Protocol
Dyr omsorg og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med tyske lovene som regulerer dyr omsorg og godkjent av distriktet regjeringen i Braunschweig, Niedersachsen, Tyskland.
Merk: Som eksperimentet utføres in vivo, er det avgjørende å opprettholde høyest mulig hygienisk standard. Når det er mulig, arbeide under sterile forhold.
1. Klargjøre Injection / Recording System
- Steril røret som forbinder mikropipette med sprøyten. Bruke den korteste lengden av røret er mulig i den eksperimentelle oppsettet mellom injeksjonspumpe og elektrofysiologisk opptakssystem.
- Rengjør lederør i opptakssystemet ved hjelp av rengjørings ledninger. Dypp dem i sterile silikonolje og mate dem gjennom de enkelte lederør flere ganger.
- Sett kvartsglasset mikropipette inn i en føringsrøret av registreringssystemet. Se figur 1A.
- Etter fikse mikropipette iregistreringssystemet, fest sterilt rør til metall pin av mikropipette. Ta vare; Selv om mikropipette er festet i systemet kan det lett brekke når feste røret. Bruk to sterile pinsett til å gjelde likt trykk på pinne og tube.
- Bruk flytende superlim for å forsegle overgangen mellom rør og mikropipette. Vent minst tre timer for limet herde før du fyller mikropipette med væske.
- Sett mikroelektroder (for eksempel kvartsglass isolert platina-wolfram) i de andre posisjoner av opptakssystemet før eller etter innsetting mikropipette.
2. Klargjøring av stoffet
- Steril 1,5 ml mikrosentrifugerør for senere lagring av injeksjonsløsninger ved hjelp av en autoklav eller annen pålitelig prosedyre.
- Veie det tilsvarende substans scopolamin-hydroklorid for å fremstille 5 ml av en 0,1 molar løsning. Oppløses i sterilt saltvann (0,9% NaCl).
- Under sterile forhold ina ryke hette, filtrer løsningen ved hjelp av en sprøyte filter med tilstrekkelig stor pore diameter, for eksempel 0,2 mikrometer.
- Under avtrekksskap, delmengde løsningen i volumene tilstrekkelig for et enkelt eksperiment, for eksempel, for skopolamin, 500 mL i sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bruker mørke rør for å beskytte stoffet mot lys; alternativt vikle rør i aluminiumsfolie. For skopolamin, lagre løsning for inntil 14 dager ved 4 ° C.
3. Daglig Forberedelse av injeksjons / Recording System
Merk: Når den er montert i registreringssystemet, blir elektrodene og mikropipette som er lagret i en enzymløsning (Tergazyme, 1% oppløsning med avionisert vann) mellom opptak. Følgende trinn må utføres før hvert opptak.
- Samle en tube av den substans som skal injiseres. La det nå RT hvis nedkjølt.
- Fjern injeksjonen / opptakssystem fra enzymoppløsningen og skyll elektroderog mikropipette med avionisert vann for å rengjøre fullstendig av enzymoppløsning.
- Ta av frontdekselet på opptakssystem for å visuelt kontrollere forseglingen mellom mikropipette og rør.
- Påfør sterile silikonolje til styrerøret gap (se figur 1A) og tips av elektroder og mikropipette for å smøre systemet for jevn bevegelse.
- Sjekk tips av elektroder og mikropipette bruker et mikroskop for å sikre at de er intakte. Juster elektrodene og mikropipette under mikroskopet slik at de strekker seg ut av føringsrørene med samme lengde. Drive dem inn i føringsrørene, stopper så snart de ikke lenger er synlig. Dette er definert som elektrode posisjon null. Angi dybden av elektrodene og mikropipette til 0 i programvaren.
- Fyll en steril sprøyte med sterilt saltvann og stikk nålen inn i røret, tar seg ikke å stikke hull i veggen av røret. Kjør mikropipette ut av føringsrøret for visual kontroll over stoffet flyt.
- Flush minst 2 ml sterilt saltvann gjennom røret og mikropipette for å sikre at ingen luft igjen i sprøyten eller i røret. Ikke bruk for mye press på sprøytestempelet. Sørg for krysset mellom rør og mikropipette er forseglet. Hvis lekkasjen er synlig, re-lim krysset (se trinn 1.5) og utsette innspillingen.
