Abstract
长递减纤维脊髓是运动，疼痛的感知，和其他行为的关键。在大多数这些光纤系统的脊髓纤维端接图案没有在任何物种被彻底调查。血清素纤维，其投射到脊髓，已经研究了在大鼠和负鼠上组织切片和它们的功能意义已经基于在脊髓其光纤端接图案被推断出来。与净度和立方技术的发展，有可能研究这种纤维系统及其在脊髓分布，这是可能揭示血清素脊髓上通路的先前未知的功能。在这里，我们使用相结合的清晰度和CUBIC成像技术在小鼠脊髓血清素纤维提供了详细的方案。该方法涉及的小鼠的灌注的水凝胶溶液中，澄清的组织与COMBIN清除试剂的通货膨胀。脊髓组织在不到2周清除，5-羟色胺随后的免疫荧光染色在不到十天完成。用多光子荧光显微镜，所述组织被扫描，并使用Osirix软件的3D图像被重建。
Protocol
伦理学声明：所有涉及动物主题程序遵循的动物护理和伦理委员会（ACEC）在新南威尔士大学的准则（经批准的ACEC号为14 / 94A）。
1.透明小鼠脊髓的制备
- 冰冷水凝胶液的制备
- 的16％多聚甲醛溶液的制备（PFA）
- 将16多聚甲醛粉末成70毫升预热蒸馏水（50-55℃）和直至多聚甲醛溶解在加热的磁力搅拌器搅拌。注意：不要让溶液加热超过55℃，要知道，多聚甲醛是有毒的。
- 的多聚甲醛溶液转移到一个圆柱体，并添加蒸馏水至100ml。冷却用4℃冰箱内的多聚甲醛溶液。
- 溶解125毫克的VA-044引发剂在26.25毫升蒸馏水，并在4冷却溶液°Ç冰箱。
- 凉爽5毫升丙烯酰胺溶液（40％），1.25毫升二溶液（2％）（小心：双丙烯酰胺溶液是有毒的，可能会导致遗传性缺陷或癌症）中，加入5ml 10×PBS，12.5毫升16％PFA溶液中，将在冰上的VA-044引发剂溶液。
- 混合冰上述解决方案。
注意：总体积为50毫升
- 的16％多聚甲醛溶液的制备（PFA）
- 灌注和收集的小鼠脊髓的
- 麻醉小鼠，在0.9％的生理盐水稀释氯胺酮（80毫克/千克）和xyzaline（5毫克/千克）的腹膜内注射。对小鼠的剂量可以比老鼠低。
- 在通风橱合适的塑料表面，固定鼠标的四肢远离身体（胶带是有效的），一旦鼠标不能捏响应其足部皮肤。
- 切过胸部小鼠皮肤，然后胸口骨头用剪刀暴露心脏。
- 使用蠕动泵，以地下25针连接到第管电子端，针头插入心脏的左心室，剪断右心房以创建血液出口点，然后用40毫升的0.9％的生理盐水开始洗涤的约10毫升/分钟的速率。
- 当完成时，灌注用35ml冰冷的水凝胶溶液中的鼠标。
注意：灌注以10ml / min的速度，以避免对神经组织的肿胀。 - 切开皮肤上用刀片的背面，然后除去旁边的脊椎动物的肌肉。切割一侧椎弓，并将其翻转到另一边后，将脊髓出脊柱用细剪刀。
- 清除小鼠脊髓
- 放置在15毫升的水凝胶溶液中的脊髓在4℃下过夜。
- 除去将10毫升的水凝胶溶液和倾与脊髓节段的溶液的其余部分5ml的管中。填5毫升管与水凝胶溶液，直到它完全满。
- 伸一小块封口膜超过5毫升管的顶部，然后包裹封口膜围绕管的颈部。注：确保封口膜接触水凝胶解决方案，并有水凝胶液和封口膜之间没有气泡。
- 把5毫升管在37 ℃的烘箱过夜。观察水凝胶溶液，直到它变成了凝胶。
- 取5毫升管出炉并从用扳手管取出凝胶（如铲1毫升枪头）。通过坚持粗组织凝胶取下脊髓组织的凝胶，然后把粗的组织远（凝胶将坚持组织，因此将通过组织被删除）。
- 从脊髓组织除去凝胶后，洗脊髓4次用1×PBS（pH7.4）中为在振荡器上24小时。
- 3.85克尿素3.85克N-，N，N'，N'-四（2-羟丙基）ethylenediam溶解制备立方结算溶液INE在5.38毫升蒸馏水。
注：加热搅拌器使用。添加2.31克聚乙二醇单对异辛基苯基醚/的Triton X-100的溶液，一旦它是明确的，冷却到室温。
