Protocol
1.先进的准备
- 准备葡聚糖G10颗粒。
- 通过加入50ml 1×PBS中至10克G10颗粒制备G10浆料。通过颠倒混合并允许G10到在4℃CO / N沉淀出来的磷酸盐缓冲盐水（PBS）的。
- G10柱分离当天，吸出PBS尘埃落定G10颗粒和加入50毫升新鲜PBS。颠倒混合。重复两次，在4℃加入50毫升新鲜PBS入驻G10颗粒和储存待用。
- BMSC的培养和OB。
- 在37℃的CO 2和生长在10厘米组织培养板6％维持两者的BMSC或OB直至达到90％汇合。
- Trypsinize BMSC或OB细胞分裂和1：2到全新的10 9cm培养皿中。直到所需的白血病共培养的细胞生长至这些标准。
（二）建立和维护共同的文化
- 添加5-20×10 6个白血病细胞我Ñ10毫升肿瘤特异性培养基到80％-90％汇合的BMSC或OB板。
注意：我们的实验室保持共培养物，在37℃，在5％ 的 O 2，以更好地概括这已显示的范围从1％至7％16-18骨髓微环境。然而，维护共同培养这个氧分压不是建立三个白血病亚群的关键，是在实验室的自由裁量权。 - 每个第 4天去除所有除1毫升的媒体（包括悬浮白血病细胞）和9毫升的新鲜白血病培养基更换。当从板卸下9mL经媒体，要小心，不要打扰BMSC或OB胶粘层。
- 通过在板的拐角处的倾斜板的侧面和抽吸媒体取出介质。此外，加入新鲜介质时，一定要加一滴反对侧壁板的角落明智的，以确保BMSC或OB胶粘层的最小的中断。
- 联合培养的第 12天之后，从冲洗BMSC或OB层白血病细胞通过菜上来吹打培养基和在菜轻轻地放下约5至10次，然后在15毫升锥形管收集。补种到新的80％-90％汇合的BMSC或OB板作为在步骤2.1中描述。
注：在步骤2.3将删除S和PB白血病细胞，而不破坏BMSC或OB单层描述的共培养的温和冲洗。这仅允许肿瘤细胞被转移到下一个共培养板。这12个天的周期可被重复多次，根据需要根据用户的需求。
3.准备G10珠列
注：如果需要以下G10柱分离无菌下游分析或培养以下 步骤应该使用无菌技术进行，G10列应是无菌生物罩设置。
- 预WARM细胞培养基至37℃在水浴（〜每塔30毫升）中。用10ml的一次性注射器，取出并丢弃活塞。玻璃棉加入注射器。
- 使用镊子，拉开玻璃棉成薄松股。 轻轻填充玻璃棉多层添加到注射器直到注射器的2/3填充有玻璃棉。
注：玻璃棉是防止松动G10颗粒污染的白血病细胞采集的关键。确保玻璃棉被打包足以支持G10粒子，但不能太密集阻止通过色谱柱媒体流。 - 附加1路活塞，以在关闭位置的注射器的尖端。
- 钳注射器列环站得高足以使50毫升的锥形管（收集管）可以放在水龙头下面。将收集管注射器下列。
- 用10毫升吸管添加，逐滴重悬于PBS到列在上面，G10颗粒玻璃棉。继续添加G10颗粒直至约2ml粒料G10颗粒形式的玻璃棉顶部（由刻度上注射器作为测量）。
- 平衡与预热媒体的G10列。
- 2毫升预热媒体的添加到柱。开放式旋塞阀慢一点，让媒体流出列逐滴。
- 重复步骤3.6.1至总共为10ml预热培养基的已穿过柱跑去。
注意：如果 G10颗粒通过在收集管见于的流动，是1）增加更多G10颗粒保持约2ml粒料确保没有额外G10颗粒从柱逃逸或2）与未使用的和重复更换柱步骤3.4-3.6.1。 - 从柱中预热介质排水沟后，关闭旋塞并丢弃收集管与流过。柱下添加新的收集管。列准备就绪，可以加载介质+细胞混合物。
注：列应立即使用，而不是让其干燥。
4.分离共培养在3亚群
- 悬浮液（S）的肿瘤亚群的集合。
- 从共培养板吸管轻轻吸媒体再次申请同一介质冲洗板并收集含白血病细胞在一个15毫升的锥形管媒体。收集的白血病细胞是在S亚群。
- 相亮（PB）的肿瘤细胞亚群的集合。
- 加10毫升的新鲜介质倒流到共培养板上。吹打添加的媒体上下约5倍，除去附着的白血病细胞，但不够硬打跑贴壁BMSC / OB分量大力冲洗。
- 用吸吸管和收集在一个15毫升的锥形管媒体。收集的细胞是在PB亚群。
- 昏暗的阶段（PD）的肿瘤细胞亚群的集合。
- 冲洗板用1毫升PBS到REM奥雅纳剩余的介质。 Trypsinize共培养板用3ml胰蛋白酶和地点到37℃培养箱中培养5分钟。
- 删除盘开出孵化器，轻轻敲击板面打跑贴壁BMSC / OB。
- 加入1 ml胎牛血清（FBS）和移液器上下3-5倍掰开大细胞聚集体。
- 收集介质在15ml锥形管中的细胞。这些细胞是未纯化的PD亚群与BMSC / OB为好。
- 离心3分离的亚群，在400×g离心7分钟。吸弃上清然后分别在1毫升预热的媒体悬浮颗粒。细胞准备被装载到一个G10柱。
5.装载共培养细胞到G10柱
注：确保活塞加入含介质细胞G10柱之前完全关闭。此外，每个亚群必须在一个单独的G10柱跑，这样不会introducE在下游分析人群之间的任何偏差。
- 用1000微升吸管，在预热的媒体加入1毫升各种细胞亚群的一个单独的G10柱滴。确保含有细胞的媒体仍然在顶部或G10颗粒内。允许细胞在G10沉淀在室温下孵育20分钟。
注：旋塞阀仍然是孵化的时间关闭。
6.从G10柱收集白血病细胞
- 加入1-3毫升预热的媒体到每个G10列。开放式旋塞阀，并允许媒体要慢慢退出列逐滴。
注：这是保持从列或含有BMSC / OB可以洗出列，污染隔离白血病细胞的G10颗粒缓慢的流速是至关重要的。 - 继续以小的增量（1-2毫升）G10柱添加预热的介质，直到总共15至20毫升已通过柱运行，并且已收集。关闭活塞VALVE和帽收集管。
注：如果 G10颗粒沉淀在收集管的底部可见，轻轻地从管离开G10粒子颗粒不受干扰，并转移到新的管取出介质。 - 离心收集介质，在400×g离心在RT 7分钟。除去上清液，并在适当的下游应用程序缓冲区悬浮细胞沉淀。
- 细胞现在可以自由的BMSC或OB污染的白血病细胞的纯群体，并准备在用户自行决定要施加到下游应用。
注：通过细胞通过G10列时，白 血病细胞存活率应保持不变。
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Representative Results
此共培养模型的成功建立和培养将导致建立相对于粘附BMSC或OB单层白血病细胞的3亚群。 图1示出了接种到BMSC单层ALL细胞如何最初显示为仅悬浮单个群体白血病细胞。超过4天的白血病细胞与BMSC相互作用形成白血病细胞的3空间亚群的过程（悬浮（S）相亮（PB）和相暗淡（PD））。而肿瘤细胞的3亚群可以通常后的BMSC或OB共培养24小时中可以看出，我们的共同培养细胞4天，以允许白血病细胞和BMSC / OB小区之间的完整动态和交互发生任何操纵或实验之前发生（图1）。另外请注意，我们保持在5％的氧张力的共培养来概括骨髓生理学，其具有蜂N报从1％-7％的范围16-18。
绝大多数下游分析的需要来自BMSC或OB白血病细胞的分离。为了实现这一目标，我们使用G10列收获白血病细胞（图2A）的纯人口。以下的BMSC和PD REH细胞胰蛋白酶混合群由通过流式细胞术两个不同正向/侧群体（图2B，上图）看出。以下G10分离仅REH ALL细胞的纯群体被回收，这是由前向/侧向散射流式细胞术（ 图2B，下图）确认。
此共培养模型和来自3亚群分离白血病细胞时在共培养BMSC或OB允许白血病细胞表型的询问与相对于它的空间位置相对于附着的BMSC或OB的能力的使用单层。特别感兴趣的是，从一个BMSC或OB共培养的PD人口回收ALL细胞暴露于细胞毒性化疗有很少或没有细胞死亡（图3A，B）。
图1. ALL细胞在共培养BMSC或转播形式三个空间群。我们的实验室使用的体外共培养体系建模与骨髓微环境衍生的基质细胞（BMSC或OB）白血病细胞的相互作用。建立共培养，白血病细胞（红色）接种到BMSC或OB（蓝），其被表示为“时间0”的80％-90％汇合单层。共培养物被保持在37℃，5％的氧来近似骨髓微环境的条件。白血病细胞会开始，早在24小时形成3亚群，但允许完全的互动，FORM我们允许联合培养4天利用白血病细胞进行实验前建立。由天4（右图），白血病细胞三个亚群将形成在相对于贴壁单层。示意图（右上）和相差显微镜（右下）示出悬浮（S）白血病细胞中的媒体自由浮动;相亮（PB），它附着在BMSC或OB单层的表面白血病细胞;和相暗淡（PD）已迁移的BMSC或OB单层之下的白血病细胞。