- Fylle en ny steril sprøyte med oppløsningen som skal injiseres og bytte den med sylinderen av saltsprøyte, dvs. holde nålen på salt-fylt sprøyte i røret. Pass på at ingen luft blir overført til systemet. Dette oppnås best ved å fylle nål-muffen med saltoppløsning etter fjerning av salt-fylt fat.
- Å skylle filteret med 250 ul av oppløsningen som skal injiseres, for å fullstendig fjerne salt fra røret.
- Ved hjelp av motorstyreprogramvaren, trekke tilbake elektrodene og mikropipette inn i guidetubesto en dybde på minst -500 um.
- Rengjør bunnen av systemet med etanol, særlig hvor det vil berøre ape innspilling kammer.
- Lukk opptakssystemet ved å bytte ut frontdekselet og stramme skruene.
4. Validering av innsprøytningssystemet
Merk: Selv om selskapet kalibrerer systemet, anbefales det å validere kastet ut volumer med de materialene som brukes i den eksperimentelle oppsett (rør, sprøyter etc.).
- Klargjør system som beskrevet i trinn 3, holde elektroder og mikropipette utvidet ut av føringsrørene. En dybde på minst 7000 um anbefales for å unngå tap av målevolumet på grunn av adhesjon langs den ytre overflate av mikropipette og elektrodene.
- Plasser opptakssystemet i den stilling den vil bli brukt i løpet av eksperimentet og sette syringe inn i mikroinjeksjon pumpen. Fest sprøyten på plass med strikk og justerbar grep (se figur 1A). Skyv den bevegelige delen av pumpen til den sitter godt på plass bak stempelet på sprøyten.
- Ved hjelp av programvarestyrt motorenheten, mate ut et volum stort nok til å bli målt nøyaktig, f.eks., 1000 nl. Det er foretrukket å anvende en enkelt trinn for å støte ut det totale volum for å unngå virkningene av kapillarvirkning langs mikropipette overflate. Meget lave hastigheter (1 nl / s) kan også føre til at denne effekten under valideringsprosedyren.
- Samle det totale volum i en beholder plassert under mikropipette, eller samle forsiktig skyves ut slippe direkte fra spissen av mikropipette. Anslå kastet ut volumet ved hjelp av en pipette eller ved veiing med en presisjon skala.
- Gjenta prosedyren flere ganger for å bekrefte målinger.
5. Akutte Recordings
- Sett xy stillingav registreringssystemet. Dette definerer punktet hvor føringsrørene nå dura mater innenfor kronisk implanterte opptakskammeret. Pass på at føringsrørene er trukket helt (styrerøret z posisjon 0).
- Ta med innspillingen system på plass, og legg sprøyten i mikroinjeksjon pumpen. Fest sprøyten på plass med strikk og justerbar grep (se figur 1A). Skyv den bevegelige delen av pumpen til den sitter godt på plass bak stempelet på sprøyten. Hvis en dråpe stoffet er synlig på tuppen av føringsrørene, fjerner du det forsiktig med en steril bomullspinne.
- Forbered dyret for opptak i henhold til laboratoriets prosedyre (se 18 for eksempel retningslinjer).
- Sikkert å montere registreringssystemet av opptakskammeret i ape.
- Sakte manuelt senke føringsrør inn i innspillingen kammeret inntil dura er nådd, og deretter kjøre elektrodene hjelp av motor control programvare.
- Da det ikke er mulig å måle impedans på mikropipette, først kjørt med elektroder og sjekke deres impedanser regelmessig på forskjellige dybder. Etter en penetrering av dura er vellykket utført uten å skade elektrodene, fremme mikropipette.
- Drive elektrodene og mikropipette til målelektroden dybde hvor hjernen området av interesse er forventet å bli funnet. Sakte avansere elektroden inntil den er nær nok til å registrere aktiviteten av en enkelt enhet, som vist ved en god signal-til-støy-forholdet i det innspilte signal. Viktigere, plassere opptak elektroden og mikropipette på samme dybde for å sikre den minimale avstand mellom elektrode og mikropipette.
