Abstract
fibres descendantes longues à la moelle épinière sont essentiels pour la locomotion, la perception de la douleur, et d'autres comportements. Le motif de terminaison des fibres dans la moelle épinière de la plupart de ces systèmes de fibres n'a pas été complètement étudiée chez toutes les espèces. fibres sérotoninergiques, qui projettent de la moelle épinière, ont été étudiés chez des rats et des opossums sur des coupes histologiques et leur signification fonctionnelle a été déduite en fonction de leur motif de terminaison de fibre dans la moelle épinière. Avec le développement de CLARITY et techniques CUBES, il est possible d'étudier ce système de fibre et de sa distribution dans la moelle épinière, ce qui est susceptible de caractéristiques inconnues des voies sérotoninergiques supraspinales révéler. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'imagerie des fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris à l'aide du CLARITY combiné et techniques CUBES. Le procédé implique la perfusion d'une souris avec une solution d'hydrogel et la clarification du tissu avec une Combination de la compensation des réactifs. le tissu de la moelle épinière a été effacé en un peu moins de deux semaines, et la coloration immunofluorescence ultérieure contre la sérotonine a été achevée en moins de dix jours. Avec un microscope à fluorescence multi-photon, le tissu a été numérisé et une image en 3D a été reconstruit en utilisant un logiciel Osirix.
Protocol
Déclaration éthique: Toutes les procédures impliquant des sujets animaux suivent les directives du Comité des soins aux animaux et de l'éthique (ACEC) à l'Université de Nouvelle-Galles du Sud (le nombre AFIC approuvé est 14 / 94A).
1. Préparation du cordon spinal de souris transparent
- Préparation de Ice Cold Hydrogel Solution
- Préparation d'une solution de paraformaldéhyde à 16% (PFA)
- Ajouter 16 g de paraformaldéhyde poudre dans 70 ml-pré réchauffé l'eau distillée (50-55 ° C) et agiter sur un agitateur magnétique chauffé jusqu'à ce que le paraformaldéhyde est dissous. Remarque: Ne laissez pas la solution à la chaleur supérieure à 55 ° C et être conscient que paraformaldéhyde est toxique.
- Transférer la solution de paraformaldéhyde à un cylindre et d'ajouter de l'eau distillée jusqu'à 100 ml. Refroidir la solution de paraformaldehyde en utilisant un C réfrigérateur 4 °.
- Dissoudre 125 mg VA-044 initiateur dans 26,25 ml d'eau distillée et refroidir la solution dans un 4° C réfrigérateur.
- Laisser refroidir 5 ml de solution d'acrylamide (40%), 1,25 ml de solution de bis (2%) (ATTENTION: Bis et des solutions d'acrylamide sont toxiques, peuvent induire des anomalies génétiques ou de cancer), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% solution PFA, et solution d'initiateur VA-044 sur la glace.
- Mélanger les solutions ci-dessus sur la glace.
Remarque: le volume total est de 50 ml.
- Préparation d'une solution de paraformaldéhyde à 16% (PFA)
- Perfusion et Collection de la moelle épinière de souris
- Anesthésier une souris avec une injection intraperitoneale de kétamine (80 mg / kg) et xyzaline (5 mg / kg) dilué dans 0,9% de solution saline normale. La posologie pour les souris peut être inférieur à celui des rats.
- Sur une surface plastique appropriée dans une hotte, fixer les membres de la souris à partir du corps (ruban adhésif est efficace) une fois que la souris ne répond pas à une pincée de sa peau du pied.
- Couper la peau de la souris sur la poitrine, puis la poitrine osseuse pour exposer le cœur avec une paire de ciseaux.
- En utilisant une pompe péristaltique, avec une aiguille 25 G fixée à the extrémité du tube, insérer l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur, snip l'oreillette droite pour créer un point pour le sang de sortie et puis commencer à laver avec 40 ml de 0,9% de solution saline normale un taux d'environ 10 ml / min.
- Une fois terminé, perfuser la souris avec 35 ml de glace solution d'hydrogel froid.
Remarque: perfuser à une vitesse de 10 ml / min pour éviter le gonflement du tissu nerveux. - Inciser la peau sur le dos avec une lame, puis retirez les muscles à côté du vertébré. Après avoir coupé les arcs vertébraux d'un côté et en les retournant de l'autre côté, prendre la moelle épinière de la colonne vertébrale d'une amende de ciseaux.
- Effacement de la moelle épinière de souris
- Placer la moelle épinière dans 15 ml de solution d'hydrogel pendant une nuit à 4 ° C.