比例尺代表10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. G10柱的使用允许对从BMSC / OB ALL细胞的分离。采用G10山坳的过程中（A）示范UMN到ALL细胞从BMSC / OB共培养分离，以实现肿瘤细胞用于下游分析纯群体。从左至右，ALL细胞和BMSC / OB细胞的混合物被添加到G10柱的顶部; （中心）细胞混合物将在G10浆料沉降并应在RT孵育20分钟（注：旋塞处于关闭位置在整个前两步）; （右）白血病细胞通过打开旋塞，用预热介质漂洗柱回收。（B）的顶板G10分离有含BMSC（蓝色门）和REH ALL细胞的细胞的混合群（红色栅极之前显示）通过评估向前（FSC）和侧向散射（SSC）的分析。底板，下面G10仅分离REH的纯群体中所有细胞（红色门）留在不到1％的基质细胞污染（蓝色大门）。 请点击此处查看THI一个更大的版本的身影。
图3的PD白血病细胞增加抵抗化疗曝光。从BMSC共培养（A）的 PD人口回收不显示以下4天暴露于阿糖胞苷降低存活率SD-1白血病细胞[1μM] ，MTX [50μM]或VCR [25μM]，类似于未处理的对照组（请注意，阿糖胞苷第二剂量的增加在48小时以考虑由于稳定性的任何药物损失）。单从媒体的白血病细胞，经台盼蓝exclusion.SD-1白血病细胞与细胞OB共培养确定了活力（B）显示了类似的趋势S和PB数量已经减少了显著生存能力。结果表示为平均值±SEM表示。 （*）表示P <，相对于未处理的对照组0.05非配对t检验。5fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
微小残留病变（MRD），其有助于疾病的复发仍然是治疗侵袭性耐火ALL的一个主要的临床挑战，以及，其它血液恶性肿瘤的宿主。骨髓微环境是复发的所有3,8最常见的部位。这样，模型建模骨髓微环境是重要的工具来测试化疗曝光期间与白血病肿瘤细胞的存活和MRD的维护假设。虽然小鼠模型定义了相关的药物疗效测试题的黄金标准，2D共培养仍然是关系到明天骨微环境的支持白血病细胞存活的假设检验和药物的战略具有成本效益的方法。许多团体已经表明白血病细胞的共培养BMSC或当与化疗剂9,10,12-14,19-21挑战OB提供生存优势。建模工作正常不成熟CD34 + HEMA在共培养的间充质干细胞（MSC）topoietic细胞表明造血细胞将与MSCs的贴壁单层以形成造血细胞22,23的三个不同的空间群相互作用。扩散和CD34 +细胞分化相对于共培养22内的位置进行。我们在这一观察扩大到测试相关的二维共培养于骨髓微基质细胞支持肿瘤细胞的抗性群体及其下游分析隔离的问题。
不像标准的2D共培养模型通常采样除去悬浮肿瘤的白血病细胞，我们的模型表明，共培养表示在共培养BMSC或转播形式的白血病细胞相对于BMSC 3亚群更加动态的相互作用或OB单层（ 图1）。形成肿瘤亚群被暂停（S）的肿瘤，WHICh是自由浮动的媒体;相亮（PB），该附着于BMSC或OB的表面上;和相昏暗已被埋在BMSC或OB单层（ 图1）下方（PD）。在这个模型中，我们发现，以实现在一个共培养模型一致的结果，因此，我们喂共培养物在4天的间隔和转移肿瘤到新的BMSC或OB单层每12天严格馈送和补种时间表是非常重要的。根据需要，这可能需要修改替代肿瘤类型。将迁移的BMSC或OB以下肿瘤细胞的数目，以形成对PD群体可以不同白血病细胞之间变化。这可以是该模型的限制，当PD肿瘤细胞的数量是低使得难以收集足够的细胞用于下游分析。在某些情况下，这个问题可以通过建立复制共培养，以允许三个单独的亚群的池来克服。
由于这种模式重新位于肿瘤细胞相互作用与BMSC或OB具有以除去间质细胞污染处理白血病细胞的特异性生物学一种有效的方法是重要的。为了实现这种分离从基质我们使用G10列的肿瘤细胞。正确安装和使用这些列是为下游分析纯肿瘤人群的隔离至关重要。所强调在图2B中，在大于99％的纯度的G10柱分离结果中的肿瘤细胞的恢复的正确执行。这允许不将导致从基质细胞污染结果的解释复杂化的白血病细胞的下游分析。要注意的是所有白血病细胞类型是否细胞系或原患者样品将略微在其穿过G10柱的能力而变化是很重要的。在大规模的实验使用前用户应确定他们必须输入到回收所需的量需要˚F白血病细胞的数量或他们的特定下游需求。此外，洗涤介质的量轧过G10柱后培养可增加到尝试和增加回收的细胞的数量。应注意，以确保该附加洗涤不引起其可以通过细胞计数来确定交洗涤或通过流式细胞流分析基质细胞污染。
