelvärden ± SEM.. * P <0,05, ** p <0,01 (Uppgifterna är ursprungligen från Wu et al., 2015 och modifierad för artikeln 13). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. & #160;. MIA vuxen avkomma uppvisar beteendeavvikelser i samband med yrkeskarriär och av autism och schizofreni I den öppna fälttestet, MIA avkommor (A) in i mittzonen mindre ofta och (B) tillbringar mindre tid i mittzon. (C) I marmor nedgrävning testet, MIA avkommor begrava fler kulor än saltlösningskontroll avkomma. MIA avkommor uppvisar prepulse inhibition (PPI) underskott i (D) prepulse 5 dB och (E) prepulse 15 dB. Medelvärde ± SEM. * P <0,05, p <0,01 (Uppgifterna är ursprungligen från Wu et al., 2015 och ändras för artikeln 13) **. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. MIA vuxen avkomma uppvisar neuropatologiska abnormiteter förknippade med yrkeskarriär och autism. Förlust av Purkinje celler i lobule VII har visats i MIA vuxen avkomma. Arrow: Calbindin + Purkinje celler. ML: molekylär lager, GCL: granulat cellager, PCL. Purkinje cellager klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MIA induktion vid olika tidsfönster stör olika hjärnans utveckling händelser i gnagare, och därmed leder till olika beteendeavvikelser och neuropatologier hos avkomman. Här beskrev vi ett protokoll för att framkalla MIA i möss med poly (I: C) injektion vid E12.5. Denna metod för MIA induktion leder till beteendemässiga, neurologiska, immunologiska och gastrointestinala avvikelser i samband med autism och schizofreni hos avkomman 8,10,11,16. Det är viktigt att notera att, eftersom MIA är en miljö riskfaktor är fenotypen hos avkomman förväntas ha högre variation än hos möss från genetiska modeller av nervsystemets sjukdomar. Således, för att noggrant och exakt generera autism och schizofrenirelaterade fenotyper genom MIA, är det särskilt viktigt att minimera ytterligare variabler som kan omintetgöra resultaten.
Tidslinjen som beskrivs i protokollet bör följas näraly. Korrekt injektion tidsfönster skulle säkerställa att MIA stör avkomman hjärnans utveckling vid den önskade scenen. Induktion av MIA vid E12.5 i mus motsvarar störningar nära slutet av den första trimestern i mänsklig dräktighet 21 - en period under vilken signifikant hjärnans utveckling sker, inklusive utveckling av Purkinje celler och caudatus putamen, och neurogenes i kortikala skikt. Ytterligare undersökningar kommer att behövas för att bevisa sambandet mellan förlusten av Purkinje celler i MIA lillhjärnan och den tidiga störning av hjärnans utveckling.
Medan enhetlig behandling, undersökning, och även djurhållning av dammarna skulle minimera effekten av moderns stress på avkomman fenotypen, innehåller våra protokoll fortfarande förbehåll att forskare bör vara medveten om. Till exempel har vi enda hus dammarna dagen före injektion av poly (I: C) och under resten av graviditeten. Vår strategi är att lämna dräktiga möss i en undisturbed miljö. Däremot kan denna åtgärd framkalla stress i moderns miljö. Även om vi inte vet om denna isolering-inducerad stress stör utvecklingen hos avkomman, kan observeras MIA effekt genom att följa vårt förfarande.
Dessutom behöver den stam och genetisk bakgrund av mössen som skall väljas och testas noggrant för MIA induktion. Hittills har effekten av MIA mestadels replikeras i vildtyp C57BL / 6N möss 8,10,13,16. Andra har också observerat MIA effekt i BTBR mus stam 19. Det har visat sig att poly (I: C) skulle kunna framkalla olika immunsvar hos genetiskt manipulerade möss 13,22-24, som kan införa ytterligare störande effekter till avkomman.
När det gäller antalet biologiska replikat använder vi minst 6 kullar per grupp för beteendemässiga eller fysiologiska analyser och 3 kullar per grupp för genuttryck, protein eller immunhistokemi tillvägagångssätt. Vi testar alla avkommor i en kull istället för att använda en eller två avkommor i en kull för att undvika experimentell partiskhet. Vi genomsnitt även data för all avkomma inom en kull, och använda det i genomsnitt som en datapunkt (så att n = antalet kullar) för att undvika olämpliga statistik 13. Data från varje kön också slås samman eftersom ingen uppenbar skillnad mellan könen har observerats i MIA-modellen 13.
Tanken bakom mätning MIA avkomma genom kullstorlek är att minimera variationen som orsakas av moderns omvårdnad och omsorg. Kullstorlek har visat sig korrelera med stereotypa beteenden hos C57BL / 6-möss 25. Vi spekulerar att detta kan bero på att tilldelningen av resurser under moderns omvårdnad och omsorg. För att undvika denna förvirrande effekt, är vår standard önskad kullstorlek 6-10 för C57BL / 6-möss.
Även när man följer protokollet noga, försöks får enmotverka en alltför svag eller alltför potent immunsvar hos gravida möss efter poly (I: C) injektion. För att undvika detta är det viktigt att validera pyrogena och cytokinogenic aktiviteten hos olika partier av poly (I: C). Olika partier och massor av poly (I: C) från samma företag skulle kunna leda till olika nivåer av inflammatoriskt svar hos möss; slående injicera identiska doser av poly: kan (I C) från olika satser resultera i upp till 10 gånger skillnader i plasma IL-6 nivåer 26. Fastställande av dos och sats av poly (I: C) för ytterligare MIA experiment genom avläsning av icke-gravid kvinna IL-6 mätning skulle kunna bidra till att minska variationen av effekten från MIA induktion.
Om det är nödvändigt att modifiera doseringen för speciella partier av poly (I: C), är det också viktigt att modifiera koncentrationen av poly (I: C) lösning för injektion, så att den injicerade volymen förblir ungefär 5 | j, l per gram mus vikt. Till exempel, i enlighet med den manufacturer förfarande, poly (I: C) är förment rekonstituerades vid ~ 10 mg / ml vatten för erhållande av en polynukleotid i fysiologisk fosfatbuffrad lösning. Jämfört med våra 40 mg / ml lösning, skulle den lägre koncentrationen öka volymen av injektion med 4 veck. För gravida möss, skulle en stor volym buffert injektion potentiellt öka trycket på embryon och införa oönskade, confounding effekter på avkomman. Därför väljer vi att lösa upp poly (I: C) -pulver i 0,09% natriumklorid med en högre slutlig koncentration i syfte att minska volymen av injektion.
IL-6 är vald att vara markören för akut inflammatorisk respons på grund tidigare forskning har identifierat IL-6-signalering som en kritisk faktor vid mediering av effekterna av MIA på hjärnans utveckling och beteende. Följande poly (I: C) behandling, är IL-6 den mest uppreglerad cytokin i moderns blod och placenta 10,12. Viktigast av allt, Smith et al. demonstrerat att av fleramycket uppregleras cytokiner, endast IL-6 uppvisade både nödvändiga och tillräckliga villkor för induktion av MIA-associerad hjärnan och beteendeavvikelser. Det vill säga moderns injektion av anti-IL-6 kan effektivt förhindra onormala beteende och transcriptomic avvikelser i MIA avkomma, medan neutraliserande andra cytokiner inte 10. Dessutom moderns injektion av rekombinant IL-6 ensam (utan poly (I: C)) återger MIA-associerad transkriptions och beteendeavvikelser ses i MIA fostrets hjärna och avkomma 12,15.
Jämfört med andra metoder för att inducera MIA (t.ex., lipopolysackarid (LPS) eller influensa), poly: är (I C) relativt säker och ger ett enkelt sätt att styra intensiteten av immunsvaret. Även det inflammatoriska svaret som framkallas av moderns poly (I: C) administrering är akut och övergående, är dess effekt på avkomman beteenden och hjärnans utveckling djupgående. Övergripande, när tekniken för att inducera MIA through poly (I: C) injektion vid E12.5 behärskas, kan man sedan gå vidare för att utföra olika beteendemässiga och biologiska analyser för att undersöka effekten av denna miljö riskfaktor på avkomman. Samtidigt kan man också kombinera metoden med genetisk modifiering eller andra behandlingar före, under eller efter graviditeten att undersöka orsakerna och möjliga terapeutiska metoder för autism och schizofreni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill hedra den sena Dr Paul H. Patterson för hans bidrag till utvecklingen av MIA modell, autism och schizofreni forskning. Vi erkänner Sarkis K. Mazmanian för hans stora stöd på detta protokoll; Ruben M. Bayon, Yvette Garcia-Flores, Karen C. Lencioni och Leslie A. Neumann för administrativt stöd; Ali Khoshnan och Jan C. Ko för stödet på inspelningen; Elaine Y. Hsiao och Natalia Malkova för deras råd om MIA induktion; Jeffrey S. Cochrane, Joaquin Gutierrez, Kwan F. Lee, Jaime Rodriguez, Lorena C. Sandoval, och Natalie A. Verduzco för deras expert djurhållning. Detta arbete stöddes av NIH Conte Center Award (NIH 5P50MH086383-04, Paul H. Patterson); Autism Speaks (# 7670, Paul H. Patterson); Simons Foundation (# 322.839, till Sarkis K. Mazmanian); NIH Training Grant (NIH / NRSA T32GM07616 till K.-HC); Caltech Summer Grundutbildning Research Fellowship (SURF) (till ZY); Amgen Scholars Program vid Caltech (till ZY); och postdoktorsstipendium frOm National Science Council, Taiwan (NSC 101-2917-I-564-039, till W.-LW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
