Abstract
الألياف الهابطة طويلة إلى الحبل الشوكي ضرورية للتحرك، الإحساس بالألم، وغيرها من السلوكيات. نمط إنهاء الألياف في الحبل الشوكي لغالبية أنظمة الألياف هذه لم يتم التحقيق بدقة في أي نوع من الأنواع. الألياف هرمون السيروتونين، التي المشروع إلى الحبل الشوكي، وقد درست في الفئران وopossums على أقسام النسيجية وتم الأهمية الوظيفية استنتاجها على أساس نمط إنهاء الألياف في الحبل الشوكي. مع تطور وضوح وتقنيات مكعب، فمن الممكن للتحقيق في هذا النظام الألياف وتوزيعه في الحبل الشوكي، والتي من المرجح أن تكشف عن ميزات لم تكن معروفة سابقا من مسارات فوق الشوك هرمون السيروتونين. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتصوير الألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس باستخدام وضوح جنبا إلى جنب وتقنيات مكعب. الأسلوب ينطوي على نضح من الفأر مع حل هيدروجيل وتوضيح الأنسجة مع تنافسيةأوجه تطهير الكواشف. تم تطهير أنسجة الحبل الشوكي في أقل من أسبوعين، واكتمل تلوين مناعي لاحقا ضد السيروتونين في أقل من عشرة أيام. مع المجهر الفلورسنت متعددة الفوتون، وتفحص الأنسجة وإعادة بنائها صورة 3D باستخدام برنامج سيريكس.
Protocol
أخلاقيات الإعلان: جميع الإجراءات التي تجرى على الحيوانات يتبع المبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاق (ACEC) في جامعة نيو ساوث ويلز (عدد ACEC وافق هو 14 / 94A).
1. إعداد شفاف الحبل الشوكي ماوس
- إعداد الجليد الباردة هيدروجيل الحل
- إعداد 16٪ من محلول بارافورمالدهيد (PFA)
- إضافة 16 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى 70 مل قبل تحسنت الماء المقطر (50-55 درجة مئوية) ويقلب على محرك مغناطيسي ساخنة حتى يذوب امتصاص العرق. ملاحظة: لا تسمح للحل للحرارة أكثر من 55 درجة مئوية، وتكون على علم بأن امتصاص العرق هي سامة.
- نقل الحل لامتصاص العرق على اسطوانة وإضافة الماء المقطر إلى 100 مل. تبريد حل لامتصاص العرق باستخدام 4 درجات مئوية الثلاجة.
- حل 125 ملغ VA-044 البادئ في 26.25 مل من الماء المقطر وتبريد الحل في 4° C الثلاجة.
- بارد 5 مل من محلول مادة الأكريلاميد (40٪)، 1.25 مل مكرر حل (2٪) (تنبيه: مكرر والحلول الأكريلاميد سامة، قد تسبب تشوهات وراثية أو السرطان)، 5 مل 10X برنامج تلفزيوني، 12.5 مل 16٪ محلول PFA، و VA-044 حل البادئ على الجليد.
- مزيج من الحلول السابقة على الجليد.
ملاحظة: الحجم الكلي هو 50 مل.
- إعداد 16٪ من محلول بارافورمالدهيد (PFA)
- نضح ومجموعة من الحبل الشوكي الماوس
- تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) وxyzaline (5 ملغ / كلغ) المخفف في محلول ملحي 0.9٪. الجرعة فأرة الحاسوب يمكن أن يكون أقل من ذلك بالنسبة للفئران.
- على سطح البلاستيك مناسب في غطاء الدخان، وتحديد أطرافه من الفأرة بعيدا عن الجسم (شريط لاصق غير فعال) مرة واحدة لا يستجيب الماوس لقرصة إلى جلدها القدم.
- قطع الجلد الماوس فوق الصدر ثم الصدر العظام لفضح القلب مع مقص.
- باستخدام مضخة تحوي، مع إبرة 25 G المرفقة إلى thه نهاية الأنبوب، إدراج الإبرة في البطين الأيسر من القلب، قص الأذين الأيمن لإنشاء نقطة خروج الدم ثم تبدأ الغسيل مع محلول ملحي 40 مل 0.9٪ بمعدل ما يقرب من 10 مل / دقيقة.
