Her præsenteres en protokol til fremkaldelse af okulær hypertension i det murine øjet, der resulterer i tab af retinale ganglieceller som observeret i glaukom. Magnetiske mikroperler injiceres i forkammeret og tiltrukket af iridokorneal vinkel anvendelse af en magnet til at blokere udstrømningen af kammervæske.
Anvendelsen af gnaver-modeller af glaukom har været vigtigt at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for patofysiologien af denne multifaktoriel neurodegenerativ sygdom. Med fremkomsten af talrige transgene muselinjer er der stigende interesse for inducerbare murine modeller af okulær hypertension. Her præsenterer vi en okklusion model af glaukom baseret på injektion af magnetiske mikroperler ind i det forreste kammer i øjet under anvendelse af en modificeret mikronål med en facetteret fasning. De magnetiske mikroperler er tiltrukket af iridokorneal vinkel ved anvendelse af en håndholdt magnet til at blokere dræning af kammervand fra det forreste kammer. Denne afbrydelse i vandige dynamics resulterer i en støt stigning af intraokulært tryk, som efterfølgende fører til tab af retinale ganglieceller, som observeret i humane glaukompatienter. Den mikroperle okklusion model præsenteres i dette manuskript er enkel i forhold til andre inducerbare modeller af glaukom og også megeteffektiv og reproducerbar. Vigtigt er det, de ændringer, der findes her minimere almindelige problemer, der ofte opstår i okklusion modeller. Først anvendelsen af en affaset glas mikronål forhindrer tilbagestrømning af mikroperler og sikrer, at minimal sker skade på hornhinden under injektionen, hvilket reducerer skaderelaterede effekter. For det andet er anvendelsen af magnetiske mikroperler sikrer evnen til at tiltrække de fleste perler til iridokorneal vinkel, effektivt at reducere antallet af perler flyder i forkammeret undgå kontakt med andre strukturer (f.eks., Iris, linse). Endelig er anvendelse af en håndholdt magnet giver mulighed for fleksibilitet ved håndtering af små mus øje til effektivt lede magnetiske mikroperler og sikre, at der er ringe tilbagesvaling af mikroperlerne fra øjet når mikrokanylen trækkes tilbage. Sammenfattende mikroperlen okklusion musemodel præsenteres her er et kraftfuldt undersøgende værktøj til at studere neurodegenerative forandringer, der sker i løbet af indtræden og progression af Glaukoma.
Glaukom er en progressiv og irreversibel blændende tilstand, der vil påvirke en anslået 80 millioner mennesker verden over i 2020 en. I glaukom patienter, er synstab forårsaget af den selektive død af retinale ganglieceller (RGC'er), output neuroner, der overfører visuelle informationer fra nethinden til hjernen. Glaukom er en aldersrelateret neurodegenerativ sygdom med mange risikofaktorer, hvoraf den mest almindelige er forhøjet intraokulært tryk (IOP). Faktisk IOP er den eneste modificerbare risikofaktor i grøn stær og nuværende behandlinger fokuserer udelukkende på at styre trykket i øjet. Men flere genetiske, cellulære og miljømæssige faktorer påvirker debut og progression af denne sygdom. Derfor forstå de forskellige mekanismer, der i sidste ende bidrager til neuronal død er vigtigt at udvikle effektive behandlinger for glaukom.
Dyremodeller af grøn stær er afgørende for at studere sygdommen patofysiologi og identificere og testlovende lægemidler. Den øgede tilgængelighed af transgene mus linjer, herunder betingede knockout stammer og mus, der bærer genetisk kodet fluorescerende sporstoffer har drevet behov for inducerbare murine glaukom modeller. Adskillige gnaver modeller af glaukom er blevet udviklet i årenes løb (anmeldt i 2,3). I mange af disse modeller, er glaukom induceres ved at afbryde kammervæske dynamik, hvilket resulterer i forhøjelse af IOP. Okklusion modeller, i hvilke mikroperler eller andre stoffer injiceres ind i det forreste kammer af øjet for at blokere vandig dræning, har vundet popularitet i de senere år dels på grund af deres relative lethed til at øge IOP 4-14.