注为10g这三种化学品是一个鼠标。 - 冠状切开小鼠脊髓与刀片2-3毫米长的段，放入5ml上述CUBIC结算解决方案。上于37在烤箱摇动器放置 °℃下3天。
- 三天后，改变它的结算溶液至新鲜的。注意：将上述溶液在使用前制备。
- 两三天后刷新CUBIC结算解决方案后，核对与字体8个字符的文件组织的透明度。如果它是透明的，字母可通过清除组织中看到。除去信息交换溶液和添加的PBST 4毫升（0.1％的Triton-X100）洗组织每天（每6小时）的4倍。
- 在37℃的烘箱中3天振荡器上：孵育在一次抗体溶液中的脊髓节段（在PBST 100抗血清素，兔凸起，稀释1）。
- 除去抗体溶液，并添加的PBST 4毫升（0.1％的Triton-X100）洗脊髓节段，每天4次（每6小时）在37℃的烘箱。
- 除去PBST溶液，并添加二次抗体溶液（594缀合的山羊抗兔IgG，1:100稀释在PBST）温育3天的组织上的摇动器在37℃的烘箱。
- 去除二级抗体溶液并在振荡器上在37℃的烘箱加4毫升的PBST洗脊髓节段每日4次（每6小时）。次日将组织准备成像。
3.成像
- 除去PBST溶液，并添加4毫升85％甘油，以使所述组织的折射率均匀。
- 把85％的甘油几滴旁边的脊髓组织，并用22×50毫米2盖玻片玻璃盖玻片它。
注意：脊髓的取向决定了图象的样子。 - 把玻璃载片上的多光子荧光显微镜的保持框和移动组织进入光路。
- 选择氦氖激光线594 nm和通过检查阳性信号的亮度的实时图像中调整激光的最佳水平的强度。
- 选择使用20X物镜（在水中，NA 0.7）的脊髓组织的扫描区域和准备创建的z栈，并设置为3微米的每一个步骤的深度。
- 扫描从顶部组织于z叠层的20X objec下底略去然后63X物镜（在油中，NA 1.4）（步长为1微米），分别。重建使用3D软件28 3D视频。
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Representative Results
本节将展示使用的清晰度和CUBIC协议的组合在透明小鼠脊髓血清素从抗体染色的结果。我们表明，血清素纤维的存在与腹角的腹侧部的优势脊髓所有薄片（ 图1中 ，也看到视频1）。控制的组织没有阳性纤维（结果未示出）。在腹角，密密麻麻的血清素纤维在腹角的腹内侧部分，他们对腹角的横向部分延伸（ 图2，见视频2）。一些免疫阳性纤维也对背角或中央管腹角延伸。免疫阳性纤维存在于背角的所有薄片，但有正面纤维之间的小间隙中薄片2和4中，尤其是在横向背角的一部分。多数在背角血清素纤维是小直径而其中只有一小部分是大直径（ 视频1）的。在一个水平部分中，观察到在腹角密密麻麻血清素纤维沿着脊髓的纵向轴线行进，并形成一个大的纤维束。最有趣的发现是，这种大的纤维束发出沿着纵轴定期分支，其中垂直于纤维束。这些分支沿其路径进一步抵押到腹角的侧部。与这些分支相比，朝向中线延伸的是不规则和小（ 图2）。下的63X物镜，观察到在背角的血清素纤维沿着脊髓的轴线行进，并在沿道的路径的各个点终止。粗纤维薄˚F中零星分布 IBERS（ 图3，见视频3）。
图1：在200X放大率左腰部帘线的冠部HT能纤维是腹角，右边是背角，背是脊髓的内侧部分，和腹侧是脊髓的横向部分。比例尺为100微米。血清素纤维是存在于所有的薄片，特别是在腹角，其中的纤维密度高的腹内侧部分。这些纤维朝两个腹角的侧部和中央管或背角延伸。纤维在其它薄片的密度是低的。多数血清素纤维很细。只有纤维的少数厚，他们在这两个背角和前角（被视为>又见视频1（点击下载））。