- عند اكتماله، يروي الماوس مع 35 مل الجليد حل هيدروجيل البارد.
ملاحظة: يروي بسرعة 10 مل / دقيقة لتجنب تورم في الأنسجة العصبية. - شق الجلد على الظهر مع شفرة ثم قم بإزالة العضلات بجانب الفقاريات. بعد قطع أقواس العمود الفقري على جانب واحد والتقليب منهم إلى الجانب الآخر، واتخاذ الحبل الشوكي من العمود الفقري مع مقص غرامة.
- تطهير الحبل الشوكي ماوس
- وضع الحبل الشوكي في 15 مل من محلول هيدروجيل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة 10 مل من محلول هيدروجيل وتصب بقية الحل مع شرائح الحبل الشوكي إلى أنبوب 5 مل. ملء أنبوب 5 مل مع حل هيدروجيل حتى يكون كامل تماما.
- تمتد قطعة صغيرة من بارافيلم على الجزء العلوي من أنبوب 5 مل ثم لف بارافيلم حول عنق الأنبوب. ملاحظة: تأكد من الاتصالات بارافيلم الحل هيدروجيل وعدم وجود فقاعات بين حل هيدروجيل وبارافيلم.
- وضع أنبوب 5 مل في 37 ° C فرن بين عشية وضحاها. مراقبة الحل هيدروجيل حتى يصبح مادة هلامية.
- خذ أنبوب 5 مل من الفرن وإزالة هلام من أنبوب مع مفتاح البراغي (مثل جرف 1 مل ماصة). إزالة هلام من نسيج الحبل الشوكي عن طريق الالتزام الأنسجة الخشنة إلى هلام ثم أخذ الأنسجة الخشنة بعيدا (فإن جل التمسك الأنسجة، وبالتالي سوف يتم التوقف عن الأنسجة).
- بعد إزالة هلام من نسيج الحبل الشوكي، وغسل النخاع الشوكي 4 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 24 ساعة على شاكر.
- إعداد الحل المقاصة مكعب بحلول بحل 3.85 غرام اليوريا و3.85 ز ن، ن، ن '، N' tetrakis (2-هيدروكسي) ethylenediam المعهد الوطني للإحصاء في 5.38 مل من الماء المقطر.
ملاحظة: يتم استخدام النمام الساخن. إضافة 2.31 ز البولي ايثيلين جلايكول الأحادي ف isooctylphenyl الأثير / تريتون X-100 إلى الحل مرة واحدة فمن الواضح ويبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: 10 غرام من هذه المواد الكيميائية الثلاثة هم للماوس واحدة. - قطع الحبل الشوكي الماوس coronally الى شرائح 2-3 ملم طويلة مع شفرة الحلاقة ووضعها في 5 مل من محلول تطهير CUBIC أعلاه. وضع على شاكر في الفرن على 37 ° مئوية لمدة 3 أيام.
- بعد ثلاثة أيام، وتغيير الحل المقاصة إلى واحدة جديدة. ملاحظة: يتم تحضير المحلول المذكور أعلاه قبل استخدامها.
- في وقت لاحق يومين إلى ثلاثة أيام بعد منعش الحل المقاصة مكعب، تحقق الشفافية في الأنسجة ضد ورقة مع الخط 8 حروف. إذا كانت شفافة، يمكن أن ينظر إلى الرسائل عبر النسيج مسح. إزالة حل المقاصة وإضافة 4 مل من PBST (0.1٪ تريتون-X100) لغسل الأنسجة 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات).
معشوقة = "jove_title"> 2. المناعي تلطيخ
- احتضان شرائح الحبل الشوكي في حل الأجسام المضادة الأولية (مكافحة السيروتونين، التي أثيرت في الأرنب، المخفف 1: 100 في PBST) لمدة 3 أيام على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- إزالة حل الأجسام المضادة وإضافة 4 مل من PBST (0.1٪ تريتون-X100) لغسل شرائح الحبل الشوكي 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات) في 37 درجة مئوية الفرن.
- إزالة حل PBST وإضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية (594 الماعز مترافق المضادة للأرنب مفتش، المخفف 1: 100 في PBST) لاحتضان النسيج لمدة 3 أيام على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن.
- إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وإضافة 4 مل من PBST لغسل شرائح الحبل الشوكي 4 مرات يوميا (كل 6 ساعات) على شاكر في 37 درجة مئوية الفرن. في اليوم التالي الأنسجة جاهزة للتصوير.
3. التصوير
- إزالة حل PBST وإضافة 4 مل من 85٪ الجلسرين لجعل معامل الانكسار من الأنسجة حتى.
- وضع بضع قطرات من الجلسرين 85٪ بجانب نسيج الحبل الشوكي وساترة مع ساترة زجاج 22 × 50 مم 2.
ملاحظة: اتجاه الحبل الشوكي يقرر كيف تبدو صورة مثل. - وضع شريحة زجاجية على الإطار عقد المجهر الفلورسنت متعددة الفوتون ونقل الأنسجة في مسار الضوء.
- اختيار هيليوم نيون خط ليزر 594 نانومتر، وضبط شدة الليزر إلى المستوى الأمثل عن طريق التحقق من سطوع إشارة إيجابية في صورة حية.
- حدد منطقة المسح الضوئي للأنسجة الحبل الشوكي باستخدام الهدف 20X (في الماء، NA 0.7) والاستعداد لإنشاء ض المكدس، وعمق كل خطوة لتعيين 3 ميكرون.
- فحص الأنسجة من أعلى إلى أسفل ض المكدس تحت objec 20X(كان حجم الخطوة 1 ميكرون) TIVE ثم الهدف 63X (في مجال النفط، NA 1.4)، على التوالي. إعادة أشرطة الفيديو 3D باستخدام برنامج 3D 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعرض هذا القسم النتائج من تلطيخ السيروتونين الأجسام المضادة في الحبل الشوكي الماوس شفافة باستخدام مزيج من وضوح والبروتوكولات مكعب. وتبين لنا أن الألياف هرمون السيروتونين موجودة في كل صفيحة من الحبل الشوكي مع غلبة في الجزء البطني من القرن البطني (الشكل 1، وانظر أيضا فيديو 1). لم الأنسجة السيطرة ليس لديهم انسجة إيجابية (لم تظهر نتيجة). في القرن البطني، والألياف هرمون السيروتونين المكتظ موجودة في جزء بطني إنسي من القرن البطني وأنها تمتد نحو الجزء الجانبي من القرن البطني (الشكل 2، وانظر أيضا فيديو 2). تمتد بعض الألياف immunopositive أيضا من القرن البطني نحو القرن الظهري أو القناة المركزية. الألياف Immunopositive موجودة في كل صفيحة من القرن الظهري ولكن هناك فجوة صغيرة بين الألياف إيجابية في الصفيحة 2 و 4، وخصوصا في الوحشيجزء من القرن الظهري. غالبية الألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري ذات القطر الصغير وفقط عدد قليل منهم من القطر الكبير (فيديو 1). في القسم الأفقي، لوحظت الألياف هرمون السيروتونين المزدحمة بالسكان في القرن البطني للسفر على طول المحور الطولي للحبل الشوكي وتشكيل حزمة من الألياف كبيرة. هذا الاكتشاف الأكثر إثارة للاهتمام هو أن هذه الألياف حزمة كبيرة تصدر فروع بانتظام على طول المحور الطولي، والتي هي عمودي على حزمة من الألياف. هذه الفروع برهن كذلك على طول مساراتها إلى الجزء الجانبي من القرن البطني. مقارنة مع هذه الفروع، ومنها تمتد نحو خط الوسط وعدم انتظام وأصغر (الشكل 2). في إطار الهدف 63X، لوحظت الألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري للسفر على طول محور من الحبل الشوكي وتنتهي في نقاط مختلفة على طول مسار القناة. يتم توزيع ألياف سميكة بشكل متقطع بين و رقيقة ibers (الشكل 3، وانظر أيضا الفيديو 3).
الشكل 1: الألياف هرمون السيروتونين في قسم الاكليلية من الحبل القطني في 200X التكبير اليسار هو القرن البطني، والحق هو القرن الظهري، الظهرية هو الجزء الأنسي من النخاع الشوكي، وبطني هو الجزء الجانبي من الحبل الشوكي. شريط المقياس هو 100 ميكرون. الألياف هرمون السيروتونين موجودة في كل صفيحة، وخصوصا في الجزء بطني إنسي من القرن البطني حيث كثافة ألياف عالية. هذه الألياف تمتد نحو كل من الجزء الجانبي من القرن البطني والقناة أو القرن الظهري المركزي. كثافة الألياف في صفيحة أخرى منخفضة. غالبية الألياف هرمون السيروتونين هي رقيقة. فقط عدد قليل من الألياف سميكة وينظر إليهم في كل من القرن الظهري والقرن البطني (> انظر أيضا فيديو 1 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل)).
الشكل 2: الألياف هرمون السيروتونين في الجزء البطني من القرن البطني في 200X التكبير اليسار واليمين هي الاطراف الجانبية للنخاع الشوكي، الظهرية هو جزء منقاري من الحبل الشوكي، وبطني هو الجزء الذيلية من الحبل الشوكي. شريط المقياس هو 100 ميكرون. وتظهر الألياف هرمون السيروتونين السفر على طول المحور الطولي من الحبل الشوكي ومعبأة في الجزء الأنسي من القرن البطني حيث أنها تشكل حزمة من الألياف الكثيفة. من هذه الحزمة، يتم توسيع بعض الفروع على فترات منتظمة نحو الجزء الجانبي من القرن البطني، في حين أن البعض الآخر أن يمتد إلى خط الوسط وعدم انتظام وأقصر. هذه الألياف تنتهي في العديد من النقاط على طول مسار القناة ( انظر أيضا فيديو 2(انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل)).
الشكل (3): ألياف هرمون السيروتونين في القرن الظهري تحت في 630X التكبير اليسار هو الجزء الجانبي للحبل الشوكي، هو حق الجزء الأنسي من النخاع الشوكي، ظهري وبطني الرجوع إلى ظهري وجزء بطني من القرن الظهري، على التوالي. . شريط المقياس هو 7 ميكرون. الألياف هرمون السيروتونين يسافرون على طول المحور الطولي للحبل الشوكي وإنهاء طول مسار القناة. هذه الألياف بشكل رئيسي بقطر صغير مع عدد قليل من الألياف الكثيفة المختلطة. هذه الألياف نادرا ما تتداخل مع بعضها البعض ( انظر أيضا فيديو 3 (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصف بروتوكول يبين كيفية الألياف صورة هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس مع وضوح جنبا إلى جنب وتقنيات مكعب. انه يقدم عملية المقاصة أسرع مقارنة مع بروتوكول المقاصة السلبي التي وضعتها تشيونغ وآخرون. 14 وتومر وآخرون. 15 ويسمح للأنسجة الحبل الشوكي لتكون معتمدة بشكل جيد من قبل هيدروجيل خلال المقاصة.
خطوة هامة أثناء التثبيت من الحبل الشوكي الماوس، كما ذكرت من قبل تشيونغ وآخرون. 14 وتومر وآخرون. 15، هو الحفاظ على كل الحلول باردة على الجليد، والذي يمنع البلمرة من المواد الكيميائية. الخطوة الهامة الأخرى هي أن يروي الماوس ببطء مع حل هيدروجيل لتجنب تورم في الأنسجة العصبية. من أجل حل هيدروجيل لتصبح مادة هلامية، مطلوب التفريغ. وكبديل لذلك، كنا بارافيلم لتغطية الجزء العلوي من الأنبوب وترك أي فقاعات الهواء بين لمؤسسات احل روجيل وبارافيلم. عملت هذا بشكل جيد للغاية، وأصبح الحل هيدروجيل هلام بعد بضع ساعات. على الرغم من أن وجدت بعض الفقاعات في هلام، إلا أنها لم تتدخل في التجارب التالية، والتي يتضح من عدم وجود فقاعات في أنسجة الحبل الشوكي. المقاصة هو الخطوة الأكثر أهمية، ويتطلب مجموعة من الكواشف. الحل المقاصة، التي تحتوي على الأمينية للكحول، يزيل الدهون من الأنسجة الحبل الشوكي أسرع بكثير من / البوريك حمض أساس حل المقاصة SDS المستخدمة في بروتوكول ضوح الأصلي 16.