- Hvis mulig, holde elektrodene og mikropipette på denne dybden for hele opptaket. Imidlertid, hvis den eneste måten å opprettholde signalkvaliteten på den innspilte cellen er å flytte elektrodene, og deretter kjøre elektrodene og mikropipettesamtidig for å opprettholde avstanden mellom dem.
6. Spatial Attention Task
- I en serie forsøk, er tilstede to bevegelige punktmønstrene på skjermen, en posisjonert inne i mottakelige felt av den innspilte neuron og den annen utenom den, sammen med et sentralt presentert festepunkt at dyret har til foveate i løpet av hver prøveperiode 19, 20.
Merk: Apekatten er opplært til å svare på en retningsendring i spolt dot mønster (målet hendelse) og overser alle retninger endring i den andre punktmønster, og blir belønnet med en dråpe væske for hver vellykket gjennomføring av en rettssak 19, 20. Som en sensorisk kontroll tilstand, har ape til å rapportere en luminans endring av festepunktet og overser både bevegelige dot mønstre (se figur 2 for en mer detaljert beskrivelse av oppgaven).
7. Farmakologisk Manipulasjon Mens opptak
- I løpet av en injeksjonsblokk, injisere en forhåndsbestemt mengde av stoffet med jevne mellomrom, f.eks., 2 nl hvert minutt ved en hastighet på 2 Nl / s. For dette eksempelet bruker skopolamin hydroklorid. Injeksjons prosessen styres ved hjelp av programvare som gir ulike alternativer. For eksempel bruke skritt-funksjonen til å definere injeksjonsvolum, og trykk på injeksjonsknappen hvert minutt etter klokken på innspillingen programvare.
Merk: Den nøyaktige varigheten av injeksjons blokken er substans og eksperimentere avhengig, for eksempel, for skopolamin bruk 2 nl injeksjoner hvert minutt i 10 minutter (20 nl totalt).. Det er ikke anbefalt å gå videre elektrodene og Mikropipette During injeksjons blokken. - Legg merke til tid og forsøket hvorunder substansen injiseres, dybden av elektrodene og mikropipette, så vel som mengden av kastet ut substans.
- Flg injeksjonsblokken med en bedring blokk, i hvilken ingen substans er injisert. Varigheten av utvinning blokken er substans spesifikk og må være definert i pre-tester. Overvåke og vedlikeholde opptakskvaliteten av de valgte enkle enheter til slutten av gjenvinningsblokken.
- Gjenta de tre blokkene så lenge opptakskvalitet og motivasjon av ape tillater.
8. Post Opptak Prosedyrer
- Etter registrering av data, trekke elektroder og mikropipette inn føringsrørene og deretter manuelt trekke føringsrørene. Fjerne opptakssystemet fra opptakskammeret i ape. Frigjøre sprøyten fra injeksjonspumpen og overfører systemet til området ved fremstillingen for rengjøring.
- Håndtere dyr(inklusiv rengjøring av opptakskammeret 18) i henhold til standard prosedyrer i laboratoriet og returnere det til huset innretningen.
- Skyll utsiden av føringsrørene med hydrogenperoksyd (3%) og deretter med deionisert vann. Drive elektroder og mikropipette ut av føringsrørene, skyll med hydrogenperoksid og deretter avsaltet vann.
- Utveksle sprøytens sylinder med en tønne av en sprøyte fylt med sterilt saltvann, og holder nålen i røret. Skylle røret og mikropipette med 1-2 ml saltvann. Etter spyling, fjerne fat og fylle det med luft. Sett fatet i nålen og tørk røret og mikropipette fra innsiden ved å skyve luft gjennom.
- Oppbevar føringsrørene, utvidede elektroder og mikropipette nedsenket i enzymoppløsningen for å unngå uttørring, så vel som å sikre nedbrytning av organisk materiale.
Representative Results
Figur 2 viser den romlige oppmerksomhet oppgave apen utføres mens injeksjonsprosessen ble utført. Apekatten ble opplært til å delta på enten stimulans ligger innenfor mottakelig felt av den innspilte nevron (delta-in), stimulans ligger utenfor mottakelig feltet (delta-out) eller festepunktet (delta-fix). Disse forholdene gjør at en sammenligning av neuronal aktivitet i ulike oppmerksomhetstilstander.