图2：在200X放大率左和腹角的腹侧部右HT能纤维是脊髓的侧面，背面是脊髓延髓部分，和腹侧是脊髓的尾部。比例尺为100微米。血清素纤维示沿着脊髓的纵向轴线行进，并填充在腹角在那里形成一个厚厚的纤维束的中间部分。出此束的，一些分支被在朝向腹角的侧部等间隔延伸，而另一些朝向所述中线延伸是不规则和短。这些纤维终止在沿着道的路径的许多点（ 也见视频2（点击下载））。
图3：在背角羟色胺纤维下，在630X的放大倍率留下的是脊髓的外侧部分，右边是脊髓，背部和腹部分别指背背角的腹侧部，内侧部。 。比例尺是7微米。血清素纤维沿着脊髓的纵向轴线行进，并沿管道的路径终止。这些纤维主要是小直径用少量混合厚纤维。这些纤维很少相互重叠（ 见视频3（点击下载） ）。
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Discussion
协议中所述显示了如何像血清素纤维在小鼠脊髓与组合的清晰度和CUBIC技术。它与由Cheung等 14和托默等人 15开发的被动资料交换协议引入了更快的结算处理，并允许脊髓组织要由水凝胶清除期间很好的支持。
鼠标脊髓定影期间的一个重要步骤，所报告的Cheung等 14和托默等人 15，是保持所有的解决方案在冰上，其防止化学物质的聚合冷却。另一关键步骤是与为了避免神经组织的肿胀的水凝胶溶液中缓慢灌注小鼠。对于水凝胶溶液成为凝胶，需要脱气。作为替代此，我们使用石蜡膜覆盖管的顶部和左侧没有气泡的附件hyd之间rogel溶液和封口膜。这个工作得很好，并在水凝胶溶液变成几个小时后的凝胶。虽然在凝胶中发现了一些气泡，他们没有用下面的实验中，这是由在脊髓组织中不存在气泡的证明干扰。结算是最关键的步骤，并且需要的试剂的组合。结算解决方案，含有氨基醇，消除脊髓组织比SDS /硼酸基清原CLARITY协议16使用的解决方案更快的脂质。
净度和立方比传统免疫组织化学技术的优点是，整个组织块可以在不切片的组织进行成像，其结果是，在血清素纤维的连续性被保留，并且可以遵循同样的纤维为长的距离的Z堆叠内。凭借这一优势，抵押可以自信与3D图像识别，一第二新颖的结论，因此可以在关于血清素能通路的性质。描述的协议是用于通过简单的标记用特异性抗体的组织纤维系统，以及核的调查的方便工具。这种技术也是通过使用双重或三重标记询问在同一个小鼠大脑不同的系统的理想选择。在我们的实验室环境中，多光子荧光显微镜是可具有大约300微米的工作距离。这限制了我们的图像为最多600微米，如果组织的两侧进行扫描。然而，光片荧光显微镜，可以形象整个小鼠脑和脊髓通过其全部宽度，长度和深度。该技术的另一个优点是，该抗体可以被洗脱，然后彼此不同的抗体或抗体的再次施加到相同的组织。这减少了动物的使用相当以及与制备新的脑组织相关的成本每个实验。出于同样的原因，这种技术可以应用到其他组织。目前已经在肺，肾，心脏，肠和肿瘤组织26,27进行了研究。
也有该技术的限制，例如，在小鼠后脑缝核中包含多种类型的神经元，包括GABA能神经元。虽然清晰度和CUBIC将允许不同类型的raphespinal纤维在一个单一的鼠标脑和脊髓分布的研究。这些神经元，这是不通过神经递质或蛋白质标记具体确定，不能在此设置被识别。另一种方法是标记的具体的神经元或与核酸探针纤维系统，如在原位杂交。这是，在另一方面，由标记系统和用于荧光成像的可用的过滤器的限制。因此成像所有raphespinal纤维仍然是一个挑战。如果这些技术被用顺行示踪剂的颅内注射组合（如菜豆白细胞凝集素 - PHA-L），它可能是可以看到的血清素纤维，GABA能纤维，和其他。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
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