Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרום ליתר לחץ דם עינית בעין murine שתוצאתו אובדן תאי הגנגליון ברשתית כפי שנצפה גלאוקומה. microbeads המגנטי מוזרק לתוך החדר הקדמי ומשך לזווית iridocorneal שימוש במגנט כדי לחסום את היצוא של הומור מימי.
Abstract
השימוש במודלים של מכרסמים של גלאוקומה כבר חיוני כדי להבין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות multifactorial זה. עם כניסתו של קווי עכבר מהונדסים רבים, יש עניין גובר במודלי Murine מושרים של יתר לחץ דם עיניים. כאן, אנו מציגים מודל חסימה של גלאוקומה מבוסס על הזרקה של microbeads המגנטי לתוך החדר הקדמי של העין באמצעות microneedle שונה עם שיפוע facetted. Microbeads המגנטי נמשך לזווית iridocorneal באמצעות מגנט כף יד כדי לחסום את ניקוז הומור מימי מן החדר הקדמי. הפרעה זו בתוצאות דינמיקה מימיות בתוך התעלות מתמדת של לחץ תוך עיניים, אשר לאחר מכן מוביל לאובדן של תאי גנגליון רשתית, כפי שנצפה בחולי גלאוקומת אדם. מודל חסימת microbead שהוצג בכתב היד הזה הוא פשוט בהשוואה לדגמים מושרים אחרים של גלאוקומה גם מאודיעיל לשחזור. חשוב לציין, השינויים המוצגים כאן למזער בעיות נפוצות לעתים קרובות עולות במודלי חסימה. ראשית, השימוש microneedle מזכוכית משופעת מונע זרימה חוזרת של microbeads ומבטיח כי נזק מינימלי מתרחשת לקרנית במהלך ההזרקה, ובכך להקטין תופעות הקשורות לפציעה. שנית, השימוש של microbeads המגנטי מבטיח את היכולת למשוך החרוזים ביותר לזווית iridocorneal, ובכך מפחית ביעילות את מספר החרוזים צפים בלשכה הקדמית הימנעות ממגע עם מבנים אחרים (למשל., איריס, עדשה). לבסוף, שימוש מגנט כף יד מאפשר גמישות בעת טיפול בעין העכבר הקטנה לכוון את microbeads המגנטי ביעילות להבטיח שיש ריפלוקס הקטן של microbeads מהעין כאשר microneedle היא נסוגה. לסיכום, מודל עכבר חסימת microbead המוצג כאן הוא כלי מחקר רב עצמה כדי לחקור שינויים ניווניות המתרחשים במהלך ההתפרצות וההתקדמות של גלאותִרדֶמֶת.
Introduction
גלאוקומה היא מחלה מסנוורת מתקדמת ובלתי הפיכה שתשפיע כ -80 מיליון אנשים ברחבי עולם עד שנת 2020 1. בחולי גלאוקומה, אובדן ראייה נגרם על ידי מותו סלקטיבית של תאי הגנגליון ברשתית (RGCs), הנוירונים פלט המעבירים מידע חזותי מן מהרשתית אל המוח. גלאוקומה היא מחלה ניוונית של מערכת עצבים הקשורות לגיל עם גורמי סיכון רבים אשר הנפוץ ביותר היא לחץ תוך עיני מוגבר (IOP). ואכן, IOP הוא גורם הסיכון הניתנים לשינוי רק גלאוקומה טיפולים שוטפים להתמקד אך ורק בניהול הלחץ בעין. עם זאת, גורמים גנטיים, הסלולר, וסביבתיים מרובים המשפיעים על ההופעה והתקדמות של המחלה הזאת. לכן, הבנת המנגנונים השונים שבסופו של דבר לתרום ומוות עצבי חיוני לפתח טיפולים יעילים גלאוקומה.
במודלים של בעלי חיים של גלאוקומה חיוניים ללמוד פתופיזיולוגיה מחלות לזהות ולבדוקרפוי הבטיח. הזמינות הגוברת של קווי עכבר מהונדס כולל זנים בנוקאאוט מותנה עכברים שנשאו קליעים נותבים ניאון גנטית בקידוד הזניקה את הצורך מודלים גלאוקומה murine מושרה. במודלים של מכרסמים כמה גלאוקומה פותחו לאורך השנים (הנסקרת ב 2,3). ברבים מן המודלים האלה, גלאוקומה מושרה ע"י שיבוש דינמיקת הומור מימי, וכתוצאה מכך העלאת IOP. מודלים ספיגים, שבו microbeads או חומרים אחרים מוזרקים לתוך החדר הקדמי של העין לחסום ניקוז מימי, צברו פופולריות בשנים האחרונות בין היתר בשל הקלות היחסית שלהם להגדיל IOP 4-14.
מודל חסימת microbead של גלאוקומה, בצע לראשונה פרימטים 12, ארנבות 8, וחולדות 4,9,11, הותאם לאחרונה לשימוש בעכברים 5,6,10. במחקרים אלה, זריקת intracameral של microbeads פוליסטירן, לבד אובשילוב עם חומר viscoelastic, הביא העלאת IOP מוביל 6,10 למות RGC שלאחר מכן. עם זאת, ריפלוקס כשהמחט היא נסוגה מן העין ומן הפירוק של microbeads מזווית iridocorneal הן בעיות נפוצות המתעוררות במהלך ההליך. כדי למזער את החסרונות האלה, מגנטים שימשו כדי למשוך את microbeads מגנטי לזווית iridocorneal של העין 4,9.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא הליך שונה בהתבסס על מחקרים קודמים 9,10 המשתמש microbeads מגנטי מגנט כף יד מותאמי עין העכבר (איור 1). כמה משינויים מהותיים הוכנסו בפרוטוקול שלנו על מנת להבטיח עליית IOP יעילה לשחזור בעכברים. ראשית, הזרקה של microbeads נעשה באמצעות microneedle זכוכית שהוכן בקפידה עם שפוע facetted. משטחי החלקים וכתוצאה מכך של microneedle וכן הקצה המחודד שלה מבטיח כי ניזק מינימאלי הואשנגרם כפי שהוא מנפץ את הקרנית. השימוש microneedle זכוכית פעולה זו גורמת גם שליטה מוגברת כאשר קצה microneedle נכנס לתא הקדמי, ובכך להפחית את הסיכון של מבנים סמוכים תהליכים מזיקים כגון הקשתית ואת העדשה. בנוסף, נגע ההזרקה הזעיר הופך לפשוט תיקון עצמי קרני ומפחית תופעות הקשורות פגיעה בלתי רצויות.
שנית, ההזרקה של microbeads המגנטי ושימוש מגנט כף יד מאפשרים שליטה מדויקת כדי למשוך את החרוזים לזווית iridocorneal בעיני העכבר הקטנות. microbeads מגנטי כי הם 4.5 מיקרומטר בקוטר היו בשימוש בגלל גודל microbead זה לא לסתום את פתח microneedle המוכן חשוב, פעם מוזרקת, microbeads אלה ביעילות חסם את ניקוז הומור מימי. גישה זו לא רק מפחיתה ריפלוקס של microbeads המוזרק, אלא גם מבטיחה כי מספר מרבי של microbeads מצטבר באזור היעד לחסום ניקוז הומור מימי ביעילות. Furthermore, אסטרטגיה זו גם מפחיתה את מספר החרוזים צפים בלשכה הקדמית הימנעות ממגע עם מבנים אחרים, כמו אירוס ואת העדשה, ומעבר מניעה לתא האחורי. ביחד, שינויים אלה להבטיח כי ניתוח הזרקת microbead מתבצע בקלות יחסית במועד וכתוצאה מכך אינדוקציה לשחזור, יעילה מאוד, ומתמשכת של יתר לחץ דם עינית בעכברים.
Protocol
ההליך הבא בוצע בהתאם להנחיות המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים עבור השימוש בחיות מעבדה ואת הדוח והשימוש בחיות ב רפואת עיניים והמחקר חזותי מהאגודה לחקר חזון העיניים (Arvo).
