Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Brug af CLARITY / CUBIC Teknik

Abstract

Lange faldende fibre til rygmarven er essentielle for bevægelse, smerteopfattelse, og andre adfærd. Den fiber opsigelse mønster i rygmarven af ​​de fleste af disse fibre systemer er ikke blevet grundigt undersøgt i alle arter. Serotonerge fibre, som rager til rygmarven, er blevet studeret i rotter og opossums på histologiske snit og deres funktionelle betydning er blevet udledt på grundlag af deres fiber opsigelse mønster i rygmarven. Med udviklingen af ​​CLARITY og CUBIC teknikker, er det muligt at undersøge denne fiber og dets fordeling i rygmarven, som sandsynligvis vil afsløre hidtil ukendte træk af serotonerge supraspinale veje. Her giver vi en detaljeret protokol for billeddannelse af serotonerge fibre i musen rygmarven ved hjælp af den kombinerede CLARITY og CUBIC teknikker. Metoden involverer perfusion af en mus med en hydrogel løsning, og afklaring af vævet med en kombinatioation at rydde reagenser. Rygmarven væv blev ryddet i knap to uger, og den efterfølgende immunfluorescent farvning mod serotonin blev afsluttet i mindre end ti dage. Med en multi-foton fluorescerende mikroskop, blev vævet scannet og et 3D-billede blev rekonstrueret ved hjælp Osirix software.

Protocol

Etik Statement: Alle procedurer, der involverer dyr fag følger retningslinjerne fra Animal Care og etiske komité (ACEC) ved University of New South Wales (den godkendte ACEC nummer er 14 / 94A).

1. Forberedelse af Transparent Mouse Spinal Cord

1. Udarbejdelse af iskold Hydrogel Solution
   1. Fremstilling af 16% paraformaldehyd-opløsning (PFA)
      1. Tilføj 16 g paraformaldehyd pulver i 70 ml forvarmet destilleret vand (50-55 ° C) og omrør på en opvarmet magnetisk omrører indtil paraformaldehyd opløses. Bemærk: Lad ikke den løsning, at varme over 55 ° C, og være opmærksom på, at paraformaldehyd er giftigt.
      2. Overfør paraformaldehydopløsning til en cylinder og tilsæt destilleret vand til 100 ml. Afkøl paraformaldehydopløsning anvendelse af en 4 ° C køleskab.
   2. Opløs 125 mg VA-044 initiator i 26,25 ml destilleret vand, og opløsningen afkøles i et 4° C køleskab.
   3. Cool 5 ml acrylamid-opløsning (40%), 1,25 ml Bis-opløsning (2%) (ADVARSEL: Bis og acrylamid løsninger er giftige, kan forårsage genetiske defekter eller cancer), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA opløsning, og VA-044 initiatoropløsning på is.
   4. Bland ovenstående løsninger på is.
      Bemærk: det samlede volumen er 50 ml.
2. Perfusion og Samling af Mouse Spinal Cord
   1. Bedøve en mus med en intraperitoneal injektion af ketamin (80 mg / kg) og xyzaline (5 mg / kg) fortyndet i 0,9% normal saltopløsning. Doseringen for muse kan være lavere end for rotter.
   2. På en egnet plast overflade i et stinkskab, fastsætte lemmer af musen væk fra kroppen (sticky tape er effektiv) når musen ikke reagerer på en knivspids til sin hud af foden.
   3. Skær musen huden over brystet og derefter knoglen brystet for at blotlægge hjertet med en saks.
   4. Anvendelse af en peristaltisk pumpe, med en 25 G nål fastgjort til the ende af røret, indsætte nålen ind i venstre ventrikel af hjertet, klippe højre atrium til at oprette en exit punkt for blod og derefter starte vask med 40 ml 0,9% normalt saltvand en hastighed på ca. 10 ml / min.
   5. Når det er færdigt, perfusion musen med 35 ml iskold hydrogel løsning.
      Bemærk: perfundere med en hastighed på 10 ml / min for at undgå kvældning af nervevævet.
   6. Incise huden over ryggen med en kniv og derefter fjerne musklerne ved siden af ​​hvirveldyr. Efter skæring vertebrale buer på den ene side og vende dem til den anden side, tage rygmarven ud af rygsøjlen med en fin saks.
3. Rydning af Mouse Spinal Cord
   1. Placer rygmarven i 15 ml hydrogel opløsning natten over ved 4 ° C.
   2. Fjern 10 ml af hydrogel opløsning og hæld resten af ​​opløsningen med rygmarven segmenter til et 5 ml rør. Fyld 5 ml rør med hydrogel opløsningen, indtil den er helt fuld.
   3. Stræk et lille stykke parafilm over toppen af ​​de 5 ml rør og derefter wrap parafilm omkring halsen af ​​røret. Bemærk: Sikre parafilmen kontakt med hydrogel løsning og der er ingen bobler mellem hydrogel opløsningen og parafilm.
   4. Sæt 5 ml rør i en 37   ° C ovn natten over. Observere hydrogel opløsning indtil det bliver en gel.
   5. Tag 5 ml rør ud af ovnen og fjerne gelen fra røret med en skruenøgle (såsom en skovlet 1 ml pipette tip). Fjern gelen fra rygmarven væv ved at stikke den grove væv til gelen og derefter tage det grove væv væk (gelen vil holde sig til det væv, og derfor vil blive fjernet af væv).
   6. Efter fjernelse af gelen fra rygmarven væv, vaske rygmarven 4 gange med 1 x PBS (pH 7,4) i 24 timer på et rysteapparat.
   7. Forbered CUBIC clearing opløsning ved at opløse 3,85 g urinstof og 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine i 5.38 ml destilleret vand.
      Bemærk: Der anvendes en varm omrører. Tilføj 2,31 g polyethylenglycol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 til opløsningen, når den er klar og køler ned til stuetemperatur.
      Bemærk: 10 g af disse tre kemikalier er for en mus.
   8. Skær musen rygmarven coronalt i 2-3 mm lange segmenter med et barberblad og sætte dem i 5 ml af ovennævnte CUBIC clearing løsning. Placer på et rysteapparat i ovnen ved 37   ° C i 3 dage.
   9. Tre dage senere ændre clearing løsning på en frisk. Bemærk: Ovenstående opløsning fremstilles før anvendelse.
   10. To til tre dage senere efter forfriskende CUBIC clearing løsning, kontrollere gennemsigtigheden af ​​vævet mod et papir med font 8 bogstaver. Hvis den er gennemsigtig, kan bogstaverne ses gennem blokerede væv. Fjern clearing og der tilsættes 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) at vaske vævet 4 gange dagligt (hver 6 timer).

1. Inkubér rygmarv segmenter i det primære antistof opløsning (anti-serotonin, rejst i kanin, fortyndet 1: 100 i PBST) i 3 dage på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
2. Fjern antistofopløsningen, og der tilsættes 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) at vaske rygmarv segmenter 4 gange om dagen (hver 6 time) i en 37 ° C varm ovn.
3. Fjern PBST-opløsning og tilsæt det sekundære antistof opløsning (594 konjugeret gede anti-kanin IgG, fortyndet 1: 100 i PBST) at inkubere vævet i 3 dage på en ryster i en 37 ° C varm ovn.
4. Fjern det sekundære antistof opløsning, og der tilsættes 4 ml PBST at vaske rygmarven segment 4 gange om dagen (hver 6. time) på et rysteapparat i et 37 ° C varm ovn. Den næste dag vævet er klar til billeddannelse.

3. Imaging

1. Fjern PBST-opløsning, og der tilsættes 4 ml af 85% glycerol til brydningsindekset af vævet selv.
2. Sætte et par dråber af 85% glycerol ved siden rygmarven væv og dækglasset den med en 22 x 50 mm ² dækglas glas.
   Bemærk: Orienteringen af ​​rygmarven afgør, hvordan billedet ser ud.
3. Sæt objektglasset på holderammen af ​​multi-foton fluorescens mikroskop og flytte vævet ind i lyset pathway.
4. Vælg Helium Neon laser linie 594 nm og justere intensiteten af ​​laseren til det optimale niveau ved at kontrollere lysstyrken på positivt signal i live-billedet.
5. Vælg scanningsområdet af rygmarven væv under anvendelse af 20X objektiv (i vand, NA 0,7) og forberede at skabe en z-stak, og dybden af ​​hvert trin indstilles til 3 um.
6. Scan vævet fra toppen til bunden af ​​z-stakken under 20X målsættive og derefter 63X objektiv (i olie, NA 1.4) (trin størrelse var 1 um), hhv. Rekonstruere 3D-videoer ved hjælp af en 3D-software ^28.

Representative Results

Dette afsnit viser resultater fra serotonin antistof farvning i den gennemsigtige mus rygmarven ved hjælp af en kombination af klarhed og CUBIC protokoller. Vi viser, at serotonerge fibre er til stede i alle lag af rygmarven med en overvægt i den ventrale del af det ventrale horn (figur 1, også se Video 1). Styringen væv afse positive fibre (resultat blev ikke vist). I den ventrale horn, tætpakkede serotonerge fibre er til stede i den ventromediale del af den ventrale horn og de ​​strækker sig mod lateral del af det ventrale horn (figur 2, også se Video 2). Nogle immunpositive fibre strækker sig også fra den ventrale horn mod dorsale horn eller den centrale kanal. Immunpositive fibre er til stede i alle lag af det dorsale horn, men der er et lille mellemrum mellem positive fibre i laget 2 og 4, især i den lateraledel af dorsale horn. Størstedelen af serotonerge fibre i den dorsale horn er af lille diameter og kun et lille antal af dem er af stor diameter (Video 1). I et vandret snit, blev tætpakkede serotonerge fibre i den ventrale horn observeret at bevæge sig langs den langsgående akse af rygmarven og danne en stor bundt fiber. Det mest interessante fund er, at dette store fiberbundt udsteder grene regelmæssigt langs længdeaksen, der er vinkelrette på fiberbundtet. Disse grene kautionering yderligere langs deres veje til den laterale del af den ventrale horn. Sammenlignet med disse grene, dem strækker sig mod midterlinjen er uregelmæssige og mindre (figur 2). Under 63X objektiv blev serotonerge fibre i den dorsale horn observeret at bevæge sig langs aksen af ​​rygmarven og ender ved forskellige punkter langs banen for tarmkanalen. De tykke fibre er sporadisk fordelt mellem den tynde f ibers (Figur 3, også se video 3).

Figur 1:. Serotonerge fibre i en koronal del af lumbale rygmarv ved 200X forstørrelse Venstre er den ventrale horn, højre er den dorsale horn, dorsal er den mediale del af rygmarven, og ventral er den laterale del af rygmarven. Skalaen bar er 100 um. Serotonerge fibre er til stede i alle lagene, især i den ventromediale del af den ventrale horn hvor fiberdensitet er høj. Disse fibre strække sig mod både den laterale del af den ventrale horn og den centrale kanal eller dorsale horn. Tætheden af ​​fibrene i andre lag er lav. Størstedelen af ​​serotonerge fibre er tynde. Kun et lille antal fibre er tykke og de ses i både den dorsale horn og det ventrale horn (> også se Video 1 (Højreklik for at downloade)).

Figur 2:. Serotonerge fibre i den ventrale del af den ventrale horn ved 200X forstørrelse Venstre og højre er de laterale sider af rygmarven, dorsal er rostralt del af rygmarven, og ventral er den caudale del af rygmarven. Skalaen bar er 100 um. Serotonerge fibre er vist på rejse langs længdeaksen af ​​rygmarven og pakket i midterdelen af ​​den ventrale horn, hvor de danner et tykt bundt fiber. Ud af denne gruppe, er nogle grene forlænget med regelmæssige mellemrum mod lateral del af den ventrale horn, mens andre, som strækker sig mod midterlinjen er uregelmæssige og kortere. Disse fibre opsige på mange punkter langs stien til tarmkanalen ( se også video 2(Højreklik for at downloade)).

Figur 3: Serotonerge fibre i den dorsale horn under på 630x forstørrelse Venstre er den laterale del af rygmarven, højre er den mediale del af rygmarven, dorsal og ventral henvise til den dorsale og ventrale del af dorsale horn, hhv. . Skalaen bar er 7 um. Serotonerge fibre rejser langs længdeaksen af ​​rygmarven og ender langs banen af ​​tarmkanalen. Disse fibre er hovedsagelig af lille diameter med et lille antal af tykke fibre blandet. Disse fibre sjældent overlapper hinanden ( se også video 3 (Højreklik for at downloade) ).

