Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Abstract

fibras descendentes longos para a medula espinhal são essenciais para a locomoção, a percepção da dor, e outros comportamentos. O padrão de terminação da fibra na medula espinal da maioria destes sistemas de fibra não foram cuidadosamente investigados em qualquer espécie. fibras serotoninérgicos, que se projectam para a espinal-medula, foram estudados em ratos e em secções histológicas marsupiais e o seu significado funcional foi deduzida com base no seu padrão de terminação da fibra na medula espinal. Com o desenvolvimento de clareza e técnicas cúbicos, é possível investigar este sistema de fibra e a sua distribuição na medula espinal, a qual é susceptível de revelar características anteriormente desconhecidos de vias supraespinhais serotoninérgicos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para geração de imagens das fibras serotoninérgicos na medula espinhal de rato usando o CLAREZA combinados e técnicas cúbicos. O método envolve a perfusão de um rato com uma solução de hidrogel e clarificação do tecido com uma combinção de limpar reagentes. tecido da medula espinhal foi liberado em pouco menos de duas semanas, e a coloração de imunofluorescência subsequente contra a serotonina foi concluída em menos de dez dias. Com um microscópio de fluorescência multi-fotão, o tecido foi digitalizado e uma imagem 3D foi reconstruído usando software Osirix.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos envolvendo indivíduos animais siga as orientações do Comitê de Cuidados com Animais e Ética (ACEC) da Universidade de New South Wales (o número ACEC aprovado é de 14 / 94A).

1. Preparação da Transparente cabo do rato Spinal

1. Preparação de Ice Cold Hidrogel Solution
   1. Preparação de solução de paraformaldeído a 16% (PFA)
      1. Adicionar 16 g de paraformaldeído em pó em 70 ml de pré-aquecida de água destilada (50-55 ° C) e agita-se num agitador magnético até aquecida paraformaldeído é dissolvido. Nota: Não permitir que a solução para aquecer acima de 55 ° C e estar ciente de que paraformaldeído é tóxico.
      2. Transferir a solução de paraformaldeído a um cilindro e adicionar água destilada até 100 ml. Arrefece-se a solução de paraformaldeído a 4 utilizando um refrigerador ° C.
   2. Dissolve-se 125 mg de VA-044 iniciador em 26.25 ml de água destilada e arrefece-se a solução em um 4° C frigorífico.
   3. Arrefecer 5 ml de solução de acrilamida (40%), 1,25 ml de solução de bis (2%) (CUIDADO: Bis e soluções de acrilamida são tóxicos, podem causar defeitos genéticos ou cancro), 5 ml de PBS 10X, ml de 16% solução de 12,5 PFA, eo solução de iniciador VA-044 em gelo.
   4. Misturar as soluções acima em gelo.
      Nota: O volume total é 50 ml.
2. Perfusão e Colecção do Cordão do rato Spinal
   1. Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de cetamina (80 mg / kg) e xyzaline (5 mg / kg) diluído em 0,9% de solução salina normal. A dosagem para rato pode ser menor do que para os ratos.
   2. Em uma superfície de plástico adequado em um exaustor, corrigir os membros do mouse para longe do corpo (fita adesiva é eficaz) uma vez que o mouse não responder a uma pitada a sua pele do pé.
   3. Cortar a pele do rato sobre o peito e depois do peito osso para expor o coração com uma tesoura.
   4. Usando uma bomba peristáltica, com uma agulha de 25 G ligada a the das extremidades do tubo, inserir a agulha no ventrículo esquerdo do coração, cortar o átrio direito para criar um ponto de saída para o sangue e, em seguida, iniciar a lavagem com 40 ml de solução salina normal a 0,9% de uma taxa de aproximadamente 10 ml / min.
   5. Quando completo, perfundir o mouse com 35 solução de hidrogel frio ml de gelo.
      Nota: perfundir a uma velocidade de 10 ml / min para evitar inchaço do tecido nervoso.
   6. Faça uma incisão na pele sobre a parte de trás com uma lâmina e em seguida, remover os músculos ao lado da vertebrados. Após o corte dos arcos vertebrais de um lado e lançando-os para o outro lado, levar a medula espinal da coluna vertebral com uma tesoura fina.
3. Limpando o cabo do rato Spinal
   1. Coloque a espinal medula em 15 ml de solução de hidrogel durante a noite a 4 ° C.
   2. Retirar 10 mL da solução de hidrogel e despeje o resto da solução com os segmentos da medula espinhal de um tubo de 5 ml. Encher o tubo de 5 ml com a solução de hidrogel até que esteja completamente cheia.
   3. Estende um pequeno pedaço de parafilme sobre a parte superior do tubo de 5 ml e, em seguida, enrolar em torno do pescoço parafilme do tubo. Nota: Certifique-se os contactos parafilme a solução de hidrogel e não há bolhas entre a solução de hidrogel e o parafilme.
   4. Colocar o tubo de 5 ml de uma 37   ° C forno durante a noite. Observe a solução hidrogel até que se torna um gel.
   5. Aqui o tubo de 5 ml de sair do forno e remover o gel a partir do tubo com uma chave de fendas (por exemplo, uma ponta de pipeta de 1 ml pá). Remover o gel do tecido da medula espinhal furando o tecido grosseiro ao gel e em seguida, tomar o tecido grosseiro de distância (o gel vai ficar com o tecido e, portanto, serão removidos pelo tecido).
   6. Após a remoção do gel a partir do tecido da medula espinal, lava-se a medula espinal 4 vezes com 1x de PBS (pH 7,4) durante 24 horas num agitador.
   7. Preparar a solução de compensação CUBIC por dissolução de 3,85 g de ureia e 3,85 g de N, N, N ', N'-tetraquis (2-hidroxipropil) ethylenediamine em 5,38 ml de água destilada.
      Nota: Um agitador quente é usado. Adicionar 2,31 g de polietileno-glicol mono-p-isooctylphenyl éter / Triton X-100 à solução, uma vez que é clara e arrefece até à temperatura ambiente.
      Nota: 10 g destes três produtos químicos são para um rato.
   8. Cortar a medula espinhal de rato coronariamente em longos segmentos de 2-3 mm com uma lâmina de barbear e colocá-los em 5 ml da solução de limpeza CUBIC acima. Colocar num agitador no forno a 37   ° C durante 3 dias.
   9. Três dias mais tarde, mudar a solução de limpeza para uma fresca. Nota: a solução acima é preparada antes da utilização.
   10. Dois a três dias mais tarde depois de atualizar a solução de compensação cúbicos, verificar a transparência do tecido contra um papel com tipo de letra 8 letras. Se é transparente, as letras podem ser vistas através do tecido limpo. Remover a solução de compensação e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar o tecido 4 vezes por dia (a cada 6 horas).