- Prélever 10 ml de la solution d'hydrogel et verser le reste de la solution avec les segments de la moelle épinière dans un tube de 5 ml. Remplir le tube 5 ml de la solution d'hydrogel jusqu'à ce qu'il soit complètement rempli.
- Tendez un petit morceau de parafilm sur le dessus du tube de 5 ml, puis les envelopper parafilm autour du col du tube. Remarque: Vérifiez que les contacts de parafilm la solution d'hydrogel et il n'y a pas de bulles entre la solution d'hydrogel et le parafilm.
- Mettre le tube de 5 ml dans un 37 Four ° C pendant une nuit. Observer la solution d'hydrogel jusqu'à ce qu'il devienne un gel.
- Prenez le tube de 5 ml sortie du four et retirer le gel du tube avec une clé (comme un 1 ml pointe de la pipette pelleté). Retirer le gel du tissu de la moelle épinière en collant le tissu grossier pour le gel, puis prendre le tissu grossier de suite (le gel va coller au tissu et sera donc éliminé par le tissu).
- Après avoir enlevé le gel du tissu de la moelle épinière, la moelle épinière laver 4 fois avec 1 x PBS (pH 7,4) pendant 24 heures sur un agitateur.
- Préparer la solution de compensation CUBIQUE en dissolvant 3,85 g d'urée et 3,85 g de N, N, N ', N'-tétrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine dans 5,38 ml d'eau distillée.
Note: Un agitateur à chaud est utilisé. Ajouter 2,31 g de polyéthylène glycol éther mono-p-isooctylphényle / Triton X-100 à la solution une fois qu'il est clair et se refroidit à la température ambiante.
Note: 10 g de ces trois produits chimiques sont pour une souris. - Couper la moelle épinière de souris coronale dans 2-3 mm de long segments avec une lame de rasoir et les mettre dans 5 ml de la solution de compensation CUBIC ci-dessus. Placer sur un agitateur dans le four à 37 ° C ° C pendant 3 jours.
- Trois jours plus tard, changer la solution de compensation à une nouvelle. Note: la solution ci-dessus est préparée avant utilisation.
- Deux à trois jours plus tard, après avoir rafraîchi la solution de compensation CUBIC, vérifier la transparence du tissu contre un papier avec les polices 8 lettres. Si elle est transparente, les lettres peuvent être vus à travers le tissu effacé. Retirer la solution de compensation et ajouter 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) pour laver le tissu 4 fois par jour (toutes les 6 heures).
- Incuber les segments de la moelle épinière dans la solution d'anticorps primaire (anti-sérotonine, élevé chez le lapin, dilué à 1: 100 dans PBST) pendant 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
- Enlever la solution d'anticorps et ajoute 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) pour laver les segments de la moelle épinière 4 fois par jour (toutes les 6 heures) dans un four à 37 ° C.
- Retirer la solution de PBST et on ajoute la solution d'anticorps secondaire (chèvre conjugué 594 IgG anti-lapin, dilué à 1: 100 dans PBST) à incuber le tissu pendant 3 jours sur un agitateur dans un four à 37 °.
- On élimine la solution d'anticorps secondaire et ajoute 4 ml de PBST pour laver les segments de la moelle épinière 4 fois par jour (toutes les 6 heures) sur un agitateur dans un four à 37 °. Le lendemain, le tissu est prêt pour l'imagerie.
3. Imaging
- Enlever la solution PBST et on ajoute 4 ml de 85% de glycerol pour rendre l'indice de réfraction du tissu même.
- Mettre quelques gouttes de 85% de glycerol à côté du tissu de la moelle épinière et Coverslip avec une lamelle en verre de 22 x 50 mm 2.
Remarque: L'orientation de la moelle épinière décide comment l'image ressemble. - Mettez la lame de verre sur le cadre de maintien de la multi-photons microscope à fluorescence et déplacer le tissu dans la voie de la lumière.
- Choisissez Helium Neon ligne laser 594 nm et d'ajuster l'intensité du laser au niveau optimal en vérifiant la luminosité du signal positif dans l'image en direct.
- Sélectionnez la zone de balayage du tissu de la moelle épinière en utilisant l'objectif 20X (dans l'eau, NA 0,7) et se préparer à créer un z-stack, et la profondeur de chaque étape fixé à 3 pm.
- Balayer le tissu à partir du haut vers le bas de la pile z 20X sous la objective puis objectif 63X (dans l'huile, 1,4 NA) (taille de l'étape 1 a été um), respectivement. Reconstruire vidéos 3D à l' aide d' un logiciel 3D 28.
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Representative Results
Cette section présente les résultats de l'anticorps de la sérotonine coloration dans la moelle épinière de souris transparent en utilisant une combinaison des CLARITY et protocoles CUBES. Nous montrons que les fibres sérotoninergiques sont présentes dans toutes les strates de la moelle épinière avec une prédominance dans la partie ventrale de la corne ventrale (figure 1, vous pouvez aussi consulter la vidéo 1). Le contrôle de tissu n'a pas eu de fibres positives (résultat n'a pas été représenté). Dans la corne ventrale, les fibres sérotoninergiques denses sont présents dans la partie ventromédian de la corne ventrale et ils étendent vers la partie latérale de la corne ventrale (Figure 2, voir aussi la vidéo 2). Certaines fibres immunopositives étendent également à partir de la corne ventrale vers la corne dorsale ou le canal central. fibres immunopositives sont présentes dans toutes les strates de la corne dorsale, mais il y a un petit espace entre les fibres positives dans lamina 2 et 4, en particulier dans la partie latéraleune partie de la corne dorsale. La majorité des fibres sérotoninergiques dans la corne dorsale sont de petit diamètre et seulement un petit nombre d'entre eux sont de grand diamètre (vidéo 1). Dans une section horizontale, les fibres sérotoninergiques denses dans la corne ventrale ont été observées pour se déplacer le long de l'axe longitudinal de la moelle épinière et de former un grand faisceau de fibres. Le résultat le plus intéressant est que ce grand faisceau de fibres délivre des branches régulièrement le long de l'axe longitudinal, qui sont perpendiculaires au faisceau de fibres. Ces branches garantissent des plus loin le long de leurs voies à la partie latérale de la corne ventrale. Par rapport à ces branches, celles étendant vers la ligne médiane sont irrégulières et plus petite (figure 2). Sous l'objectif 63X, les fibres sérotoninergiques dans la corne dorsale ont été observés pour voyager le long de l'axe de la moelle épinière et de mettre fin à différents points le long du trajet de l'appareil. Les fibres épaisses sont sporadiquement réparties entre la mince f IBERS (figure 3, voir aussi la vidéo 3).
Figure 1:. Fibres sérotoninergiques dans une section coronale du cordon lombaire à 200X gauche est la corne ventrale, à droite est la corne dorsale, dorsale est la partie médiane de la moelle épinière, et ventrale est la partie latérale de la moelle épinière. La barre d'échelle est de 100 um. fibres sérotoninergiques sont présentes dans toutes les strates, en particulier dans la partie ventromédian de la corne ventrale où la densité des fibres est élevée. Ces fibres s'étendent à la fois vers la partie latérale de la corne ventrale et le canal ou la corne dorsale centrale. La densité des fibres dans les autres strates est faible. La majorité des fibres sérotoninergiques sont minces. Seul un petit nombre de fibres sont épaisses et ils sont vus à la fois la corne dorsale et la corne ventrale (> voir aussi la vidéo 1 (clic pour télécharger)).
Figure 2:. Fibres sérotoninergiques dans la partie ventrale de la corne ventrale au 200X gauche et à droite sont les côtés latéraux de la moelle épinière, dorsale est la partie rostrale de la moelle épinière, et ventrale est la partie caudale de la moelle épinière. La barre d'échelle est de 100 um. fibres sérotoninergiques sont représentés se déplaçant le long de l'axe longitudinal de la moelle épinière et emballés dans la partie médiane de la corne ventrale où ils forment un faisceau de fibres d'épaisseur. Sur cet ensemble, certaines branches sont étendues à intervalles réguliers vers la partie latérale de la corne ventrale, tandis que d'autres qui se prolongent vers la ligne médiane sont irréguliers et plus courte. Ces fibres se terminent au niveau de nombreux points le long du chemin du faisceau ( voir également la vidéo 2(Clic pour télécharger)).
Figure 3: fibres sérotoninergiques dans la corne dorsale sous au 630X grossissement gauche est la partie latérale de la moelle épinière, est juste la partie médiane de la moelle épinière, dorsale et ventrale se référer à la partie dorsale et une partie ventrale de la corne dorsale, respectivement. . La barre d'échelle est de 7 pm. sérotoninergiques fibres se déplacent le long de l'axe longitudinal de la moelle épinière et se terminent le long du trajet du faisceau. Ces fibres sont principalement de petit diamètre, avec un petit nombre de fibres entremêlées d'épaisseur. Ces fibres se chevauchent rarement les uns avec les autres ( voir aussi la vidéo 3 (clic droit pour télécharger) ).