Discussion

Den beskrevne protokol viser hvordan billedet serotonerge fibre i musen rygmarven med den kombinerede CLARITY og CUBIC teknikker. Den indfører en hurtigere clearingen sammenlignet med den passive clearing protokol udviklet af Cheung et al. ¹⁴ og Tomer et al. ¹⁵ og tillader rygmarven væv, der skal godt støttet af hydrogelen under clearing.

Et vigtigt trin under fiksering af musen rygmarven, som rapporteret af Cheung et al. ¹⁴ og Tomer et al. ^15, er at holde alle løsningerne køle på is, som forhindrer polymerisation af kemikalier. Den anden kritiske trin er at perfundere musen langsomt med hydrogel løsning for at undgå kvældning af nervevævet. For hydrogel løsning til at blive en gel, er afgasning påkrævet. Som et alternativ til dette, brugte vi parafilm at dække toppen af ​​røret og efterlod ingen luftbobler mellem hydRogel opløsningen, og parafilm. Dette arbejdede meget godt og hydrogel løsning blev en gel efter et par timer. Selv blev fundet nogle bobler i gelen, de ikke forstyrrer de følgende eksperimenter, som blev demonstreret ved fravær af bobler i rygmarven væv. Clearing er den mest kritiske trin, og kræver en kombination af reagenser. Clearing opløsning indeholdende amino-alkohol, fjerner lipidet af rygmarven væv meget hurtigere end SDS / borsyre baseret clearing løsning anvendt i den oprindelige CLARITY protokol ^16.

Fordelen klarhed og CUBIC forhold til traditionelle immunhistokemiske teknikker er, at hele vævsblokken kan afbildes uden sektionering vævet, som et resultat, er kontinuiteten af ​​de serotonerge fibre bevares, og det er muligt at følge den samme fiber til en lang afstand i z-stakken. Med denne fordel, kan sikkerhedsstillelse være trygt identificeret med 3D-billeder, ennd nye konklusioner kan derfor stilles om karakteren af ​​serotonerge veje. Den beskrevne protokol er et praktisk værktøj til undersøgelse af fibersystemer samt kerner ved blot mærkning vævet med specifikke antistoffer. Denne teknik er også et ideelt valg til afhøre forskellige systemer i den samme mus hjerne ved hjælp af dobbelt eller tredobbelt mærkning. I vores laboratorium indstilling, en multi-foton fluorescens mikroskop var tilgængelig med en arbejdsafstand på ca. 300 um. Dette begrænser vores image til maksimalt 600 um, hvis begge sider af vævet scannes. Men en lyspladen fluorescensmikroskop, kan billede hele muse hjerne og rygmarv gennem deres fulde bredde, længde og dybde. Den anden fordel ved denne teknik er, at antistofferne kan elueres og derefter en anden anderledes antistof eller antistoffer anvendes igen til samme væv. Dette reducerer brugen dyr betydeligt samt de omkostninger, der er forbundet med at forberede nye hjernevævfor hvert forsøg. Af samme grund kan denne teknik anvendes på andre væv. Der har allerede været undersøgelser på lunger, nyrer, hjerte, tarm, og tumorvæv ^26,27.

Der er også begrænsninger på denne teknik, for eksempel, raphe kerner i muse baghjerne indeholder mange typer af neuroner, herunder GABAerge neuroner. Selvom CLARITY og CUBIC vil muliggøre studiet af fordelingen af ​​de forskellige typer af raphespinal fibre i en enkelt mus hjernen og rygmarven. Disse neuroner, som ikke er identificeret specifikt ved deres neurotransmittere eller proteinmarkører, kan ikke identificeres i denne indstilling. Et alternativ er at mærke de specifikke neuroner eller fiber systemer med nucleinsyreprober såsom i in situ hybridisering. Dette er på den anden side begrænset af systemets mærkning og de tilgængelige filtre til fluorescerende billeddannelse. Imaging alle raphespinal fibre er derfor fortsat en udfordring.Hvis disse teknikker blev kombineret med en intrakraniel injektion af en anterograd sporstof (såsom Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), kan det være muligt at se serotonerge fibre, GABAerge fibre og andre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/