Figur 3 viser et peri-stimulus tid histogram av en prøve nevron i et eksperiment ved bruk av skopolamin, en muskarin kolinerg antagonist. Plottet viser responsen undertrykkelse under skopolamin injeksjon versus ingen injeksjon, når et mønster som beveger seg i cellenes foretrukne retning blir presentert inne i nervecellen er mottakelig felt og er ivaretatt av dyret. De to første toppene representerer nevron9; s svar til on- og forskyvning av den romlige kø, som vises i sin mottakelig feltet. Dette etterfølges av responsen til bevegelsesmønsteret som vises på skjermen 500 ms etter at signalet utbruddet. Det grå skraverte området viser analyseperioden brukes til å beregne den gjennomsnittlige skuddtakt for enhver prøvelse. Det grønne området fremhever undertrykkende påvirkning av skopolamin injeksjon på cellens skuddtakt. Den mørkegrønne region viser undertrykkelse innenfor analyseperioden.
Figur 4A viser effekten av scopolamin på den gjennomsnittlige skuddtakt av prøven nervecelle i hver av de tre oppmerksomhets betingelser. Nevronets skuddtakt for de to romlige oppmerksomhet forhold (oppmerksomhet innenfor eller utenfor mottakelig felt av opptaket nevron) så vel som for den sensoriske tilstand (oppmerksomhet på festepunktet) falt kort tid etter første injeksjon av injeksjons blokken (grå skygge era) og under utvinning blokk økt etter en forsinkelse på samme nivå som før injeksjon.
Figur 4B viser en styre innspilling fra en annen prøve neuron i hvilken saltvann (0,9% NaCl) ble injisert ved bruk av den samme protokoll som for scopolamin injeksjon. Under injeksjonen blokk ble det ikke observert noen endring i nevronets avfyrings hastighet i forhold til styreblokken.
Figur 1. Set-up brukes for farmakologisk manipulasjon under opptak. (A) viser mikroinjeksjon pumpen og elektrofysiologisk opptak system utstyrt med elektroder og mikropipette. Den guidetube gap, inn i hvilket silikonolje er satt inn for å smøre elektrodene og mikropipette, er vist i større målestokk. (B) Viser et eksempel mikropipette (ovenfor)og opptak elektrode (nedenfor). For størrelse sammenligning en euro cent (diameter: 16 mm). Plasseres under Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oppgave design for å lede romlig oppmerksomhet. Monkeys ble opplært til å oppdage en bevegelse retning endring i spolt prikkmønster. Signalet ble enten plassert i nevronets mottakelig felt (delta-i), som vist i figuren, eller utsiden av den (delta-out). Som en sensorisk kontroll ble ape trent til å oppdage en luminans endring av festepunktet (delta-fix). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
< img alt = "Figur 3" src = "/ files / ftp_upload / 53724 / 53724fig3.jpg" />
Figur 3. Influence of antagonist skopolamin på skuddtakt. Den peri-stimulans tid histogram for et utvalg nevron er vist for delta-Tilstands (oppmerksomhet innenfor mottakelig felt av den innspilte nevron) under injeksjonen blokken og når styreblokken. X-aksen viser tiden i millisekunder etter signalet angrep og y-aksen viser skuddtakt i pigger / sek. Det grå området viser analyseperioden (300-800 ms etter stimulus utbruddet) brukes til å beregne prøvemiddelverdien skuddtakt. Det grønne området viser undertrykkelse i avfyring hastighet for de to forholdene. Den mørkegrønne fargen fremhever undertrykkelse innenfor analyseperioden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
iles / ftp_upload / 53724 / 53724fig4.jpg "/>
Figur 4. Effekt av scopolamin og saltløsning på skuddtakt. (A) Antagonist skopolamin injeksjon. Prøvemiddelverdien avfyring hastigheten for prøvecellen fra figur 3 i løpet av forsøket er vist for den foretrukne stimulans for alle tre oppmerksomhets forhold. X-aksen viser rettssaken i minutter og y-aksen viser enhetens skuddtakt i pigger per sekund. Symboler ( 
delta i, 
delta-fix, 
delta-out) representerer nevronets skuddtakt innenfor analyseperioden i hver vellykket utført prøving og horisontale linjer (heltrukken linje: delta i, stiplet linje: delta-fix, stiplet linje: delta-out) viser gjennomsnittlig skuddtakt for tre forskjellige eksperimentelle blocks (kontroll, injeksjon, utvinning). Det grå skraverte området viser injeksjons blokken, som begynner med den første injeksjonen og slutter 1 min etter siste injeksjon. I løpet av injeksjonen blokken 2 nL av 0,1 molar skopolamin ble injisert hvert minutt med en injeksjonshastighet på 2 Nl / s. (B) Saline injeksjon. Forbrenningsintensiteten av en prøvecelle i løpet av kontrollforsøk er vist for den foretrukne stimulans for alle tre oppmerksomhets forhold. Grey skraverte området visualiserer blokken av saltvann injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her har vi illustrert i detalj hvordan du skal utføre pålitelige og presise injeksjoner og høy kvalitet encellede innspillinger med en "off-the-sokkel" trykkinnsprøytning. Selv om denne metoden for levering av legemidler har tidligere blitt brukt i oppfører aper (anmeldt i 17), systemet som presenteres her har fordeler, anmeldt nedenfor.
Som vist i figur 4A, kan systemet som beskrives her tilveiebringe stabil måling av enkelt neuron aktivitet med og uten farmakologiske injeksjoner i umiddelbar nærhet av registreringsstedet. Som vist i figur 4B, injeksjon av en styre stoff, saltvann, ikke føre til en endring i skuddtakt. Denne kontrollen viser at injeksjonsprosessen i seg selv ikke har noen målbar innflytelse på avfyrings egenskapene til de registrerte nerveceller.
Den romlige konfigurasjon av nervecellen, innspilling elektrode, og mikropipette er av avgjørende betydning i disse eksperimentene. Selv om en nøyaktig måling av deres relative posisjoner i vevet under opptak ikke er mulig, kan vi vurdere og kontrollere for mulige kilder til avvik. Først i løpet av volum injeksjon er det en risiko for at neuron av interesse kan forskyves bort fra opptaks elektrode, som påvirker stabiliteten av registrerte signaler. Av den grunn er det klokt å sammenligne avfyringshastighet før og etter injeksjonen blokken for å kontrollere signalstabilitet. For det andre føringsrøret konfigurasjonen av opptakssystem definerer avstanden mellom elektrodene og mikropipette (f.eks., 305 mikrometer i det konsentrisk 3-kanalsystem som brukes i dette eksperimentet). Ettersom systemet gir presis posisjonskontroll for dybden av elektroder og mikropipette i vevet, kan avstanden mellom dem reduseres ved nøye kalibrering relativ dybde før opptak (trinn 3.5), og holde dem på et felles dybde under opptak.
ent "> Potensielle begrensningerI tillegg til in-house kvalitetskontroll av produsenten, må systemet som sertifiseres i henhold laboratorieforhold, som forskjellige merker av rør, kan sprøyter osv brukes og kan føre til forskjeller i slynges ut volumer. Selv om systemet kan brukes til å injisere meget små volum som i forsøket er vist her, er disse under et minimalt volum som kan valideres på grunn av praktiske målegrenser i en normal laboratoriemiljø. Imidlertid kan større injeksjonsvolumer bli brukt for å antyde forholdet mellom programvaredefinert volum og volumet skyves ut av maskinvaren. Hvis gjennomsiktige rør er brukt, er en visuell kontroll av injeksjonsprosessen er mulig ved å måle forskyvningen av en visuell markør.
Innsetting av mikropipette i systemet er mer krevende enn elektrode innsetting, som diameteren av mikropipette er litt større og materialet er mer skjøre. I tillegg,bli med i røret til pin av mikropipette er utfordrende som det innebærer en høy risiko for å bryte den øvre delen av mikropipette. Men levetiden for en vellykket lastet mikropipette er flere måneder, selv med daglig bruk.