1. הכנה של microneedle עבור הזרקת Anterior Intracameral
- עם חולץ, ליצור microneedle מתוך נימי זכוכית בורוסיליקט
- תחת מיקרוסקופ, השתמש להב חד לברוא פתח בזהירות את קצה microneedle. הפתיחה וכתוצאה מכך צריכה להיות צורה האליפטית בקוטר ציר ראשי ומשניות של כ 190 מיקרומטר ו 70 מיקרומטר, בהתאמה. למדוד את השטח של פתח microneedle שהכין תמונות רכישה ראשונות עם סרגל הממוקם מתחת למיקרוסקופ ואחריו כימות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
- במערכת micropipette bevelling, למקם את microneedle בכל degre 20דואר ביחס זווית לצלחת bevelling כך פתח microneedle נוגע צלחת. שפוע למשך כ -10 דקות עד הקצוות הם שטוחים וחלקות. הוסף כמה טיפות של מים מזוקקים כדי לסייע בתהליך.
- סובב את microneedle שפוע שני קצוות סביב הפתיחה עד הקצה חד.
- פסולת ומים נקיים כל מפתיחת טיפ microneedle באמצעות מטלית בתרסיס.
- לבחון היטב את microneedle המוגמר תחת מיקרוסקופ. microneedles מחק עם שברים כדי למזער את הסיכון של שבירת microneedle במהלך הניתוח.
- לעקר את microneedle על ידי השטיפה ראשונה עם אתנול, ולאחר מכן עם תמיסת מלח מאוזנת סטרילי (BSS).
2. הכנת פתרון Microbead המגנטי
הערה: microbeads המגנטי המשמש במחקר זה הוא מצופה קבוצות אפוקסי. כדי למנוע תופעות לוואי, כגון התקבצות של חרוזי אינטראקציות מולקולריות רצויות, קבוצות אפוקסי אלה חייבותראשון יוסר microbeads לפני שתמשיך עם ניתוח ההזרקה.
- הסרת קבוצות אפוקסי מן חרוזים מגנטיים
- הכן פתרון של 0.02 M נתרן הידרוקסידי (NaOH, MW 39.997 g / mol) במאגר 10x טריס (MW 121.14 g / mol).
- בעדינות וורטקס המניות של פתרון microbead מגנטי (4.5 מיקרומטר קוטר, 4 x 10 8 חרוזים / מ"ל) עד חרוזים מושעים באופן שווה בתמיסה.
- במהירות pipet 1 מ"ל של תמיסת חרוז המגנטי לתוך 50 מ"ל של 0.02 M NaOH ב 10x טריס חיץ.
- סבוב במשך 24 שעות ב RT להסיר את הקבוצות אפוקסי מן החרוזים.
- לאסוף את החרוזים על ידי הבטחת מגנט אל החלק התחתון של הצינור. אוריינט הצינור אופקי כדי להבטיח כי כל החרוזים נמשכים המגנט. סבוב במשך שעה 4 נוספת ב RT.
- עם micropipette, להסיר את supernatant בזהירות מבלי להפריע גלולה של חרוזים.
- בעדינות מערבולת גלולה ב 50 מ"ל של 10x TRIS חיץ עד החרוזים מושעים היטב.
- חזור על שלבים 2.1.4 עד 2.1.6.
- הריכוזיות Resuspension של microbeads מגנטית פתרון סטרילי מאוזן מלח
הערה: יש צורך לרכז את המניות של פתרון חרוז מגנטי תמיסת מלח מאוזן סטרילי (BSS) להגיע לריכוז סופי של 1.6 x 10 6 חרוזים / μl כך 2.4 x 10 6 חרוזים ניתן להזריק לתוך החדר הקדמי בבית נפח סופי של 1.5 μl, אשר מתאים עין העכבר הקטנה.
- לשטוף את החרוזים 5 מיליליטר מי כיתת מעבדה טהורים על ידי vortexing בעדינות במשך 2 דקות.
- לאסוף את החרוזים על ידי משיכת אותם לתחתית של התחתית עם מגנט.
- עם micropipette, בזהירות להסיר את המים מבלי להפריע גלולה של חרוזים.
- חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.3 עוד שלוש פעמים.
- במנדף זרימה למינרית, לשטוף את החרוזים עם 500 μl של BSS על ידי pipetting למעלה ולמטה. בצע את השלבים הנותרים בסעיף זה בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
- לאסוף את החרוזים על ידי משיכת אותם לתחתית של התחתית עם מגנט.
- עם micropipette, להסיר בזהירות את BSS מבלי להפריע גלולה של חרוזים.
- חזור על שלבים 2.2.5 עד 2.2.7 עוד שלוש פעמים.
- Resuspend ידי pipetting החרוזים מעלה ומטה 250 μl של BSS.
- ודא כי הפתרון החרוז הוא גם הומוגני. ואז, במהירות aliquot 25 μl של ההשעיה לתוך 0.5 סטרילי צינורות מ"ל. הריכוז הסופי של פתרון חרוז המניות הוא 1.6 x 10 6 חרוזים / μl.
- חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. אינדוקציה של יתר לחץ דם Ocular
הערה: סעיף 3 הוא פעולה דו-אדם. במקרה שפעולה מסוימת היא להתבצע על ידי אדם מסוים, מזוהה האדם המתאים. באופן כללי, אדם 1 מטפל העכבר מתחת למיקרוסקופ בעוד אדם 2 הוא responsible מניפולציה המשאבה microsyringe. משך הלימוד הכולל של ההליך הכירורגי צריך להיות פחות מ -10 דקות (שלבי 3.9 כדי 3.17).
- בצע את ההליכים ב C57BL מבוגרים / 6 עכברים. עכברי בית בסביבה רגילה עם גישה כרצונך מזון ומים. במאמר זה, להשתמש נקבות עכברים C57BL / 6 בין 3 ל 4.5 חודשים של גיל. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להתאים זכרי עכברים בגילים שונים, כמו גם זני עכבר אחרים, כוללים עכברים מהונדסים בנוקאאוט.
- מדוד IOP בסיס ער עכברים לפני זריקת הרדמת microbead באמצעות tonometer ריבאונד מכויל. החל טיפה אחת של hydrochloride proparacaine על הקרנית.
- בעדינות לרסן את העכבר על ידי לחיצה על העור בין האוזניים. מניח את העכבר על benchtop כדי שבעל החיים הם נוחים בעיני נגישות. החזק את tonometer בניצב לפני השטח של הקרנית ולקחת לפחות שלושה סטים של עשר קריאות רצופות לכל עין כדי להשיגממוצע IOP. המדידה של IOP בעכברים ערים הוא העדיף לעקוף תופעות הקשורות הרדמה על IOP. לחלופין, IOP ניתן למדוד בעכברים anesthetised לאחר שלב 3.4.
- הכינו תערובת הרדמה קוקטייל עכבר המניות מורכב 20 מ"ג / מ"ל קטמין, 2 מ"ג / מ"ל xylazine, ו acepromazine 0.4 מ"ג / מ"ל.
- להשרות הרדמה בתוך העכבר על ידי הממשל intraperitoneal של תערובת קוקטייל (1 μl / גרם של משקל הגוף). שימוש קוקטייל הרדמה בזריקות עדיף על פני הרדמת גז (למשל, isoflurane) כי זה מאפשר גמישות בעת טיפול ראש העכבר כמו החיה אינה מחוברת מסיכת אינהלציה. בנוסף, תקופת ההחלמה נדרשת עוד עם הרדמה בזריקות מבטיחה כי microbeads להסתפק בזווית iridocorneal ללא פירוק בחזרה לתוך החדר הקדמי.
- נהל 0.05 מ"ג לכל ק"ג ממשקל הגוף של תת עורי עצירות.
- פנקו את העין עם EY tropicamideדואר לרדת ל לגרום הרחבת אישון. בשל גודלו הקטן של החדר הקדמי בעכברים, חייב להיות מורחב התלמיד לדמיין את המיצוב וקידום בקלות של microneedle במהלך הזרקה.
- החל משחה אקטואלית על העין הנגדית (בלתי פעלו) כדי למנוע התייבשות של הקרנית במהלך ההליך.
- צרף microneedle נקי אל מכלול הזרקה של המשאבה microsyringe. החזר את microneedle לאחר כל פעולה כדי למנוע זיהום חיה נגדית.
- אדם 1: העברת העכבר anesthetised לפלטפורמת ההפעלה. מתחת למיקרוסקופ, להבטיח כי התלמיד פתיחה מלאה וכי שרירי העין רגועים כך שאין תנועות עיניים. עדר תנועות עיניים מבטיח יציבות במהלך ההזרקה. נגב בעדינות את טיפות עיניים tropicamide מהעין בעזרת מקלוני סופג.