在建立这种模型中，我们观察到，从PD人口回收白血病细胞暴露于细胞毒性化疗时增加存活率相比，在培养基中生长单独，以及对那些在同一共培养的S或PB种群恢复白血病细胞（图3 AB）。这是显著，因为它代表白血病细胞在体外该派生化疗显保护的群体。这提供了测试旨在针对最抗性肿瘤人口，其通过支持治疗策略的有用工具骨髓微环境。此外，由于这些白血病细胞是由BMSC或OB共培养，以便很好地保护它是适合于在体外结合治疗策略，即在媒体单独或标准共培养模型似乎或不是将彻底杀死肿瘤始终代表耐微环境支持白血病人群看到效果。
最后，我们认为，使用这种模式可以提供有价值的洞察白血病细胞是负责对化疗治疗的抗性的BMSC / OB之间的相互作用，并且，导致MRD和随后复发。该模型提供了一种体外平台设计实验，这将更好地了解下游临床前模型。虽然我们展示使用这种模式来测试骨髓基质细胞和所有派生的白血病细胞之间的相互作用，我们希望，这种模式的未来发展方向和应用将是我们eful在各种恶性肿瘤，其中骨髓微环境的化学治疗干预过程中提供避难所的肿瘤的位点。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G10 sephadex beads | Sigma | G10120 | Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles |
| 10 ml sterile syringe | BD | 309604 | |
| Glass wool | Pyrex | 3950 | |
| 1-way stopcocks | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021039 | Used as collection tubes |
| 15 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021037 | Used for cell collection |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F6178 | |
| 0.05% Trypsin | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 mm Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Culture media | |||
| Osteoblast culture media | PromoCell | C-27001 | For human osteoblast media |
| RPMI 1640 media | Mediatech, Inc. | 15-040 | For tumor media prepation |
| Cell lines | |||
| Adherent Cells: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. |
| Human Bone Morrow Stromal Cells | WVU Biospecimen Core | De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*) | |
| Leukemic Cells: | |||
| REH | ATCC | ATCC-CRL-8286 | REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32. | |||
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