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Discussion
Le protocole décrit montre comment l'image des fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris avec le CLARITY combinés et techniques CUBES. Elle introduit un processus de compensation plus rapide par rapport au protocole de compensation passive développée par Cheung et al. 14 et Tomer et al. 15 et permet le tissu de la moelle épinière à être bien pris en charge par l'hydrogel lors de la compensation.
Une étape importante lors de la fixation de la moelle épinière de souris, tel que rapporté par Cheung et al. 14 et Tomer et al. 15, est de garder toutes les solutions refroidir sur de la glace, ce qui empêche la polymérisation des produits chimiques. L'autre étape essentielle consiste à perfuser lentement la souris avec la solution d'hydrogel afin d'éviter un gonflement du tissu nerveux. Pour la solution d'hydrogel pour devenir un gel, le dégazage est nécessaire. Comme alternative à cela, nous avons utilisé parafilm pour couvrir le haut du tube et laissé aucune bulle d'air entre le hydsolution Roguel et parafilm. Cela fonctionnait très bien et la solution d'hydrogel est devenu un gel après quelques heures. Bien que quelques bulles ont été trouvées dans le gel, elles ne gênent pas les expériences suivantes, qui a été démontré par l'absence de bulles dans le tissu de la moelle épinière. La compensation est l'étape la plus critique, et nécessite une combinaison de réactifs. La solution d'échange, contenant un amino-alcool, élimine le lipide du tissu de la moelle épinière beaucoup plus rapide que la / solution d'acide borique à base de SDS de compensation utilisée dans le protocole initial CLARTE 16.
L'avantage de clarté et CUBIQUE par rapport aux techniques immunohistochimiques classiques est que le bloc de tissu entier peut être imagé sans sectionner le tissu, en conséquence, la continuité des fibres sérotoninergiques est conservée et il est possible de suivre la même fibre sur une longue distance dans le z-stack. Avec cet avantage, surdimensionnement peut être identifié en toute confiance avec les images 3D, unnd nouvelles conclusions peuvent donc être faites au sujet de la nature des voies sérotoninergiques. Le protocole décrit est un outil commode pour l'étude des systèmes de fibres, ainsi que des noyaux par un simple marquage du tissu avec des anticorps spécifiques. Cette technique est également un choix idéal pour interroger différents systèmes dans le même cerveau de souris en utilisant l'étiquetage double ou triple. Dans notre environnement de laboratoire, un microscope à fluorescence multi-photons est disponible avec une distance de travail d'environ 300 um. Cela limite notre image à un maximum de 600 um si les deux côtés du tissu sont analysés. Cependant, une feuille microscope à fluorescence lumière, peut l'image du cerveau de la souris entière et la moelle épinière par leur largeur, la longueur et la profondeur. L'autre avantage de cette technique est que les anticorps peuvent être élues, puis d'un autre anticorps ou d'anticorps différents appliqués à nouveau le même tissu. Cela réduit l'utilisation des animaux considérablement ainsi que les coûts associés à la préparation de nouveaux tissus du cerveaupour chaque expérience. Pour la même raison, cette technique peut être appliquée à d'autres tissus. Il y a déjà eu des études menées sur les poumons, les reins, le cœur, l' intestin, les tissus et la tumeur 26,27.
Il existe également des limitations de cette technique, par exemple, les noyaux du raphé dans le cerveau postérieur de souris contient de nombreux types de neurones, y compris les neurones GABAergiques. Bien que CLARITY et CUBIC permettront l'étude de la répartition des divers types de fibres raphespinal dans un cerveau de souris unique et la moelle épinière. Ces neurones, qui ne sont pas identifiés spécifiquement par leurs neurotransmetteurs ou des marqueurs protéiques, ne peuvent pas être identifiés dans ce cadre. Une alternative consiste à étiqueter les neurones spécifiques ou des systèmes de fibres avec des sondes d'acide nucléique comme dans l'hybridation in situ. Ceci est, d'autre part, limité par le système d'étiquetage et les filtres disponibles pour l'imagerie de fluorescence. Imagerie toutes les fibres raphespinal reste donc un défi.Si ces techniques ont été combinées avec une injection intracrânienne d'un traceur antérograde (comme Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), il pourrait être possible de voir les fibres sérotoninergiques, des fibres GABAergiques, et d'autres.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
References
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