- אדם 2: מערבבים את הפתרון microbead מגנטי על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- באמצעות המשאבה microsyringe, מיד לטעון את microneedle (מוכן בסעיף 1) עם 1.5 μl של פתרון microbead מגנטי הומוגני (2.4 x 10 6 חרוזים). ודא כי בועות האוויר נעדרות בקצה של microneedle. אחרי microneedle נטען, לבצע צעדים 3.12 כדי 3.13 מהר ככל האפשר, כך הפתרון microbead המגנטי נשאר השעיה הומוגנית.
- מקם את microneedle הטעון בזווית של 45 מעלות, להציב קדמי ביחס לימבוס. אדם 1: לתמוך העין באמצעות מלקחיים פלסטיק. ודא כי הזווית בין microneedle ואת מלקחי הפלסטיק היא כ 90 מעלות.
- אדם 2: עם microneedle הטעון, בעדינות לנקב את הקרנית כך קצה microneedle נכנס לתא הקדמי. ודא כי microneedle טעון נשאר קרוב משפחה בזווית של 45 מעלות כדי לימבוס במהלך לנקב. להימנע מכל מגע עם העדשה או הקשתית. ודא כי microneedle לא להיכנס לחדר האחורי. אדם 1: ממשיך לתמוך העיןבאמצעות מלקחיים פלסטיק.
- אדם 1: מבלי להזיז את ראש העכבר, למקם את המגנט ליד העין, מול אל קצה microneedle, כדי למשוך את החרוזים המגנטיים לתוך החדר הקדמי ולמזער קשר של החרוזים עם המשטח הפנימי של הקרנית. אדם 2: שימוש המשאבה microsyringe, להזריק 1.5 μl של פתרון חרוז המגנטי לתוך החדר הקדמי. פתרון microbead מוזרק על פני תקופה של 15 עד 30 שניות. אדם 1: המשך להחזיק את ההיפך מגנט אל קצה microneedle במהלך כל תקופת ההזרקה.
- אדם 2: לאחר הווליום של חרוזים כבר הזריק, לאט למשוך את microneedle מהעין. אדם 1: כדי למנוע רפלוקס של microbeads, ממשיך למשוך את החרוזים המגנטיים לכיוון החדר הקדמי על ידי לחיצה על המגנט ליד העין תחת 30 עד 60 שניות נוספות.
- אדם 1: השתמש במגנט, למשוך את החרוזים לזווית iridocorneal. ודאו חרוז ליצור לולאה מופצת באופן שווהסביב ההיקף של הלשכה הקדמית. במהלך שלב זה, לא למשוך חרוזים לקרנית כמו שיש להם נטייה להסתגר בתוך המשטח הפנימי של הקרנית לנוגע בהם.
- פנק את העין פעלה עם טיפות עיניים אנטיביוטיות כדי למזער את הסיכון לזיהום.
- אפשר העכבר כדי להתאושש על כרית חום עד ער לחלוטין (~ 3 עד 4 שעות). מניח את העכבר, כך העין פעלה פונה מעלה. מיצוב זה ימנע הצטברות של החרוזים המוזרקים אל פני השטח הפנימיים של הקרנית על ידי כוח משיכה. בנוסף, עמדה זו תקטין את הפוטנציאל לזיהום כמו העין פעלה לא תהיה במגע עם מצעים כלשהם ו / או חומרים אחרים שעשויה להיות נוכח בתוך הכלוב. במקרה שבעל חיים מציגים כל סימן של מצוקה, לנהל מנות נוספות של עצירות לפי צורך.
- אפשר עכברים להתאושש נוהל לפחות 2 ימים לפני נטילת מדידות לחץ תוך עיני. מדוד IOP כמתואר 3.2. מוניםהטור IOP לפחות פעם בשבוע או בתדירות גבוהה יותר, לפי צורך, ובאותו הזמן של היום כדי לצמצם תנודות יממה קשורה.
- עבור מדידות לחצו תוך עיניים, להשתמש בעין הנגדית מן העכבר פעל שליטה פנימית. לחלופין, להשתמש מדידות שלמות, שאינה מופעל או עכברי דמה מופעלים שולטים נאיבית.