I praksis har vi ennå ikke møtt en blokkering i innsprøytningssystemet under post-opptak rengjøring av systemet. Likevel er ingen "online" check mulig, og det er en risiko for at en fysisk blokkering (for eksempel vev ved mikropipette spissen) kan hindre substans injeksjon. Det kan derfor være fordelaktig å analysere dataene konservativt, slik som blant annet bare de celler i ytterligere analyse som viser signifikante endringer i avfyringshastigheter mellom kontroll og injeksjons blokker av forsøket.
Til tross for sin lille diameter, vil mikroelektroder og pipetter fortrenge hjernevev og kan føre til at noen lokal vevsskade. Dette kan minimeres ved manuelt å plassere spissen av the lederør like over dura mater. Elektrodene deretter trenge gjennom dura og deres intactness utledes ved å måle deres impedanser online. Deretter blir det satt inn mikropipette. Ved bruk av denne tilnærmingen, er regelmessig fjerning av vev over dura anbefalt for ytterligere å redusere risikoen for elektrode eller pipette brekkasje.
Sammenligning med alternative metoder
Systemet som brukes her viser klare fordeler sammenlignet med andre trykkinnsprøytning. En sterk fordel er diameteren til mikropipette (ca. 100 um), som er halvparten av størrelsen på andre tilgjengelige sonder 17 og derfor minimaliserer nevrale vevsskade. I motsetning til tidligere design, syssels dagens system romlig separert opptak elektrode og mikropipette. Selv om andre systemer gir en mindre avstand mellom elektrode og pipette, det systemet som er beskrevet her tillater uavhengige dyptgående endringer av elektroder og pipette, og dermed Permitte opp variable relative avstander innenfor en innspilling. Viktigere, ingen kompromisser angående opptakskvalitet må gjøres, som innsprøytningssystemet er en forlengelse av et etablert opptaksenhet. Selv om bare en mikropipette, og således en substans er brukt i denne protokollen, er det mulig å injisere flere stoffer i en eksperimentell prosedyre. For å oppnå dette, kan flere mikropipetter være gjenget inn i separate føringsrørene og forbundet med sprøyter som er montert i individuelle injeksjonspumper. Til slutt kontrollerer systemet er enkelt, da bare ett datamaskinprogram som er nødvendig for å fremme elektrodene og mikropipette, og for å utføre trykkinjeksjons under forsøket.
Sammenligning trykk injeksjon til iontoforese, er det relative fordeler og ulemper. For eksempel krever press injeksjon større volumer som skal innføres i vevet enn iontoforese, og dermed øke risikoen for neuronal forskyvning. Den nåværende protocol brukt volumer i NL-serien, og vi opplevde sjelden merkbare endringer i et registrert cellens signalkvalitet. Systemet tillater også større mengder som skal injiseres, noe som er potensielt nyttig for atferdsmessige manipuleringer, men kan påvirke stabiliteten av neuronal opptak. En klar fordel med press injeksjon iontoforese er større utvalg av brukbare stoffer som det ikke er krav om å bruke ladede stoffer. Imidlertid bør pH-verdien kontrolleres og sammenlignes mellom forsøks- og kontroll-midler (f.eks., Saltvann).
Spørsmålet kan oppstå hvorfor bruke veletablert metode for press injeksjon i stedet for nyere teknikker som optogenetics for å manipulere nevrale aktiviteten. Selv godt etablert i gnagere, optogenetics er ennå ikke sikkert etablert i rhesusaper. Spesielt er det ikke ennå tillater lokalt manipulering av celler som er selektive for en spesiell nevrotransmitter type. På lengre sikt ser vistore muligheter for kombinasjon av fordelene med farmakologiske manipulasjoner med fordelene ved optogentic manipulasjoner i belyse det nevrale basis av kognitive funksjoner.
Her har vi vist hvordan press injeksjon kan brukes for å manipulere farmakologisk et lokalt begrenset område i hjernen hos våkne, oppfører rhesusaper. Vi håper at denne metoden inspirerer andre forskere å undersøke neuromodulatory bidrag til dynamikken i neuronal aktivitet.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft gjennom Collaborative Research Center 889 "Cellular Mekanismer av Sensory Processing" til ST (Prosjekt C04). Vi takker Sina Plumer, Leonore Burchardt, Dirk Prusse, Klaus Heisig og Ralf Brockhausen for teknisk og dyrerelaterte støtte og våre samarbeidspartnere i stamcelle Enhet for den tyske Primate Center, Dr. Katharina Debowski og Anna Magerhans, for teknisk bistand i filtrering prosessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761----------R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
- Noudoost, B., Moore, T. The role of neuromodulators in selective attention. Trends Cogn Sci. 15 (12), 585-591 (2011).
