Protocol
1. 고급 준비
- 덱스 트란 G10 입자를 준비합니다.
- 10g의 G10 입자로 1X PBS 50 ㎖를 첨가하여 G10 슬러리를 준비한다. 반전에 의해 믹스와 G10가 4 ° CO / N에서 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 정착 할 수 있습니다.
- G10 컬럼 분리의 날, 정착 G10 입자에서 흡인 PBS 및 50 ml의 신선한 PBS를 추가합니다. 반전으로 섞는다. 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 정착 G10 입자와 저장소에 50 ml의 신선한 PBS를 추가, 두 번 반복합니다.
- BMSC와 OB를 배양.
- 90 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 6 % CO 2 및 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장하고 37 ° C에서 BMSC 또는 OB를 모두 유지한다.
- 새로운 10cm 플레이트에 2를 Trypsinize BMSC 또는 OB 세포와 1 분할. 백혈병 공동 배양에 필요한 때까지 세포는 이러한 표준으로 성장하고 있습니다.
2. 구축 및 공동 문화를 유지
- 5 ~ 20 × 10 (6) 백혈병 세포를 추가하기 전n은 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판 상에 종양 특이 적 배양 배지 10 ㎖.
참고 : 우리의 실험실 더 나은 1 %에서 7 % 16 ~ 18의 범위 것으로 나타났다 골수 미세 환경을 요점을 되풀이하는 5 % O 2에서 37 ° C에서 공동 문화를 유지한다. 그러나,이 산소 장력 공동 배양을 유지하는 세 백혈병 개체군의 확립에 중요하지 않으며 실의 재량이다. - 매 4 번째 날 (정지에서 백혈병 세포를 포함) 미디어의 1ml를 제외하고 모두 제거하고 9 ml의 신선한 백혈병 배양 배지로 교체. 판에서 미디어의 9 ml의를 제거 할 때, BMSC 또는 OB 접착층을 방해하지 않도록주의.
- 플레이트의 모서리에있는 측과 대기음 미디어에 판을 기울여 용지를 제거합니다. 신선한 매체를 추가 할 때 또한, BMSC 또는 OB 접착 층의 중단을 최소화 할 수 있도록 측벽에 대한 플레이트의 모서리에 적가를 추가해야합니다.
- 공동 문화의 12 일 하루를 보낸 후, 약 5 ~ 10 배를 요리부터 문화 미디어를 피펫 팅 아래로 부드럽게 접시 위에 의해 BMSC 또는 OB 층에서 백혈병 세포를 씻어 다음 15 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. 단계 2.1에 설명 된대로 새 80 % -90 %의 합류 BMSC 또는 OB 판에 시드.
참고 : BMSC 또는 OB 단층을 방해하지 않고 S 및 PB 백혈병 세포를 제거 단계 2.3에 설명 된대로 공동 문화의 부드러운 세정. 이것은 종양 세포는 다음 공동 배양 플레이트로 전달 될 수있다. 시간 12 일주기는 사용자의 필요에 따라 필요한만큼 여러 번 반복 될 수있다.
3. 준비 G10 구슬 열
주 : 멸균 하류 분석 또는 배양이 G10 컬럼 분리 한 다음 필요한 경우 다음 단계 멸균 기법을 이용하여 수행되어야하고, G10 컬럼 멸균 생물학적 후드에 설치되어야한다.
- 사전 WARM은 세포 배양 미디어 수조에서 37 ° C까지 (~ 30 ml의 컬럼 당). 10 ㎖의 일회용 주사기를 사용하여 제거하고 플런저를 폐기합니다. 주사기에 유리 섬유를 추가합니다.
- 핀셋을 사용하여, 얇은 느슨한 가닥에 유리 섬유를 따로 빼냅니다. 주사기의 2/3이 유리 털실로 가득 채운 때까지 주사기로 가볍게 포장 유리 섬유의 여러 레이어를 추가합니다.
주 : 유리솜은 백혈병 세포 콜렉션을 오염시키는 이른바 G10 입자를 방지하는 것이 중요하다. 확실히 유리 섬유는 G10 입자를 지원하기에 충분 포장,하지만 너무 조밀하게 열을 통해 미디어의 흐름을 차단하는 포장되지되어 있는지 확인합니다. - 폐쇄 위치에서 주사기의 끝 부분에 1 방향 스톱 콕을 부착합니다.