ميزة الوضوح ومكعب خلال تقنيات المناعى التقليدية هي أن كتلة الأنسجة بأكمله ولا يمكن تصوير دون باجتزاء الأنسجة، ونتيجة لذلك، يتم الاحتفاظ استمرارية الألياف هرمون السيروتونين، وأنه من الممكن اتباع نفس الألياف لمسافات طويلة ضمن ض المكدس. مع هذه الميزة، الضمان الإضافي يمكن تحديدها بثقة مع الصور 3D، لالثانية استنتاجات جديدة وبالتالي، يمكن أن تكون حول طبيعة مسارات هرمون السيروتونين. بروتوكول صفها هو أداة مريحة للتحقيق في أنظمة الألياف، وكذلك نوى ببساطة عن طريق وصفها الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة. هذا الأسلوب هو أيضا خيارا مثاليا لاستجواب أنظمة مختلفة في نفس دماغ الفأر باستخدام الوسم ضعفين أو ثلاثة أضعاف. في وضع المختبر لدينا، كان متعدد الفوتون المجهر الفلورسنت المتاحة مع مسافة عمل ما يقرب من 300 ميكرون. هذا يحد من صورتنا إلى حد أقصى قدره 600 ميكرون إذا يتم تفحص كلا الجانبين من الأنسجة. ومع ذلك، خفيفة ورقة المجهر الفلورسنت، يمكن أن الصورة مخ الفأر كامل والحبل الشوكي من خلال من العرض الكامل والطول والعمق. ميزة أخرى من هذا الأسلوب هو أن الأجسام المضادة يمكن مزال ثم الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة آخر مختلف تطبيقها مرة أخرى لنفس النسيج. وهذا يقلل من استخدام الحيوانات بشكل كبير فضلا عن التكاليف المرتبطة إعداد أنسجة المخ جديدةلكل تجربة. لنفس السبب، ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى الأنسجة الأخرى. وقد تم بالفعل هناك دراسات أجريت على الرئتين والكلى والقلب والأمعاء، ونسيج الورم 26،27.
وهناك أيضا قيود على هذا الأسلوب، على سبيل المثال، نواة الرفاء في الدماغ المؤخر الماوس يحتوي على العديد من أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية GABAergic. على الرغم من وضوح وCUBIC سيسمح لدراسة توزيع أنواع مختلفة من الألياف raphespinal في دماغ الفأر واحد والحبل الشوكي. هذه الخلايا العصبية، التي لم يتم تحديدها تحديدا من قبل الناقلات العصبية أو علامات البروتين، لا يمكن تحديدها في هذا الإعداد. وبديل ذلك هو لتسمية الخلايا العصبية محددة أو أنظمة الألياف مع تحقيقات الحمض النووي مثل التهجين في الموقع. وهذا هو، من ناحية أخرى، والتي يقيدها نظام وضع العلامات والفلاتر المتاحة للتصوير الفلورسنت. تصوير جميع الألياف raphespinal بالتالي لا يزال يشكل تحديا.إذا تم الجمع بين هذه التقنيات مع حقنة داخل الجمجمة من التتبع تقدمي (مثل فاصولياء شائعة leucoagglutinin - فا-L)، قد يكون من الممكن أن نرى الألياف هرمون السيروتونين، والألياف GABAergic، وغيرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
References
- Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
- Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
- Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
- Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
- Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
- Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
- Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
- Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
- Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
- Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
- Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
- Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
- Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
- Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).