Mikroperlen okklusion model af glaukom, først udføres i primater 12, kaniner 8, og rotter 4,9,11, blev for nylig tilpasset til anvendelse i mus 5,6,10. I disse undersøgelser den intrakameral injektion af polystyren mikroperler, alene eller ikombination med et viskoelastisk materiale, resulterede i IOP elevation fører til efterfølgende RGC død 6,10. Men reflux når nålen trækkes tilbage fra øjet og løsner af mikroperler fra iridokorneal vinkel er fælles problemer, der opstår i løbet af proceduren. For at minimere disse ulemper, har magneter blevet anvendt til at tiltrække de magnetiske mikroperler til iridokorneal vinkel af øjet 4,9.
Protokollen beskrevet her er en modificeret procedure baseret på tidligere undersøgelser 9,10 der bruger magnetiske mikroperler og en håndholdt magnet tilpasset til muse øje (figur 1). Flere vigtige ændringer er blevet indført i vores protokol at sikre en effektiv og reproducerbar IOP stigning i mus. Først injektion af mikroperler med en og omhyggeligt forberedt glas mikronål med en facetteret fasning. De resulterende glatte overflader af mikronålen samt dens skarpe spids sikrer, at minimal skade erpåført som det punkterer hornhinden. Anvendelsen af dette glas mikronål resulterer også i øget kontrol når mikronål spids kommer ind i forkammeret, hvorved risikoen for at beskadige nærliggende strukturer såsom iris og linsen. Desuden den lille injektion læsion letter corneal selvreparerende og reducerer uønskede skaderelaterede effekter.
For det andet, injektion af magnetiske mikroperler og anvendelse af en håndholdt magnet tillade nøjagtig styring for at tiltrække perlerne til iridokorneal vinkel i små mus øjet. Magnetiske mikrokugler, der er 4,5 um i diameter blev brugt, fordi denne microbead størrelse ikke tilstoppe forberedt mikronålen åbning og vigtigere, når injiceres, disse mikrokugler effektivt blokeret dræning af vandig humor. Denne fremgangsmåde ikke kun reducerer tilbageløb af de injicerede mikroperler, men sikrer også, at et maksimalt antal mikroperler akkumuleres i målområdet til effektivt at blokere kammervandet dræning. Furthermore, denne strategi reducerer også antallet af perler flyder i forkammeret undgå kontakt med andre strukturer, såsom iris og linsen, og forhindrer passage til det posteriore kammer. Kollektivt, disse ændringer sikrer, at mikroperle injektion kirurgi udføres med relativ lethed og i rette tid resulterer i en meget reproducerbar, effektiv og vedvarende induktion af okulær hypertension hos mus.
Videoen teknik præsenteres her indeholder detaljerede trin for trin instruktioner om, hvordan man udfører intrakameral injektion af magnetiske mikrokugler til effektivt og reproducerbart fremkalde IOP elevation i mus. Denne procedure resulterer i vedvarende IOP stigning, der ikke kræver yderligere injektioner og fremmer påviselig RGC soma og Axon tab inden for de første 3 uger af okulær hypertension induction.Elevated IOP er en stor risikofaktor for at udvikle grøn stær hos mennesker. Derfor er dette en værdifuld murint okulær hypertension-afhængig glaukom model, der har potentiale til en lang række applikationer.
En fælles ulempe forbundet med injektionen af mikroperler i forkammeret angår bead tilbagesvaling gennem injektionsstedet når nålen trækkes tilbage, hvilket ofte resulterer i kun delvis obstruktion af vandig udstrømning og øget variabilitet. For at løse dette problem, blev der flere vigtige ændringer gennemføres. Firs t, omhyggelig fremstilling af en ren, skarp glas mikronål med en facetteret affasning er afgørende for en vellykket injektion af mikroperlerne. En korrekt fremstillet mikronål muliggør kontrollerede og god penetration af hornhinden med minimal påføring af tryk på den følsomme øjenoverfladen. Den lille corneal punktering forhindrer tilbagestrømning af mikroperler. Hertil kommer, at fine mikronål reducerer risikoen for skadelige nærliggende strukturer såsom iris og linsen, hvilket kan resultere i ikke-sygdom relateret inflammation. For det andet er anvendelsen af en håndholdt magnet til strategiske okulære områder under og efter injektionen er et andet kritisk aspekt af denne teknik. Under injektionen, er magneten bruges til at trække de magnetiske mikroperler til det forreste kammer forhindrer tilbageløb af mikroperlerne når mikrokanylen trækkes tilbage. Efter injektionen, er magneten derefter anvendes til at dirigere mikroperlerne til iridokorneal vinkel at blokere vandig humor outflow.