- 링 클램프 주사기 열 때문에 50 ML 원뿔 튜브 (포집 관)는 꼭지 아래에 배치 할 수 있습니다 충분 서있다. 주사기 열에서 수집 튜브를 놓습니다.
- 10 ML의 피펫의 상단에 열을 PBS에 재현 탁, G10 입자를 추가 드롭 현명한 사용유리솜. 유리면 위에 G10 입자 형태 (주사기 눈금으로 측정) ~ 2 mL의 펠렛까지 G10 입자를 계속 추가.
- 미리 예열 미디어와 G10의 열 평형.
- 열을 미리 예열 미디어 2 ML을 추가합니다. 그래서 오픈 스톱 콕 밸브는 천천히 미디어 드롭 현명한 열 밖으로 흐른다.
- 미리 예열 미디어 10 ㎖의 총 때까지 단계를 반복 3.6.1은 열 가로 질러왔다.
참고 : G10 입자 포집 관에서를 통해 흐름에서 볼, 중 1)보다 G10 입자를 추가하는 경우 추가 G10 입자가 열에서 탈출하지 확인한 ~ 2 ml의 펠렛을 유지하거나 2)하지 않는 한 반복과 열을 교체 3.4-3.6.1 단계를 반복합니다. - 열에서 미리 예열 미디어 빼낸 후, 꼭지를 닫고 통해 흐름을 수집 튜브를 폐기합니다. 열에서 새 컬렉션 튜브를 추가합니다. 열 매체 + 세포 혼합액로드 될 준비가되어있다.
참고 : 열즉시 사용 및 건조 허용되지해야합니다.
4. 공동 문화 내에서 3 부분 집단을 분리
- 서스펜션 (S) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
- 공동 배양 접시에서 대기음 미디어 피펫 부드럽게 플레이트를 씻어 15 ML 원뿔 튜브에 백혈병 세포를 포함하는 미디어를 수집하기 위해 같은 미디어를 신청 다시. 수집 백혈병 세포 S 아군이다.
- 단계 밝은 (PB) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
- 공동 배양 접시에 다시 10 ml의에게 신선한 매체를 추가합니다. 부착 백혈병 세포 만 부착 BMSC / OB 성분을 제거하기 어려운 충분하지를 제거하기 위해 위 아래로 약 5 시간을 추가 한 미디어를 피펫 팅에 의해 적극적으로 씻어.
- 피펫 기음과 15 ML 원뿔 튜브 미디어를 수집합니다. 수집 된 세포는 PB 아군이다.
- 단계 어둡게 (PD) 종양 모집단의 컬렉션입니다.
- 렘 1 ml의 PBS와 린스 판비켜 남은 용지. 5 분 동안 37 ° C 배양기에 3 ㎖ 트립신과 장소를 Trypsinize 공동 문화 판.
- 부착 BMSC / OB을 제거하기 위해 플레이트의 측면을 누릅니다 부드럽게 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
- 떨어져 큰 세포 집합체을 깰 1 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 및 피펫 위아래로 3-5 시간을 추가합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 세포와 미디어를 수집합니다. 이러한 세포뿐만 BMSC / OB로 미정 PD 아군이다.
- 원심 분리기 3 7 분 동안 400 XG에서 소집단을입니다. 기음과 폐기 뜨는는 개별적으로 1 ml의 사전 예열 매체에 펠렛을 재현 탁. 세포는 G10 컬럼에로드 할 준비가 된 것입니다.
G10 열 상 (5)로드 공동 배양 세포
참고 : 확인 꼭지를 확인 완전히 G10 컬럼 미디어 포함하는 셀을 추가하기 전에 폐쇄된다. 또한, 각각의 하위 집단은부터 소개하기 위해 그렇게하지 별도의 G10 컬럼을 통해 실행해야합니다다운 스트림 분석 인구 사이의 바이어스를 전자.