- Jochems, A., Reboreda, A., Hasselmo, M., Yoshida, M. Cholinergic receptor activation supports persistent firing in layer III neurons in the medial entorhinal cortex. Behav Brain Res. 254, 108-115 (2013).
- Thiele, A., Herrero, J. L., Distler, C., Hoffmann, K. P. Contribution of cholinergic and GABAergic mechanisms to direction tuning, discriminability, response reliability, and neuronal rate correlations in macaque middle temporal area. J Neurosci. 32 (47), 16602-16615 (2012).
- Thienel, R., et al. Muscarinic antagonist effects on executive control of attention. Int J Neuropsychopharmacol. 12 (10), 1307-1317 (2009).
- Anthony, B. L., Dennison, R. L., Aronstam, R. S. Disruption of muscarinic receptor-G protein coupling is a general property of liquid volatile anesthetics. Neurosci Lett. 99 (1-2), 191-196 (1989).
- Yamakura, T., Bertaccini, E., Trudell, J. R., Harris, R. A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 41, 23-51 (2001).
- Herr, N. R., Wightman, R. M. Improved techniques for examining rapid dopamine signaling with iontophoresis. Front Biosci. 5, 249-257 (2013).
- Bevan, P., Bradshaw, C. M., Pun, R. Y., Slater, N. T., Szabadi, E. The relative contribution of iontophoresis and electro-osmosis to the electrophoretic release of noradrenaline from multi barrelled micropipettes [proceedings]. Br J Pharmacol. 67 (3), 478-479 (1979).
- Herr, N. R., Kile, B. M., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Electroosmotic flow and its contribution to iontophoretic delivery. Anal Chem. 80, 8635-8641 (2008).
- Thiele, A., Delicato, L. S., Roberts, M. J., Gieselmann, M. A. A novel electrode-pipette design for simultaneous recording of extracellular spikes and iontophoretic drug application in awake behaving monkeys. J Neurosci Meth. 158 (2-4), 207-211 (2006).
- Lalley, P. M. Microiontophoresis and Pressure Ejection: Modern Techniques in Neuroscience. Johansson, H., Windhorst, U. , 193-209 (1999).
- Malpeli, J. G., Schiller, P. H. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. J Neurosci Meth. 1 (2), 145-159 (1979).
- Malpeli, J. G. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. J Neurosci Meth. 86 (2), 119-128 (1999).
- Dias, E. C., Segraves, M. A. A pressure system for the microinjection of substances into the brain of awake monkeys. J Neurosci Meth. 72 (1), 43-47 (1997).
- Szente, M. B., Baranyi, A., Woody, C. D. Effects of protein kinase C inhibitor H-7on membrane properties and synaptic responses of neocortical neurons of awake cats. Brain Res. 506 (2), 281-286 (1990).
- Woody, C. D., Bartfai, T., Gruen, E., Nairn, A. lntracellular injection of cGMP-dependent protein kinase results in increased input resistance in neurons of the mammalian motor cortex. Brain Res. 386 (1-2), 379-385 (1986).
- Noudoost, B., Moore, T. A reliable microinjectrode system for use in behaving monkeys. J Neurosci Meth. 194 (2), 218-223 (2011).
- Association of Primate Veterinarians. Cranial Implant Care Guidelines for Nonhuman Primates in Biomedical Research. , Available from: http://www.primatevets.org/Content/files/Public/education/Cranial%20Implant%20Care%20Guidelines.pdf (2015).
- Treue, S., Martinez-Trujillo, J. C. Feature-based attention influences motion processing gain in macaque visual cortex. Nature. 399, 575-579 (1999).
- Martinez-Trujillo, J. C., Treue, S. Feature-based attention increases the selectivity of population responses in primate visual cortex. Curr Biol. 14 (9), 744-751 (2004).