1. Incubar os segmentos da medula espinhal na solução de anticorpo primário (anti-serotonina, produzidos em coelho, diluído a 1: 100 em PBST) durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
2. Remover a solução de anticorpo e adicionar 4 ml de PBST (0,1% de Triton-X100) para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num forno de 37 ° C.
3. Remover a solução de PBST, e adicionar a solução de anticorpo secundário (594 anti-IgG de coelho de cabra conjugada, diluídos 1: 100 em PBST) a incubar o tecido durante 3 dias num agitador numa estufa de 37 ° C.
4. Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 4 ml de PBST para lavar os segmentos da medula espinhal 4 vezes por dia (a cada 6 horas) num agitador num forno de 37 ° C. No dia seguinte, o tecido é preparado para imagiologia.

3. Imagem

1. Remover a solução de PBST e adicionar 4 ml de 85% de glicerol para tornar o índice de refracção do tecido mesmo.
2. Coloque algumas gotas de 85% de glicerol ao lado do tecido da medula espinhal e que lamela de vidro com uma lamela de 22 x 50 mm ^2.
   Nota: A orientação da medula espinhal decide como a imagem se parece.
3. Colocar a lâmina de vidro sobre a armação de retenção do microscópio fluorescente multi-fotão e mover o tecido para a via de luz.
4. Escolha do Hélio Néon linha de laser 594 nm e ajustar a intensidade do laser para o nível óptimo, verificando o brilho do sinal positivo na imagem real.
5. Seleccione a área de leitura do tecido da medula espinal utilizando a objectiva de 20x (em água, NA 0,7) e preparam-se para criar um z-pilha, e a profundidade de cada degrau definir a 3 um.
6. Digitalizar o tecido a partir do topo para o fundo da pilha-Z sob o objec 20Xtiva e, em seguida, objectiva 63X (em óleo, NA 1.4) (tamanho do passo foi de 1? M), respectivamente. Reconstruir vídeos em 3D usando um software 3D ^28.

Representative Results

Esta secção mostra os resultados de coloração de anticorpos de serotonina na medula espinal do rato transparente usando uma combinação de a clareza e protocolos cúbico. Mostramos que as fibras serotoninérgicas estão presentes em todas as lâminas da medula espinhal com predominância na porção ventral do corno ventral (Figura 1, também vemos Video 1). O tecido de controlo não têm fibras positivas (resultado não foi apresentado). No corno ventral, fibras serotoninérgicas densamente estão presentes na porção ventromedial do corno anterior e se estendem para a parte lateral do corno anterior (Figura 2, também veja vídeo 2). Algumas fibras imunopositivas também se estendem a partir do corno anterior para o corno dorsal ou para o canal central. imunopositivas fibras estão presentes em todas as lâminas do corno dorsal, mas há uma pequena diferença entre as fibras positivas na lâmina 2 e 4, especialmente nas lateraisparte do corno dorsal. A maioria das fibras serotonérgicos no corno dorsal são de diâmetro reduzido e apenas um pequeno número delas são de grande diâmetro (de Vídeo 1). Em uma secção horizontal, fibras serotoninérgicos densamente empacotados no corno ventral foram observadas a viajar ao longo do eixo longitudinal da medula espinhal e formam uma grande feixe de fibras. A descoberta mais interessante é que este grande feixe de fibras de ramificações emite regularmente ao longo do eixo longitudinal, os quais são perpendiculares ao feixe de fibras. Estes ramos hipotecar ainda mais ao longo de seus caminhos para a parte lateral do corno anterior. Em comparação com estes ramos, os que se prolongam no sentido da linha média são irregulares e menores (Figura 2). No âmbito do objectivo 63X, as fibras serotonérgicos no corno dorsal foram observados a viajar ao longo do eixo da medula espinhal e terminam em vários pontos ao longo do caminho do trato. As fibras grossas são esporadicamente distribuídos entre os f fina IBERS (Figura 3, também ver vídeo 3).

Figura 1:. Fibras de serotonina num corte coronal da medula lombar no 200X Esquerda é o corno anterior, certo é o corno dorsal, dorsal é a parte medial da medula espinhal, e ventral é a parte lateral da medula espinhal. A barra de escala é de 100 mm. fibras serotoninérgicos estão presentes em todas as lâminas, especialmente na parte ventromedial do corno anterior, onde a densidade das fibras é alta. Estas fibras prolongar-se para tanto a parte lateral do corno anterior e o canal ou dorsal chifre central. A densidade de fibras na outra lâminas é baixo. A maioria das fibras serotoninérgicas são finas. Apenas um pequeno número de fibras são grossas e eles são vistos tanto no corno dorsal e corno anterior (> ver também Video 1 (Clique direito a download)).

Figura 2:. Fibras serotonérgica a porção ventral do corno ventral a uma ampliação de 200X esquerda e direita estão os lados laterais da medula espinal, dorsal, é a porção rostral da medula espinal, e ventral é a parte caudal da medula espinhal. A barra de escala é de 100 mm. fibras serotoninérgicos são mostrados viajando ao longo do eixo longitudinal da medula espinhal e embalado na porção medial do corno ventral onde formam um feixe de fibras de espessura. Fora deste pacote, alguns ramos são estendidos em intervalos regulares para a parte lateral do corno anterior, enquanto outros que se estendem em direção à linha média são irregulares e mais curtos. Essas fibras terminam em muitos pontos ao longo do caminho do trato ( ver também Video 2(Clique direito a download)).

Figura 3: fibras Serotoninérgicos no corno dorsal sob a 630X ampliação Esquerda é a parte lateral da medula espinhal, certo é a parte medial da medula espinhal, dorsal e ventral referem-se à dorsal e parte ventral do corno dorsal, respectivamente. . A barra de escala é de 7 mm. fibras serotoninérgicos viaje ao longo do eixo longitudinal da medula espinhal e terminam ao longo do caminho do trato. Estas fibras são, principalmente, de pequeno diâmetro, com um pequeno número de fibras espessas de permeio. Estas fibras raramente se sobrepõem uns com os outros ( ver também Video 3 (Clique direito a download) ).

Discussion

O protocolo descrito mostra como fibras imagem serotoninérgicos na medula espinhal de rato com a clareza combinadas e técnicas cúbico. Ele apresenta um processo de limpeza mais rápido em comparação com o protocolo de compensação passiva desenvolvido por Cheung et al. ¹⁴ e Tomer et ai. ¹⁵ e permite que o tecido da medula espinal a ser bem suportado pelo hidrogel durante a limpeza.

Um passo importante durante a fixação da medula espinhal de rato, como relatado por Cheung et al. ¹⁴ e Tomer et ai. ^15, é a de manter todas as soluções arrefecer em gelo, o que impede a polimerização dos produtos químicos. O outro passo crucial é o rato para perfundir-se lentamente com a solução de hidrogel, a fim de evitar o inchaço do tecido nervoso. Para a solução de hidrogel a tornar-se um gel, de desgaseificação é necessária. Como uma alternativa a isso, utilizou-se parafilme a cobrir a parte superior do tubo e deixaram as bolhas de ar entre as empresolução Rogel eo parafilme. Este sistema funcionou muito bem e a solução tornou-se um gel de hidrogel depois de algumas horas. Embora algumas bolhas foram encontrados no gel, que não interferiu com as experiências seguintes, o que foi demonstrado pela ausência de bolhas no tecido da medula espinal. Clearing é o passo mais crítico, e requer uma combinação de reagentes. A solução de limpeza, que contém amino-álcool, remove o lípido do tecido da medula espinhal muito mais rápido do que o / solução de compensação de SDS bórico base de ácido utilizado no protocolo original de ¹⁶ Clareza.

A vantagem de clareza e cúbicas em relação às técnicas de imuno-histoquímica tradicionais é que a totalidade do bloco de tecido podem ser visualizados sem a secção do tecido, como um resultado, a continuidade das fibras serotoninérgicos é retida, e é possível seguir a mesma fibra por uma longa distância dentro do Z-pilha. Com esta vantagem, a colateralização pode ser confiantemente identificados com as imagens 3D, umND novos conclusões podem, portanto, ser feita acerca da natureza das vias serotoninérgicos. O protocolo descrito é uma ferramenta conveniente para investigação de sistemas de fibras, bem como os núcleos por simplesmente rotular o tecido com anticorpos específicos. Esta técnica é também uma escolha ideal para interrogar sistemas diferentes no mesmo cérebro de camundongo usando marcação dupla ou tripla. No nosso ambiente de laboratório, um multi-fotão microscópio fluorescente estava disponível com uma distância de trabalho de aproximadamente 300 um. Isto limita a imagem para um máximo de 600 um, se ambos os lados do tecido são digitalizados. No entanto, uma folha de microscópio de fluorescência de luz, pode imagem de todo o cérebro do rato e da medula espinhal através da sua largura, comprimento e profundidade. A outra vantagem desta técnica é que os anticorpos podem ser eluída e, em seguida, um outro anticorpo ou anticorpos diferentes aplicada novamente para o mesmo tecido. Isso reduz o uso de animais consideravelmente, bem como os custos associados com a preparação de um novo tecido cerebralpara cada experimento. Pela mesma razão, esta técnica pode ser aplicada a outros tecidos. Houve já estudos realizados sobre os pulmões, rins, coração, intestino e tecido tumoral ^26,27.

Também existem limitações para esta técnica, por exemplo, os núcleos da rafe na parte posterior do cérebro do rato contém muitos tipos de neurônios, incluindo neurônios GABAérgicos. Embora Clareza e cúbicas permitirá o estudo da distribuição dos diversos tipos de fibras raphespinal num cérebro do rato e da medula espinhal. Esses neurônios, que não são identificados especificamente pelos seus neurotransmissores ou marcadores de proteínas, não pode ser identificado neste cenário. Uma alternativa é a rotular os neurónios específicos ou sistemas de fibras com sondas de ácidos nucleicos, tais como na hibridação in situ. Este é, por outro lado, limitada por o sistema de rotulagem e os filtros disponíveis para imagiologia fluorescente. Imagiologia todas as fibras raphespinal, portanto, permanece um desafio.Se estas técnicas foram combinadas com uma injecção intracraniana de um traçador anterógrada (tais como Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), pode ser possível ver as fibras, fibras GABAérgicas serotonérgicos, e outros.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/