telt "> Et andet problem ofte stødt på mikroperle okklusion modeller er, at gentagne perle indsprøjtninger er ofte nødvendigt at opnå vedvarende IOP elevation 10,11. Dette kan være resultatet af mikroperler omplacere fra iridokorneal vinkel med tiden. Kombinationen af en håndholdt magnet, som beskrevet ovenfor, og placeringen af muse postoperativt i høj grad forbedrer resultatet. anvendelsen af injicerbare anæstetika, som tillader fleksibilitet til at bevæge hovedet under proceduren og kræve en længere postoperative rekonvalescensperiode, begunstiges. placering af mus med det opererede øje opad for et par timer efter operationen bidrager til løsning af mikroperler på iridokorneal vinkel og nedsætter risikoen for at løsne tilbage i forkammeret.Sikring af, at antallet af injicerede perler er relativt konsistent er endnu et kritisk trin for at minimere inter-dyr variationer. Da mikroperlerne bosætte på bottom af røret, er det nødvendigt fuldt ud homogenisere mikroperle opløsningen og trække det passende volumen ind i mikrokanylen i tide. Injektion af færre perler ind i det forreste kammer kan resultere i ufuldstændig blokering af vandige humor dræning strukturer, hvilket sandsynligvis vil resultere i dårlig eller variabel IOP elevation. Notatet selvom det endelige formål med mikroperlen injektion er at ophøje IOP, bør der udvises forsigtighed, når IOP målinger fra vågen mus er højere end de spidsværdier rapporteret i denne undersøgelse (~ 25 mmHg). Ekstremt høje IOPs øge risikoen for iskæmisk skade og kan også forårsage smerte for dyret. Højden af IOP bør betragtes som en af mange faktorer at vurdere succes operationen. Som sådan bør resultatet af proceduren måles baseret på flere parametre, herunder IOP elevation, RGC soma død, og Axon tab.
Selv om den her beskrevne protokol resulterer i de fleste mikroperler succesfuldely afregning ved den vinkel, en potentiel begrænsning af denne model er, at disse perler, der forbliver flydende i forkammeret kan interferere med levende retinal imaging gennem hornhinden, såvel som elektrofysiologiske eller adfærdsmæssige assays, der kræver effektiv passage af lys. Et andet vigtigt aspekt at overveje, når man bruger denne mikroperle okklusion model er, at omfanget af IOP elevation og efterfølgende RGC degeneration varierer med alder og genetiske baggrund af den opererede mus [4]. Derfor vil omfanget af IOP elevation og tidslinjen af RGC degeneration skal bestemmes for hver specifik transgene mus linje og / eller aldersgruppe.
Et træk ved denne model er, at forhøjet IOP resulterer i gradvise tab af RGC død i de første tre uger efter mikroperle injektion, og betydelig RGC død opdages ved 3 uger efter indgrebet. Derfor har dette model muliggør undersøgelse af tidlige og / eller subtile forandringer, der sker i denne disease, før åbenlys RGC soma og Axon tab. En betydelig stigning i RGC død blev ikke observeret mellem 3 og 6 uger efter induktion af okulær hypertension. Faktisk RGC soma og Axon tab stabilt på ~ 22-25% mellem 3 og 6 uger på trods af succes og vedvarende IOP elevation på disse tidspunkter. Der kan kræves en længere varighed af vedvarende IOP for yderligere RGC tab at forekomme i C57BL / 6 mus, som synes at være mere modstandsdygtige over for RGC skade i forhold til andre musestammer. 5 Supplerende ændringer til protokollen præsenteres her, herunder justering af perle størrelse og yderligere injektioner, kan være påkrævet for at studere RGC tab på senere tidspunkter. Derfor er vores protokol er ideel til undersøgelser fokuserede på tidlige patofysiologiske forandringer, der korrelerer med beskedne RGC neurodegeneration som er relevante for debut og tidlig progression i menneskelig glaukom.
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.
Puller | Narishige | PC-10 | |
Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/mL. Store at 4°C. |
Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
25 mL serological pipet | Costar | 4489 | |
Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
P1000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
Microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690 | |
P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
0.2 mL PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
Ketamine | Controlled substance | ||
Xylazine | Bayer Healthcare | ||
Acepromazine | Vetoquinol | ||
U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
Balance | Ohaus | CS 200 | |
Buprenorphine | Controlled substance | ||
Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
Dissection tools | |||
Small brush | |||
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
Aluminum foil | |||
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |