Protocol
1.高度な準備
- デキストランG10粒子を調製します。
- 10グラムのG10粒子にPBS 1×50ミリリットルを追加することで、G10のスラリーを準備します。反転によって混合し、G10が4°CO / Nでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）から沈降することを可能にします。
- 定住G10粒子からG10カラム分離、吸引PBSの日と50ミリリットルの新鮮なPBSを追加します。転倒混和します。使用する準備ができるまで4℃で落ち着いG10粒子とストアに50ミリリットルの新鮮なPBSを追加して、二回繰り返します。
- BMSCとOBを培養します。
- 90％の密集度に到達するまで、6％CO 2中37℃でBMSCまたはOBの両方を維持し、10cmの組織培養プレート上で増殖させました。
- 新しい10cmプレート上に2：トリプシン処理BMSCまたはOB細胞とは、1を分割します。共培養白血病のために必要とされるまで細胞をこれらの標準に成長させます。
2.共培養の確立と維持
- 5-20×10 6白血病細胞iを追加nは、80％-90％コンフルエントBMSCまたはOB板上に腫瘍特異培地10mlの。
注：私たちの研究室は、より良い1％から7％16-18の範囲であると示されている骨髄微小環境を再現するために、5％のO 2中で37℃で共培養を維持します。しかし、この酸素張力で共培養を維持することが3白血病の亜集団の確立のために重要ではなく、ラボの裁量です。 - すべての4 日目は、（懸濁液中の白血病細胞を含む）は、メディアの1ミリリットルが、すべてを削除し、9ミリリットルの新鮮な白血病培養培地と交換してください。プレートからのメディアの9ミリリットルを取り外すときは、BMSC又はOB付着層を乱さないように注意してください。
- プレートの隅に側と吸引メディアにプレートを傾けることによってメディアを取り出します。新鮮な培地を追加するときにまた、BMSC又はOB付着層の最小限の中断を確実にするために、側壁に対するプレートの隅に一滴ずつ追加してください。
- 共培養の12 日目の後、ディッシュアップから培養培地をピペットでBMSCまたはOB層から白血病細胞を洗浄し、ダウン静かに皿の上に約5〜10倍にした後、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ステップ2.1で説明したように新たな80％-90％コンフルエントのBMSC又はOBプレート上に再播種。
注：ステップ2.3で説明したように、共培養の穏やかなすすぎは、BMSCまたはOB単層を破壊することなく、S、PBの白血病細胞を除去します。これは、腫瘍細胞は、次の同時培養プレートに移すことを可能にします。この12日のサイクルでは、ユーザーのニーズに基づいて、必要な数回繰り返すことができます。
3.準備G10ビーズカラム
注：次の手順は、無菌テクニックとG10カラムを用いて行われるべきである無菌下流の分析や培養が必要な場合は、次のG10カラム分離は、無菌の生物学的フードでセットアップする必要があります。
- 事前WA水浴中で37°CまでRM細胞培養培地（カラムあたり約30 ml）を。 10ミリリットル使い捨て注射器を使用して、削除し、プランジャーを捨てます。シリンジにグラスウールを追加します。
- ピンセットを使用して、薄い緩いストランドにグラスウールを引き離します。注射器の2/3をガラスウールで充填されるまで注射器に軽く充填したグラスウールの複数の層を加えます。
注：グラスウールは、白血病細胞のコレクションを汚染から緩いG10粒子を防ぐことが重要です。グラスウールはG10粒子をサポートするのに十分な詰めが、あまりにも密に列を介してメディアの流れを遮断するためにパックされていないことを確認してください。 - 閉鎖位置に注射器の先端に1方活栓を取り付けます。
- リングへのクランプシリンジの列が50ミリリットルコニカルチューブ（コレクションチューブ）がコックの下に配置することができる十分な高さに立ちます。シリンジ列の下にコレクションチューブを置きます。
- 10ミリリットルのピペットを使用すると、G10粒子がの上欄にPBSに再懸濁し、滴下、追加しますグラスウール。グラスウールの上にG10粒子の形の（注射器の目盛りによって測定される）〜2ミリリットルペレットまでG10粒子を追加し続けます。
- 予熱したメディアとG10カラムを平衡化します。
- 列に予熱したメディアの2ミリリットルを追加します。ようにオープンコックバルブはゆっくりとメディアを滴下カラムから流出します。
- 予熱したメディアの10ミリリットルの合計までの手順を繰り返し3.6.1は、列を横切って走ってきました。
注：G10粒子をコレクションチューブを通る流れで見られ、いずれか1）より多くのG10粒子を追加している場合は、追加G10粒子がカラムから逃げないことを確認すること〜2ミリリットルペレットを維持するか、2）未使用の1繰り返しでカラムを交換します3.4-3.6.1を繰り返します。 - カラムからの予熱したメディア・ドレイン後、コックを閉じて、フロースルーとコレクションチューブを捨てます。列の下に新しいコレクションチューブを追加します。列は、メディア+細胞混合物をロードする準備ができています。
注：列すぐに使用し、乾燥させないようにする必要があります。
4.共培養内の3亜集団を分離
- 懸濁液（S）は、腫瘍亜集団のコレクション。
- 吸引ピペットとの共培養プレートからメディアと静かに再適用されるのと同じメディアのプレートを洗浄し、15ミリリットルコニカルチューブに白血病細胞を含む培地を収集します。収集した白血病細胞は、S亜集団です。
- フェーズブライト（PB）腫瘍亜集団のコレクション。
- 共培養プレートに戻って10ミリリットルに新鮮な培地を追加します。接着性白血病細胞が、付着BMSC / OBの成分を除去するのは難しい十分ではありませんを削除するには、上下約5倍を追加したメディアをピペットで勢いよくすすいでください。
- ピペットで吸引し、15ミリリットルコニカルチューブにメディアを収集します。回収した細胞は、PBの亜集団です。
- フェーズ点心のコレクション（PD）は、腫瘍亜集団。
- レムに1ミリリットルPBSですすぎ、プレートオベ残りのメディア。 5分間37℃のインキュベーターに3ミリリットルのトリプシンと場所とのトリプシン処理共培養プレート。
- インキュベーターからプレートを外し、静かに付着BMSC / OBを取り除くために、プレートの側面をタップします。
- 離れて大きな細胞凝集体を壊すために1ミリリットルのウシ胎児血清（FBS）およびピペット上下に3-5回を追加します。
- 15ミリリットルコニカルチューブ内の細胞でメディアを収集します。これらの細胞は、同様にBMSC / OBを有する未精製のPD亜集団です。
- 遠心分離器3は、7分間400×gで亜集団を単離しました。吸引し、1ミリリットル予め温めメディアでペレットを再懸濁し、個別に、その後、上清を捨てます。細胞はG10カラムにロードする準備ができています。
G10カラムに5読み込んで共培養細胞
注：必ずコックはG10カラムに細胞を含む培地を添加する前に完全に閉じていることを確認します。また、それぞれの亜集団はintroducしないよう個別のG10カラム上で実行する必要があります下流の分析における集団間の偏りを電子。
- 千μlのピペットを用いて、滴下別々のG10カラムに予熱した培地中に各細胞亜集団の1ミリリットルを追加します。細胞を含む培地が上またはG10ペレット内に残ることを確認してください。細胞を室温で20分間、G10ペレットにインキュベートすることを可能にします。
注：活栓は、インキュベーションの期間のための閉じられたまま。
6. G10カラムから白血病細胞を収集
- 各G10カラムに1〜3ミリリットル予め温めたメディアを追加します。オープンストップコックバルブとメディアがゆっくりコラム滴下を終了することができます。
注：これは、列または列の外に洗い流し、分離された白血病細胞を汚染する可能性がBMSC / OBを含むG10ペレットからの遅い流れの速度を維持することが重要です。 - 15〜20ミリリットルの合計までG10カラムに少しずつ（1-2 ml）に予熱したメディアを追加していきカラムに通しており、収集されています。閉じるコックVALVEとキャップコレクションチューブ。
注：G10粒子ペレットを回収チューブの底に見られる場合は、ゆっくり乱されていないG10粒子ペレットを残してチューブからメディアを取り出し、新しいチューブに移します。 - 遠心分離は、室温で7分間、400×gでメディアを集めました。上清を除去し、下流側のアプリケーションのための適切な緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞は、今BMSC又はOB汚染のない白血病細胞の純粋な集団であり、ユーザーの裁量で、下流のアプリケーションに適用する準備ができています。
注：G10カラムを通して細胞を通過する際に白血病細胞の生存率は変わらないはずです。
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Representative Results
この共培養モデルの成功セットアップと文化が。付着BMSC又はOB単層に比べて白血病細胞の3亜集団の確立につながる1は、BMSCの単層に播種ALL細胞は、最初に中断のようにのみ単一集団をどのように表示されるかを示しています白血病細胞。 4日間のコースで白血病細胞は、3空間白血病細胞の亜集団（一時停止（S）、位相明るい（PB）、および位相薄暗い（PD））を形成するためにBMSCと対話します。腫瘍細胞の3亜集団は、一般的にBMSC又はOBとの共培養の24時間後に見ることができますが、私たちは、白血病細胞およびBMSC / OBセル間の完全なダイナミクスとの相互作用が起こることを可能にするために4日間細胞を培養に共同しました任意の操作や実験の前の場所（図1）をとります。また、我々は蜂を持っている、骨髄生理学を再現するために、5％の酸素圧での共培養を維持することに注意してくださいnは1％-7％16-18の範囲であると報告しました。
下流の分析の大半は、BMSC又はOBからの白血病細胞の分離を必要とします。これを達成するために、我々は、白血病細胞（図2A）の純粋な集団を収穫するG10カラムを使用しています。 BMSCとPD REH細胞のトリプシン処理次の混合集団は、フローサイトメトリーによる二つの異なる前方/側集団（図2B、上部パネル）によって見られています。 ALL細胞が回収されるG10分離のみREHの純粋な集団を、以下、前方/側方散乱のフローサイトメトリー（ 図2B、下のパネル）によって確認されました。
この共培養モデルの使用とBMSCまたはOBとの共培養に付着BMSC又はOBにその空間的位置への相対関係に白血病細胞の表現型の尋問を可能にしたときに3亜集団から白血病細胞を単離する能力単層。特に興味深いのは、BMSC又はOB共培養のPD集団から回収されたすべての細胞は細胞毒性化学療法（図3A、B）への曝露後の無細胞死へ少し持っているということです。
図1は、BMSCまたはOBフォーム3つの空間集団との共培養内のすべてのセル。私たちの研究室では、骨髄微小環境由来間質細胞（BMSCまたはOB）と白血病細胞の相互作用をモデル化するためのin vitro共培養系を使用しています。共培養を確立するには、白血病細胞（赤）は「時間0」と表記されたBMSC又はOB（ブルー）、80％-90％のコンフルエント単層上に播種されています。共培養は、骨髄微小環境の条件に近づけるために、5％の酸素で37℃に維持されています。白血病細胞は、早くも24時間として3亜集団を形成するために開始されますが、FOするための完全な相互作用を可能にするために、RM我々は、共培養4日間は実験のために白血病細胞を利用する前に確立することができます。 4日目（右パネル）により、白血病細胞の3亜集団は、接着単層に関連して形成することになります。概略図（右上）と位相差顕微鏡（右下）が一時停止（S）白血病細胞が自由に培地中に浮遊示します。位相明るいBMSCまたはOB単層の表面に付着されている（PB）白血病細胞。位相薄暗い（PD）BMSC又はOB単層の下に移動した白血病細胞。スケールバーは10ミクロンを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
G10の列の図2.使用はBMSC / OBからALL細胞を分離することが可能になります。 G10 COLを使用するプロセスの（A）のデモンストレーションUMNは、下流の分析のために腫瘍細胞の純粋な集団を達成するために、BMSC / OB共培養からの全ての細胞を分離します。左から右へ、ALL細胞およびBMSC / OB細胞の混合物がG10列の先頭に追加されます。 （センター）細胞混合物は、G10スラリーに沈降し、室温で20分間インキュベートされるべきである（注：活栓最初の2つのステップを通して閉じた位置にあります）。 （右）白血病細胞は、コックを開き、予め温めておいたメディアでカラムを洗浄することによって回収される。（B）トップパネルBMSC（ブルーゲート）とREHを含む細胞の混合集団は、ALL細胞（赤ゲートがあるとG10の分離前に示しています）前方に評価することによって（FSC）および側方散乱（SSC）の分析。底板は、G10分離REHの唯一の純粋な集団を以下のALL細胞（赤ゲート）が1％未満の間質細胞の混入（ブルーゲート）に残る。 THIの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 sのフィギュア。
図3. PD白血病細胞は、化学療法の暴露に対する耐性を増加している。アラ-Cに4日間暴露後減少の生存率を表示しませんBMSCの共培養（A）のPD集団から回収されたSD-1白血病細胞を[1μM] 、未処理の対照と同様MTX [50μM]、またはVCR [25μM]は、（アラ-Cの第二の用量は、安定性に起因する任意の薬物損失を考慮して48時間で加えていることに注意してください）。 OB細胞と共培養し、トリパンブルーexclusion.SD-1白血病細胞によって決定生存能力（B）に同様の傾向を表示するように培地単独からの白血病細胞は、S、およびPB集団は大幅に生存率を低下させています。結果は平均±SEMとして表されます。 （*）P <0.05、未処理の対照に対する独立t検定相対表します。5fig3large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
病気の再発に寄与する微小残存病変（MRD）は、積極的な難治性ALLの治療、ならびに、他の血液悪性腫瘍のホストに主要な臨床課題であり続けています。骨髄微小環境は、ALL 3,8における再発の最も一般的な部位です。このように、骨髄微小環境をモデル化したモデルは、化学療法の露光中にMRDの白血病腫瘍細胞の生存および維持に関連する仮説をテストするための重要なツールです。マウスモデルは、薬効に関連したテストの質問のためのゴールドスタンダードを定義しているが、2D共培養は、テストの仮説と白血病細胞の生存の骨明日の微小環境のサポートに関連する薬物戦略のための費用対効果の高い方法であり続けています。多くのグループがBMSCで白血病細胞の共培養を示しているかの化学療法剤9,10,12-14,19-21でチャレンジしたときにOBが生存優位性を提供します。通常の未成熟CD34 + HEMAのモデリング作業間葉系幹細胞（MSC）との共培養におけるtopoietic細胞は、造血細胞が造血細胞22,23の三つの異なる空間的な集団を形成するために、MSCの接着単層と相互作用することを明らかにしました。 CD34 +細胞の増殖および分化は、共培養22内のそれらの位置に対して行いました。私たちは、下流の分析のための2D共培養し、その分離内の腫瘍細胞の耐性集団の骨髄微小環境の間質細胞のサポートに関する質問をテストするには、この観察に拡大してきました。
一般的に中断し、腫瘍を除去することにより白血病細胞をサンプリングし、標準的な2D共培養モデルとは異なり、我々のモデルは、その共培養は、BMSCまたはOBフォームBMSCに比べ3亜集団との共培養中で白血病細胞よりダイナミックな相互作用を表して示していますまたはOB単層（ 図1）。形成が中断された腫瘍亜集団（S）腫瘍、WHIchが自由にメディアに浮遊しています。 BMSCまたはOBの表面に接着される位相明るい（PB）。 BMSCまたはOB単層（ 図1）の下に埋もれていると位相薄暗い（PD）。このモデルでは、我々は、厳格な供給および再播種スケジュールは共培養モデルにおける一貫性のある結果を得るため、我々は4日間隔で共培養を養う、すべての12日、新しいBMSC又はOB単層に腫瘍を転送することが重要であることがわかりました。必要に応じて、これは、代替腫瘍タイプのための修正が必要な場合があります。 PD集団を形成するために、BMSCまたはOBの下に移動する腫瘍細胞の数は、異なる白血病細胞の間で変化してもよいです。これは、PDの腫瘍細胞の数が少ないことは難しい下流の分析のために十分な細胞を収集するために行っている場合、モデルの限界であることができます。いくつかのケースでは、この問題は、3つの個々の亜集団のプーリングを可能にする複製共培養を確立することによって克服することができます。
このモデルの再として、BMSCと腫瘍細胞との相互作用であるか、白血病細胞の特異的な生物学に対処する間質細胞の汚染を除去する効果的な方法を有することが重要であるOB。間質から腫瘍細胞のこの分離を達成するために、我々はG10の列を使用しています。これらの列の適切な設定方法や使用は下流の分析のための純粋な腫瘍集団の単離のために重要です。 図2Bに強調したように、G10のカラム分離の適切な実行は、99％より高い純度で、腫瘍細胞の回復をもたらします。これは、間質細胞の汚染から生じる結果の解釈の複雑化することなく、白血病細胞の下流の分析を可能にします。すべての白血病細胞型は、細胞株または一次患者サンプルはG10カラムを通過する能力がわずかに変化するかどうかということに注意することが重要です。大規模な実験に使用する前にユーザーが入力を所望の量に必要なFを回復する必要があり、白血病細胞の数を決定する必要がありますまたはその特定の下流のニーズ。また、洗浄媒体の量はG10カラムポストインキュベーションを試み、回収された細胞の数を増加させるために増加させることができる上に走りました。ケアは、追加の洗浄は、細胞数によってポスト洗浄を判定することができる間質細胞の混入を引き起こすか、または通る流れのフローサイトメトリー分析をしないことを保証するために注意しなければなりません。
このモデルを確立する際に、我々は、細胞毒性化学療法にさらされたときにPD集団から回収した白血病細胞は、培地単独で、だけでなく、同じ共培養中のSまたはPB集団から回収されたものに成長した白血病細胞に比べて生存率を増加していることが観察され（ 図3 AB）。それは化学療法から顕著な保護を導出インビトロで白血病細胞の集団を表すので、これは重要です。これはによってサポートされているほとんどの耐性腫瘍集団を、標的とすることを目的とした治療戦略をテストするための便利なツールを提供します骨髄微小環境。さらに、これらの白血病細胞がとてもよくBMSCまたはOB共培養により保護されているので、それは培地単独、または標準的な共培養モデルでに見える、または完全ではない腫瘍を殺すことは、in vitroの併用治療戦略の影響を受けやすいです常に抵抗性微小環境で見られる効果の代表は、白血病集団をサポート。
最後に、我々はこのモデルの使用は、化学療法に対する抵抗性に関与しているBMSC / OBとの間の相互作用、および白血病細胞への貴重な洞察を提供するMRDにつながり、その後、再発することができると信じています。このモデルは、より良い下流の前臨床モデルを通知する実験を設計するためのin vitroのプラットフォームを提供します。私たちは、骨髄間質細胞およびすべての派生白血病細胞間の相互作用をテストするには、このモデルの使用方法を示しているが、我々はこのモデルの将来の方向性とアプリケーションが私たちになることを期待しています骨髄微小環境は、化学療法の介入の間に腫瘍のための聖域の部位を提供する様々な悪性腫瘍でeful。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G10 sephadex beads | Sigma | G10120 | Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles |
| 10 ml sterile syringe | BD | 309604 | |
| Glass wool | Pyrex | 3950 | |
| 1-way stopcocks | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021039 | Used as collection tubes |
| 15 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021037 | Used for cell collection |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F6178 | |
| 0.05% Trypsin | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 mm Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Culture media | |||
| Osteoblast culture media | PromoCell | C-27001 | For human osteoblast media |
| RPMI 1640 media | Mediatech, Inc. | 15-040 | For tumor media prepation |
| Cell lines | |||
| Adherent Cells: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. |
| Human Bone Morrow Stromal Cells | WVU Biospecimen Core | De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*) | |
| Leukemic Cells: | |||
| REH | ATCC | ATCC-CRL-8286 | REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32. | |||
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