- 1,000 μL 피펫을 사용하여, 드롭 현명한 별도의 G10 컬럼에 미리 예열 미디어에서 각 셀의 모집단 1 ㎖를 추가합니다. 세포를 포함하는 미디어가 상단이나 G10 펠릿 내에 남아 있는지 확인합니다. 세포가 실온에서 20 분 동안 G10 펠릿에 품어 할 수 있습니다.
참고 : 조절판은 배양 기간 동안 폐쇄 남아있다.
6. G10 열에서 백혈병 세포를 수집
- 각 G10 컬럼에 1-3 ml의 사전 예열 매체를 추가합니다. 오픈 스톱 콕 밸브와 미디어 천천히 열을 적가 종료 할 수 있습니다.
참고 : 열 또는 열에서 씻고 고립 된 백혈병 세포를 오염시킬 수 BMSC / OB를 포함하는 G10 펠릿에서 느린 유속을 유지하는 것이 중요하다. - 15 ~ 20 ML의 총까지 G10 컬럼 작은 단위 (1-2 ml)에 미리 예열 미디어를 계속 추가 칼럼을 통해 실행하고 수집하고 있습니다. 닫기 스톱 콕 버지니아LVE와 모자 포집 관.
참고 : G10 입자 펠릿 수집 튜브의 하단에 볼 경우, 부드럽게 G10 입자 펠릿 그대로 새로운 튜브로 전송 떠나는 튜브에서 용지를 제거합니다. - 원심 분리기는 실온에서 7 분 동안 400 XG에 미디어를 모았다. 상층 액을 제거하고 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 적절한 버퍼에 세포 펠렛을 재현 탁.
- 셀은 BMSC 또는 OB 오염없는 백혈병 세포의 순수 인구이며 사용자 재량 하류 어플리케이션에 적용 할 준비가되어있다.
참고 : G10 컬럼을 통해 세포를 통과 할 때 백혈병 세포 생존 능력은 변경되지 않은 상태로 유지해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 공동 문화 모델의 성공적인 설치 및 문화. 부착 BMSC 또는 OB 단층에 비해 백혈병 세포의 3 개체군의 설립 결과 1 BMSC 단일 층으로 시드 ALL 세포가 초기에 중단의 같은 단 하나의 인구를 표시하는 방법을 보여줍니다 것이다 백혈병 세포. 백혈병 세포는 백혈병 세포의 개체군 3 공간을 형성하도록 상호 작용 BMSC 사일의 과정 ((현탁 S) 상 밝은 (PB) 및 위상 딤 (PD)). 종양 세포의 3 소집단 일반적 BMSC 또는 OB와 공동 - 배양 후 24 시간 후에 볼 수 있지만, 우리는 백혈병 세포 및 BMSC / OB 셀 간의 전체 역학과 상호 작용이 일어날 수 있도록 4 일 동안 세포를 배양 된 공동 어떤 조작이나 실험을하기 전에 장소 (그림 1) 소요됩니다. 또한, 우리는 꿀벌이있는 골수 생리학 요점을 되풀이 5 %의 산소 장력에서 공동 배양을 유지 유의여기서 n은 1 % -7 %, 16 ~ 18의 범위에보고했다.
전방 분석의 대부분 BMSC 또는 OB의 백혈병 세포의 분리를 요구한다. 이를 위해 우리는 백혈병 세포 (그림 2A)의 순수한 인구를 수확 G10 열을 사용합니다. BMSC와 PD REH 세포의 트립신에 따라 혼합 인구는 유동 세포 계측법에 의해 두 가지 정 / 측면 인구 (그림 2B, 상단 패널)에서 볼 수 있습니다. G10 분리를 만 REH ALL 세포의 순수한 인구에 이어 정 / 측면 산란은 유동 세포 계측법 (그림 2B, 하단 패널)에 의해 확인 된, 회수된다.
이 공 배양 모델 및 BMSC 또는 OB와 공동 배양 부착 BMSC 또는 OB에 공간적 상대적인 위치 관계와 백혈병 세포 표현형 심문 허용 때 3 소집단에서 백혈병 세포를 분리하는 기능이 사용단일 층. 특히 관심, BMSC 또는 OB 공동 문화의 PD 인구에서 복구 ALL 세포가 화학 요법 세포 독성에 노출 된 다음 어떤 세포 사멸에 조금 가지고있다 (그림 3A를, B).
그림 1. BMSC 또는 OB 형태의 세 공간 인구와 공동 문화의 모든 세포. 우리 연구소는 골수 미세 환경 유래 기질 세포 (BMSC 또는 OB)와 백혈병 세포 상호 작용을 모델링 체외 공동 배양 시스템을 사용합니다. 공동 문화를 확립하기 위해, 백혈병 세포 (레드) '시간 0'로 표시된다 BMSC 또는 OB (블루)의 80 % -90 %의 합류 단일 층에 씨앗을 품고있다. 공동 배양 골수 미세 환경의 조건을 대략 5 %의 산소에서 37 ° C로 유지된다. 백혈병 세포는 빠르면 24 시간으로 3 소집단을 형성하기 시작하지만, FO하는 완전한 상호 작용 할 수 있도록RM 우리는 공동 문화 사일 실험에 대한 백혈병 세포를 이용하기 전에 설정할 수 있습니다. 4 일 (오른쪽 패널)으로 백혈병 세포의 세 개체군이 부착 단층과 관련하여 형성 할 것이다. 회로도 (오른쪽 위)과 위상차 현미경 (오른쪽 아래) 표시 정지 (S) 자유롭게 미디어에 떠있는 백혈병 세포; 위상 밝은 (PB) BMSC 또는 OB 단층의 표면에 부착 세포 백혈병; 위상 희미 (PD) BMSC 또는 OB 단층 아래에 마이그레이션 한 백혈병 세포. 스케일 바는 10 미크론을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
G10 열 그림 2. 사용 BMSC / OB에서 모든 세포의 분리 할 수 있습니다. G10의 COL을 이용하는 공정 (A) 데모UMN 하류 분석 종양 세포의 순수 인구 달성 BMSC / OB의 공동 - 배양에서 ALL 세포를 분리한다. 왼쪽에서 오른쪽으로 ALL 세포 및 BMSC / OB 세포 혼합물 G10 컬럼의 상부에 첨가되고; (센터) 세포 혼합물 G10 슬러리에 정착하고 20 분 동안 RT에서 배양한다 (주 : 조절판 처음 두 단계에 걸쳐 폐쇄 위치에); (오른쪽) 백혈병 세포 콕을 열고 예열 매체 칼럼 세척에 의해 회수된다. (B) 상단 패널은 모든 셀 BMSC (블루 문) 및 REH 함유 세포의 혼합 집단 (레드 게이트가 있다는 G10 분리 전에 도시 ) 앞으로 평가하여 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 분석. G10 분리 ALL 세포 (레드 게이트) 1 % 미만의 간질 세포 오염 (파란색 게이트) 남아 REH의 순수한 인구 다음 바닥 패널. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 의 그림입니다.
그림 3. PD 백혈병 세포는 화학 요법 노출에 대한 내성을 증가하고있다. 아라-C에 4 일간 노출 후 감소 가능성을 표시하지 않습니다 BMSC의 공동 문화 (A)의 PD 인구에서 복구 SD-1 백혈병 세포를 [1 μM] , 처리되지 않은 컨트롤과 유사한 MTX [50 μM, 또는 VCR [25 μM은] (아라-C의 두 번째 투여 량은 안정성으로 인해 어떤 약물 손실을 고려하여 48 시간에서 추가 참고). OB 세포와 공동 배양 트리 판 블루 exclusion.SD-1 백혈병 세포에 의해 결정 생존 (B)에 유사한 경향을 표시 단독 미디어에서 백혈병 세포는 S, 및 PB 인구가 크게 가능성을 감소. 결과는 SEM ± 평균으로 표현된다. (*) p <0.05 대조군과, 짝 t 검정에 상대적이다.5fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
질병의 재발에 기여 최소 잔존 질환 (MRD)는 모든 공격 내화물의 치료에서 주요 임상 과제이며, 또한, 다른 혈액 학적 악성 종양의 호스트로 계속된다. 골수 미세 환경 모두에서 재발 -3,8-의 일반적인 위치이다. 이와 같이, 골수 미세 환경을 모델링 모델 요법 노광 중에 백혈병 종양 세포 생존 및 MRD의 유지에 관한 가설을 테스트하기 위해 중요한 도구이다. 마우스 모델은 약물 효능에 관한 시험 질문에 대한 황금 표준을 정의하는 동안, 2D 공동 문화는 백혈병 세포 생존의 뼈 내일의 미세 환경 지원과 관련 테스트 가설 및 약물 전략에 대한 비용 효과적인 방법되고 있습니다. 많은 그룹은 BMSC와 백혈병 세포의 공동 문화를 보여 주었다 또는 화학 요법 제 9,10,12-14,19-21에 도전 할 때 OB는 생존 이점을 제공한다. 작업 모델링 일반 미숙 한 CD34 + HEMA중간 엽 줄기 세포 (MSC)와 공동으로 문화 topoietic 세포는 조혈 세포는 조혈 세포 (22, 23)의 세 가지 공간 집단을 형성하는 중간 엽 줄기 세포의 부착 단층과 상호 작용하는 것으로 나타났습니다. 확산 및 CD34 + 세포의 분화는 공동 문화 (22) 내에서의 위치에 상대적으로 영향을 하였다. 우리는 골수 미세 환경의 간질 세포 차원의 공동 문화 내에서 종양 세포의 내성 인구의 지원 및 다운 스트림 분석에 대한 분리와 관련된 질문을 테스트하기 위해이 관찰을 확장했습니다.
일반적으로 일시 중단 된 종양의 제거에 의한 백혈병 세포 샘플을 표준 2D 공동 문화 모델과는 달리, 우리의 모델은 공동 문화 BMSC 세 소집단 상대 BMSC 또는 OB 양식을 공동 문화에있는 백혈병 세포에서보다 역동적 인 상호 작용을 나타내는 표시 또는 OB의 단층 (그림 1). 형성 종양 소집단이 일시 중단 (S) 종양, WHI채널 자유롭게 미디어에 떠; BMSC 또는 OB의 표면에 부착되어 상 밝은 (PB); 위상 희미 BMSC 또는 OB의 단층 (그림 1) 아래에 묻혀있다 (PD). 이 모델에서, 우리는 엄격한 공급 및 시드 일정이 공동 문화 모델에서 일관된 결과를 달성하고, 따라서 우리 4 일 간격으로 공동 문화를 먹이 모든 십이일 새로운 BMSC 또는 OB 단층에 종양를 전송하는 데 중요하다는 것을 발견했다. 필요에 따라이 다른 종양 유형에 대한 수정을 요구할 수있다. BMSC 또는 OB 이전 것보다 종양 세포의 수는 PD 인구 다른 백혈병 세포 다릅니다 형성한다. PD 종양 세포의 수가 어려운 하류 분석을위한 충분한 세포를 수집하고있다 낮은 경우에, 모델의 한계 일 수있다. 어떤 경우에는 이러한 문제가 세 개인 개체군의 풀링 있도록 공동 배양 복제 설정함으로써 극복 될 수있다.
이 모델 재로BMSC와 종양 세포의 상호 작용에 놓여 있거나 백혈병 세포의 특정 생물을 해결하기 위해 간질 세포 오염을 제거하는 효과적인 방법을 갖는 것이 중요하다 OB. 우리는 G10 컬럼을 사용하여 기질로부터 종양 세포의 이러한 분리를 달성한다. 이 컬럼의 설치와 사용은 다운 스트림 분석을위한 순수한 종양 인구의 절연을위한 중요하다. 도 2b를 참조하면, 99 % 이상의 순도로 종양 세포의 회복 G10 컬럼 분리 결과의 적절한 실행에 강조있다. 이 기질 세포 오염 초래 결과의 해석의 합병증없이 백혈병 세포의 다운 스트림 분석 할 수 있습니다. 모든 백혈병 세포 유형은 세포주 또는 일차 환자 샘플 G10 컬럼을 통과 할 수있는 능력이 약간 달라질 수 있는지 유의하는 것이 중요하다. 대규모의 실험에 사용하기 전에 사용자는 입력을 원하는 양 필요한 F를 복구해야 백혈병 세포의 수를 결정한다또는 특정 하류 필요. 또한, 세척 매질의 양은 G10 컬럼 후 배양 시도 회수 세포의 수를 증가시키기 위해 증가 될 수있다 위에 달렸다. 케어는 추가 세척이 세포 수에 의해 게시물 세척을 결정 또는 통해 흐름의 분석 유동 세포 계측법 할 수 기질 세포 오염이 발생하지 않도록 보장하기 위해주의해야한다.
이 모델을 구축에서는 항암 세포 독성에 노출 될 때 PD 집단으로부터 회수 백혈병 세포가 단독으로뿐만 아니라, 동일한 공 배양에서 S 또는 PB 집단으로부터 회수에게 미디어 성장 백혈병 세포에 비해 생존율을 증가 관찰 (그림 3 AB). 이 화학 요법에서 현저한 보호를 유도 체외에서 백혈병 세포의 인구를 나타 내기 때문에 이것은 중요하다. 이 지원하는 가장 저항하는 종양 인구를 대상으로하기위한 치료 전략을 테스트 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다골수 미세 환경. 이 백혈병 세포가 너무 잘 BMSC 또는 OB의 공동 문화에 의해 보호되기 때문에 또한, 그 또는 표준 공동 문화 모델에 나타납니다 또는하지 않은 완전히 종양을 죽일 형 미디어에, 체외 조합 치료 전략에 의무가 저항하는 미세 지원 백혈병 인구에서 볼 효과를 항상 대표.
마지막으로, 우리는이 모델의 사용, 화학 요법 치료에 저항 할 책임이 있습니다 BMSC / OB 사이의 상호 작용, 그리고 백혈병 세포에 대한 귀중한 통찰력을 제공 MRD으로 이어질, 이후 재발 할 수 있다고 생각합니다. 이 모델은 더 하류 전임상 모델을 알려드립니다 실험을 설계 할 수있는 체외 플랫폼을 제공합니다. 우리가 골수 기질 세포와 모든 파생 된 백혈병 세포 사이의 상호 작용을 테스트하기 위해이 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다 만, 우리는이 모델의 향후 방향 및 응용 프로그램이 우리가 될 것입니다 희망입니다골수 미세 환경을 조작하는 동안 화학 요법에 대한 종양의 성역 사이트를 제공하는 악성 종양의 다양한 eful.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| G10 sephadex beads | Sigma | G10120 | Referred to in manuscript as gel type 10 cross-linked dextran particles |
| 10 ml sterile syringe | BD | 309604 | |
| Glass wool | Pyrex | 3950 | |
| 1-way stopcocks | World Precision Instruments, Inc. | 14054-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021039 | Used as collection tubes |
| 15 ml conical centrifuge tubes | World Wide Medical Products | 41021037 | Used for cell collection |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F6178 | |
| 0.05% Trypsin | Mediatech, Inc. | 25-053-CI | |
| 100 x 20 mm Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Culture media | |||
| Osteoblast culture media | PromoCell | C-27001 | For human osteoblast media |
| RPMI 1640 media | Mediatech, Inc. | 15-040 | For tumor media prepation |
| Cell lines | |||
| Adherent Cells: | |||
| Human Osteoblasts | PromoCell | C-12720 | Human osteoblast were cultured according to the supplier’s recommendations. |
| Human Bone Morrow Stromal Cells | WVU Biospecimen Core | De-identified primary human leukemia and bone marrow stromal cells (BMSC) were provided by the Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core and the West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank. BMSC cultures were established as previously described (*) | |
| Leukemic Cells: | |||
| REH | ATCC | ATCC-CRL-8286 | REH cells were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| SD-1 | DSMZ | ACC 366 | SD-1 were cultured according to the supplier’s recommendations and recommended media. |
| (*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Disruption of bone marrow stromal cell function by etoposide. Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 Aug;3(3):122–32. | |||
References
- Ayala, F., Dewar, R., Kieran, M., Kalluri, R. Contribution of bone microenvironment to leukemogenesis and leukemia progression. Leukemia. 23 (12), 2233-2241 (2009).
- Coustan-Smith, E., Sancho, J., et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 96 (8), 2691-2696 (2000).
- Gaynon, P. S., Qu, R. P., et al. Survival after relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 82 (7), 1387-1395 (1998).
- Kikuchi, M., Tanaka, J., et al. Clinical significance of minimal residual disease in adult acute lymphoblastic leukemia. Int. J. Hematol. 92 (3), 481-489 (2010).
