Abstract
척수 긴 하강 섬유 운동 통증 지각, 및 다른 동작을 위해 필수적이다. 이러한 섬유 시스템의 대부분의 척수 광섬유 종단 패턴 철저 종 조사되지 않았다. 척수 돌출 세로토닌 섬유, 조직 학적 섹션에 쥐 주머니쥐 연구되었으며 기능적 의미는 척수에서의 광섬유 종단 패턴에 기초하여 도출되었다. 명확성과 CUBIC 기술 개발과 함께,이 광 시스템 및 세로토닌 척 주상 경로의 알려지지 않은 특징을 밝힐 가능성 척수에서의 분포를 조사하는 것이 가능하다. 여기서는 결합 선명도 CUBIC 기술을 사용하여 마우스 척수 세로토닌 섬유 영상화 상세한 프로토콜을 제공한다. 방법은 COMBIN와 조직 겔 용액 설명과 마우스의 관류를 포함시약을 삭제의 ATION. 척수 조직 바로 아래 2 주 클리어하고, 세로토닌에 대한 후속 면역 염색 미만 십일 년에 완성되었다. 다중 광자 형광 현미경으로 조직을 검사하고, 3D 이미지 Osirix 소프트웨어를 사용하여 재구성 하였다.
Protocol
윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 모든 절차 (승인 ACEC 번호 14 / 94A입니다) 뉴 사우스 웨일즈 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오.
투명 마우스 척수 1. 준비
- 아이스 콜드 하이드로 겔 용액의 조제
- 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA)
- 70 ml의 미리 예열 증류수 (50-55 °에 C)에 16g 파라 포름 알데히드 분말을 추가하고 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 가열 자석 교반기에서 교반한다. 참고 :이 솔루션은 이상 55 ° C 열 및 파라 포름 알데히드는 독성이 알고 있어야하는 것을 허용하지 않습니다.
- 실린더에 파라 포름 알데히드 용액을 전송하고 100 ㎖에 증류수를 추가합니다. 4 ℃의 냉장고를 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 냉각.
- 증류수 26.25 mL에 125 mg의 VA-044 개시제를 용해 4 용액을 냉각C의 냉장고 °.
- 차가운 5 ㎖ 아크릴 아미드 수용액 (40 %) 1.25 mL의 비스 용액 (2 %) (주의 : 비스 아크릴 아미드 솔루션은 유전 적 결함이나 암을 유발할 수 있고, 독성), 5 ㎖의 10 배 PBS, 12.5 ml의 16 % PFA 용액 및 얼음 VA-044의 개시제 용액.
- 얼음 위의 솔루션을 섞는다.
주 : 전량을 50 ㎖이다.
- 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA)
- 마우스 척수의 관류 및 컬렉션
- 0.9 % 생리 식염수에 희석 케타민 (80 ㎎ / ㎏) 및 xyzaline (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스의 투여 량은 생쥐의 경우보다 더 낮을 수있다.
- 마우스가 다리의 피부에 핀치에 응답하지 않습니다 일단 흄 후드에 적합한 플라스틱 표면에, (접착 테이프가 효과가있다) 떨어져 몸에서 마우스의 사지를 고정합니다.
- 가슴 위에 마우스 피부를 잘라 후 뼈 가슴은 가위로 가슴을 노출.
- 25 G 바늘 토륨에 부착하여, 연동 펌프를 사용하여튜브의 E 단부는 심장의 좌심실로 니들을 삽입 약 10 ㎖ / 분의 속도를 피 종료점을 만든 다음 40 ml의 0.9 % 생리 식염수로 세정을 시작 우심방 자르지.
- 완료되면, 35 ml의 차가운 얼음 하이드로 겔 용액으로 마우스를 관류.
참고 : 10 ML의 속도로 관류 / 분 신경 조직의 부종을 방지 할 수 있습니다. - 블레이드와 뒷면에 피부를 절개하고 척추 옆 근육을 제거합니다. 일측에 척추 아치를 절단하고, 다른 쪽에게 튀기는 후 미세 시저와 척주에서 척수를 취할.
- 마우스 척수 지우기
- 밤새 4 ℃에서 하이드로 겔 용액을 15 ml의에서 척수를 놓습니다.
- 겔 용액 10 ㎖를 제거하고 5 ㎖ 튜브에 척수 세그먼트 용액의 나머지를 붓는다. 그것이 완전히 찰 때까지 겔 용액 5 ㎖ 튜브를 채우기.
- 5 ㎖ 튜브의 맨 위에 파라 필름의 작은 조각을 스트레칭 후 튜브 목 파라 필름 랩. 참고 : 파라 필름 접촉을 하이드로 겔 솔루션을 확인하고 하이드로 겔 용액과 파라 필름 사이에 거품이 없습니다.
- 37 년 5 ML 튜브를 넣어 ° C 오븐에서 밤새. 이 겔하게까지 하이드로 겔 솔루션을 관찰한다.
- 오븐에서 5 ML 튜브를 타고 (예 : 삽 1 ML의 피펫 팁 등) 스패너와 튜브에서 젤을 제거합니다. 겔에 거친 조직을 고집하여 척수 조직에서 젤을 제거하고 (겔 조직에 충실하고, 따라서 조직에 의해 제거됩니다) 떨어진 거친 조직을.
- 척수 조직으로부터 겔을 제거 후, 쉐이커상에서 24 시간 동안 1X PBS (PH 7.4)와 척수 4 회 반복한다.
- 3.85 g의 우레아 및 385 g의 N, N, N ', N'- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) ethylenediam 용해 CUBIC 클리어 용액을 준비5.38 용액에 오프라인은 증류수.
주 : 뜨거운 교반기가 사용됩니다. 분명히하고 실온까지 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다.
참고 :이 세 가지 화학 물질 10 g을 하나의 마우스입니다. - 면도날 2-3 mm 길이 세그먼트로 coronally 마우스 척수를 잘라 위의 CUBIC 청소 용액 5 ㎖로했습니다. 37 ℃ 오븐에서 진탕 놓고 3 일간 C를 °.
- 3 일 후 새로운 하나에 청소 솔루션을 변경합니다. 주 : 상기 용액은 사용 전에 제조한다.
- 2 ~ 3 일 후에 CUBIC 청소 솔루션을 새로 고침 후, 글꼴 8 문자 용지에 조직의 투명성을 확인합니다. 이 투명한 경우, 글자 삭제 조직을 통해 알 수있다. (0.1 % 트리톤-X100)는 조직 4 회 (6 시간마다)을 씻어 청소 용액을 제거하고 PBST의 4를 가하여.
- 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일 : 차 항체 용액에서 척수 세그먼트를 품어 (PBST 100 항 세로토닌은 토끼에서 제기, 1 희석).
- 항체 용액을 제거하고 4 PBST를 가하여 (0.1 % 트리톤 X100)는 37 ° C의 오븐에서 척수 세그먼트 4 회 (매 6 시간)을 씻어.
- 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일간 조직을 배양 : PBST 용액을 제거하고 이차 항체 솔루션을 추가 (PBST 100 594 복합 염소 항 - 토끼 IgG의를 1 희석).
- 이차 항체 용액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 통에 하루 척수 세그먼트 4 번 씻어 (6 시간마다) PBST 4를 가하여. 다음날 조직 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
3. 이미지
- PBST 용액을 제거하고, 심지어 조직의 굴절률을 85 % 글리세롤 (4)를 가하여.
- 척수 조직 옆에 85 % 글리세롤을 몇 방울을 넣어 22 X 50mm 유리 커버 슬립이 그것을 커버 슬립.
참고 : 척수의 방향은 이미지가 어떻게 보이는지를 결정한다. - 다중 광자 형광 현미경의 유지 프레임에 유리 슬라이드를 넣고 빛 경로로 조직을 이동합니다.
- 헬륨 네온 레이저 라인 594 nm의 선택 및 라이브 화상에 양 신호의 밝기를 검사하여 최적의 레벨로 레이저의 세기를 조절한다.
- (물, NA 0.7) 20X 대물 렌즈를 이용하여 척수 조직의 스캔 영역을 선택하고, Z 스택을 만들 준비하고,이 3 μm로 설정된 각 단계의 깊이.
- 20X 미만의 objec Z 스택의 상단부터 하단까지의 조직을 검사적인하고 (오일 중, NA 1.4)를 63X 대물 각각 (스텝 크기는 1 ㎛였다). 3D 소프트웨어 (28)를 이용하여 3 차원 영상을 재구성한다.
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Representative Results
이 섹션은 명확성과 CUBIC 프로토콜의 조합을 사용하여 투명 마우스 척수 세로토닌 항체 염색의 결과를 나타낸다. 우리는 (또한 비디오 (1) 그림 1 참조) 세로토닌 섬유는 복부 뿔의 복부 부분에서 우위와 척수의 모든 라미에 존재하는 것으로 나타났다. 제어 조직은 긍정적 인 섬유 (결과가 표시되지 않은)하지 않았다. 복부 호른에서 조밀 세로토닌 섬유 복부 혼 ventromedial 부분에 존재하고 이들이 복부 혼 측방으로 연장 (도 2,도 비디오 2 참조). 일부 면역 양성 섬유는 또한 후각 또는 중앙 운하쪽으로 복부 혼에서 확장 할 수 있습니다. 면역 양성 섬유 후각 모든 엽층에 존재하지만, 양의 섬유 사이의 작은 갭은, 특히 횡 방향으로 라미 나 (2, 4)에 존재후각의 일부. 후각에서 세로토닌 섬유의 대부분은 작은 직경이고 그 중 소수는 큰 직경 (비디오 1)의이다. 수평 섹션 복부 경적 조밀 세로토닌 섬유는 척수의 길이 방향 축을 따라 이동 큰 섬유 다발을 형성하는 것으로 관찰되었다. 가장 흥미로운 발견은이 큰 섬유 다발 섬유 다발에 수직 정기적 종축을 따라 분기를 발행한다는 것이다. 이러한 분기는 상기 나팔 복부 측 부분에 자신의 경로를 따라 할 담보. 이러한 분기에 비해 중간 선으로 연장하는 사람은 불규칙하고 작은 (그림 2)입니다. 63X 대물 렌즈에서 후각에서 세로토닌 섬유는 척수의 축을 따라 이동 및 관의 경로를 따라 다양한 지점에서 종료하는 것으로 관찰되었다. 두꺼운 섬유는 산발적으로 얇은 F 분산되어 ibers (그림 3, 또한 비디오 3 참조).
그림 1 :. 200X 배율 왼쪽에서 요추 코드의 코로나 섹션에서 세로토닌 섬유는 바로 후각이, 지느러미는 척수의 중간 부분이며, 복부는 척수의 측면 부분, 복부 혼입니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. 세로토닌 성 섬유는 특히 섬유 밀도가 높은 복부 혼 ventromedial 부분에서, 모든 엽층 존재한다. 이 섬유는 복부 뿔의 측면 부분과 중앙 운하 또는 등쪽 뿔 두쪽으로 확장 할 수 있습니다. 다른 라미의 섬유의 밀도는 낮다. 세로토닌 섬유의 대부분은 얇다. 오직 섬유의 소수 두꺼운 이들은 후각 및 복부 호른 (모두 보이는> 또한 비디오 1 참조) (오른쪽 다운로드 클릭).
그림 2 :. 복부 200X 배율 왼쪽에서 복부 뿔 부분과 오른쪽에서 세로토닌 섬유가 척수의 측면이며, 등 지느러미는 척수의 주동이의 일부이며, 복부는 척수의 꼬리 부분입니다. 스케일 바는 100 μm의입니다. 세로토닌 섬유는 척수의 종축을 따라 이동하는 도시가 두꺼운 섬유 다발을 형성 복부 혼의 중앙부에 포장된다. 중간 선을 향해 연장 다른 사람들이 불규칙하고 짧은 반면이 번들 가운데 일부 지점은 복부 뿔의 측면 부분으로 일정한 간격으로 연장된다. 이 섬유는 기관의 경로를 따라 여러 지점에서 종료 ( 또한 비디오 2 참조) (오른쪽 다운로드 클릭).
그림 3 : 630X 배율에서 아래의 후각에 세로토닌 섬유 왼쪽 오른쪽 척수, 지느러미와 복부 각각 지느러미와 후각의 복부 부분을 참조의 중간 부분이고, 척수의 측면 부분입니다. . 스케일 바는 7 μm의입니다. 세로토닌 섬유는 척수의 길이 방향 축을 따라 이동하고 관의 경로를 따라 종료된다. 이들 섬유가 혼합 된 섬유의 두께 소수 주로 작은 직경이다. 이 섬유는 거의 서로 중첩되지 ( 도 비디오 3 참조 (오른쪽) 다운로드 클릭 ).
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Discussion
이 프로토콜은 결합 된 선명도와 CUBIC 기술로 마우스 척수의 이미지 세로토닌 섬유하는 방법을 보여줍니다 설명했다. 이 청 등. 14 토 메르 외. (15)에 의해 개발 된 수동적 지우기 프로토콜에 비해 빨리 소거 과정을 소개하고 척수 조직이 아니라 클리어시 하이드로 겔에 의해 지원 될 수있다.
청 등. (14)와 토 메르 등. (15)에 의해보고 된 마우스 척수의 고정시 중요한 단계는 모든 솔루션은 화학 물질의 중합을 방지 얼음에 냉각 유지하는 것입니다. 다른 중요한 단계는 신경 조직의 팽창을 방지하기 위해 하이드로 겔 용액으로 천천히 마우스 관류한다. 겔 용액을 겔화하기 위해서는 탈이 요구된다. 이에 대한 대안으로, 우리는 HYD 사이에 공기 방울이 튜브의 상단을 덮도록 파라 필름을 사용하지 않고 남겨rogel 솔루션 및 파라 필름. 이것은 매우 잘 작동하고 겔 용액을 몇 시간 후의 겔이되었다. 일부 기포 겔에서 발견되었지만, 그들은 척수 조직 중의 기포의 부재에 의해 입증되었다 다음 실험을 방해하지 않았다. 용지가 가장 중요한 단계이며, 시약의 조합을 필요로한다. 아미노 알코올을 함유하는 클리어 용액을 원래 CLARITY 프로토콜 (16)에 사용되는 SDS / 붕산 계 클리어 솔루션보다 훨씬 빠른 척수 조직의 지질을 제거한다.
기존의 면역 조직 화학적 기법을 통해 명확하고 CUBIC의 장점은 전체 조직 블록이 결과, 세로토닌 섬유의 연속성이 유지되어 조직 절편없이 묘화 될 수 있으며, 이는 먼 거리에 동일한 섬유를 수행 할 수있다 Z 스택 내의. 이러한 장점과 함께, 담보는 자신의 3D 이미지를 식별 할 수 있습니다,ND 신규 결론 따라서, 세로토닌 성 경로의 특성에 대해 이루어질 수있다. 기술 된 프로토콜은 단순히 특정 항체와 조직을 레이블링 섬유 시스템뿐만 아니라 핵 조사 편리한 도구이다. 이 기술은 이중 또는 삼중 표지를 사용하여 동일한 마우스 뇌의 다른 시스템을 질의에 이상적이다. 실험실 세팅에서, 다중 광자 형광 현미경은 약 300 ㎛의 작동 거리를 사용할 수 있었다. 조직의 양면을 스캔하는 경우이 600 μm의 최대 우리의 이미지를 제한합니다. 그러나, 가벼운 시트 형광 현미경, 자신의 전체 폭, 길이, 깊이 통해 이미지 전체 마우스 뇌와 척수를 할 수 있습니다. 이 기술의 다른 장점은 항체가 용출 가능하고 또 다른 항체 또는 항체가 동일한 조직에 다시 적용한다는 것이다. 이것은 동물 사용량 상당히뿐만 아니라 새로운 뇌 조직의 제조와 관련된 비용을 줄일각 실험. 같은 이유로,이 기술은 다른 조직에 적용될 수있다. 이미 폐, 신장, 심장, 소장, 및 종양 조직 (26, 27)에서 수행 연구가 있었다.
또한,이 기술에는 한계가 있으며, 예를 들어, 마우스 후뇌에서 솔기 핵 GABA 성 뉴런을 포함한 여러 유형의 신경 세포를 포함한다. CLARITY 및 CUBIC는 하나의 마우스 뇌와 척수에 raphespinal 섬유의 다양한 유형의 분포의 연구를 위해 수 있지만. 자신의 신경 전달 물질 또는 단백질 마커에 의해 구체적으로 확인되지 않은 그 뉴런은이 설정에서 확인 할 수 없습니다. 대안은 동일계 하이브리드 화에서와 같이 핵산 프로브 특정한 뉴런 또는 광섬유 시스템 라벨이다. 이 라벨링 시스템 및 형광 이미징 가능한 필터에 의해 제한 한편,이다. 모든 raphespinal 섬유 이미징하기 때문에 도전 남아있다.이러한 기술은 선행 성 트레이서의 두개 내 주사와 결합 된 경우 (예 : 강낭콩의 leucoagglutinin로 - PHA-L)은 세로토닌 섬유, GABA 성 섬유 등을 볼 수있을 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
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