- Krause, D. S., Scadden, D. T., Preffer, F. I. The hematopoietic stem cell niche-home for friend and foe? Cytometry B Clin. Cytom. 84 (1), 7-20 (2013).
- Meads, M. B., Hazlehurst, L. A., Dalton, W. S. The Bone Marrow Microenvironment as a Tumor Sanctuary and Contributor to Drug Resistance. Clin. Cancer Res. 14 (9), 2519-2526 (2008).
- Nguyen, K., Devidas, M., et al. Factors Influencing Survival After Relapse From Acute Lymphoblastic Leukemia: A Children's Oncology Group Study. Leuk. Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund UK. 22 (12), 2142-2150 (2008).
- Szczepanek, J., Styczyński, J., Haus, O., Tretyn, A., Wysocki, M. Relapse of Acute Lymphoblastic Leukemia in Children in the Context of Microarray Analyses. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 59 (1), 61-68 (2011).
- Boyerinas, B., Zafrir, M., Yesilkanal, A. E., Price, T. T., Hyjek, E. M., Sipkins, D. A. Adhesion to osteopontin in the bone marrow niche regulates lymphoblastic leukemia cell dormancy. Blood. 121 (24), 4821-4831 (2013).
- Bradstock, K., Bianchi, A., Makrynikola, V., Filshie, R., Gottlieb, D. Long-term survival and proliferation of precursor-B acute lymphoblastic leukemia cells on human bone marrow stroma. Leukemia. 10 (5), 813-820 (1996).
- Clutter, S. D., Fortney, J., Gibson, L. F. MMP-2 is required for bone marrow stromal cell support of pro-B-cell chemotaxis. Exp. Hematol. 33 (10), 1192-1200 (2005).
- Manabe, A., Murti, K. G., et al. Adhesion-dependent survival of normal and leukemic human B lymphoblasts on bone marrow stromal cells. Blood. 83 (3), 758-766 (1994).
- Mudry, R. E., Fortney, J. E., York, T., Hall, B. M., Gibson, L. F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 96 (5), 1926-1932 (2000).
- Tesfai, Y., Ford, J., et al. Interactions between acute lymphoblastic leukemia and bone marrow stromal cells influence response to therapy. Leuk. Res. 36 (3), 299-306 (2012).
- Hathcock, K. S. Depletion of Accessory Cells by Adherence to Sephadex G-10. Curr. Protoc. , (2001).
- Berniakovich, I., Giorgio, M. Low oxygen tension maintains multipotency, whereas normoxia increases differentiation of mouse bone marrow stromal cells. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 2119-2134 (2013).
- Chow, D. C., Wenning, L. A., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Modeling pO(2) distributions in the bone marrow hematopoietic compartment. II. Modified Kroghian models. Biophys. J. 81 (2), 685-696 (2001).
- Holzwarth, C., Vaegler, M., et al. Low physiologic oxygen tensions reduce proliferation and differentiation of human multipotent mesenchymal stromal cells. BMC Cell Biol. 11, (2010).
- O'Leary, H., Akers, S. M., et al. VE-cadherin Regulates Philadelphia Chromosome Positive Acute Lymphoblastic Leukemia Sensitivity to Apoptosis. Cancer Microenviron. Off. J. Int. Cancer Microenviron. Soc. 3 (1), 67-81 (2010).
- Wang, L., Chen, L., Benincosa, J., Fortney, J., Gibson, L. F. VEGF-induced phosphorylation of Bcl-2 influences B lineage leukemic cell response to apoptotic stimuli. Leukemia. 19 (3), 344-353 (2005).
- Wang, L., Coad, J. E., Fortney, J. M., Gibson, L. F. VEGF-induced survival of chronic lymphocytic leukemia is independent of Bcl-2 phosphorylation. Leukemia. 19 (8), 1486-1487 (2005).
- Jing, D., Fonseca, A. V., et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells--modeling the niche compartments in vitro. Haematologica. 95 (4), 542-550 (2010).
- Jing, D., Wobus, M., Poitz, D. M., Bornhäuser, M., Ehninger, G., Ordemann, R. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica. 97 (3), 331-339 (2012).