4. גנגליון הערכת רשתית סומה תא אקסון הישרדות
- Perfuse עכברים נתון יתר לחץ דם עינית בזריקה intracardial של פתרון חיץ פוספט 0.1 M (PBS) ומיד אחריו paraformaldehyde 4% קר כקרח (PFA).
- Perfuse ללא פגע, עכברים שאינם מופעלים כמתואר 4.1 ולהשתמש בהם שולטת וללא כל פגע. שימוש עיניים נגדיות מעכברים מופעלים אינו מומלץ להעריך הישרדות RGC בגלל שינויים בעיניים נגדיות בעקבות פציעה דווחו 15,16 ויכולים לבלבל נתונים לפרשנות. לחלופין, להשתמש בעיני דמה מופעלים הזריקו 1.5 Μl של BSS כקבוצת ביקורת.
- שימוש microscissors, לחתוך את רקמת החיבור בזהירות סביב העין כדי לבודד אותו מתוך ארובת העין. הפרד את עצב הראייה מן העין על ידי חיתוך זה ברמה של ראש עצב הראייה.
- באמצעות מחט 30 G, לעשות חור בתוך הקרנית כדי לאפשר חדירה של הפתרון מקבע לתוך העין. מניחים את העין PFA 4% ו דגירה במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבעון נוסף.
- מניחים את עצב הראייה בתמיסה המכילה 2% PFA ו glutaraldehyde 2.5% ב 0.1 M נתרן cacodylate (MW: 214 g / mol) ו דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבעון נוסף.
5. כימות צפיפות סומה RGC על רשתיות שטוחות רכובות
הערה: ההליך הבא מותאם פרוטוקול ידי נדאל-ניקולא ואח '17 ומתווה כימות של RGCs באמצעות נוגדן נגד 3A חלבון מושלם המוח ספציפיים homeobox / Pou (Brn3a) על-mounts שטוח רשתית.. ספיד אלטרנטיביods עבור RGCs תיוג יכול לשמש גם כולל אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן כנגד חלבון קושר RNA עם שחבור מרובים (RBPMS) או תיוג מדרדר עם Fluorogold או DiI.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, הוצא את החלק הקדמי של העין על ידי ביצוע חתך לאורך לימבוס כולו עד קרנית מנתק בקלות. הסר את הקרנית ואת העדשה. בזהירות לנתק את הרשתית מהעין על ידי ביצוע חתכים לאורך serrata אורה ועצב הראייה.
- כן שטוח הר רשתית על ידי ובסך הכל ארבעה חתכים במרחק שווים קטנים מהפריפריה של הרשתית לכיוון עצב הראייה להתוות הרביעים רשתית הארבעה בבירור. בעזרת מברשת קטנה, להסיר כל זגוגי הנותרים בעדינות מהרשתית. הסרת ההומור זגוגי ככל האפשר היא חיונית עבור קבלת אות immunohistochemical נקיה וחזקה.
- להעביר בזהירות את הרשתית לצלחת תרבות 48-גם שטוח תחתונה המכילה 0.5% Triton X-100 ב PBS כך הרשתית היא"פנויות". ודא שכבת תא גנגליון פונה מעלה.
- מניחים את הצלחת התרבות ב -70 ° C. במשך 15 דקות. לאחר הפשרת הרשתית, Permeabilize נוסף על ידי שטיפה פעמים 2% טריטון X-100 הטריים PBS.
- לדלל את הנוגדן Brn3a 0.3 - 0.5 מיקרוגרם / מ"ל עם PBS המכיל 2% טריטון X-100 ו -2% חמור בדם נורמלי. דגירה הרשתית בפתרון נוגדן ראשוני Brn3a ידי ניעור O / N בעדינות על 4 מעלות צלזיוס. הרשתיות צריכות להיות שקועות לחלוטין 150 עד 200 μl של פתרון בכל העת.
- לדלל את נוגדנים משני IgG חמור נגד עז עד 2 מיקרוגרם / מ"ל עם PBS המכיל 2% טריטון X-100 ו דגירה הרשתית בפתרון זה עבור שעה 2 ב RT עם רעד עדין. הרשתית צריכה להיות שקועה לחלוטין בפתרון הנוגדן בכל העת. מכסים את הצלחת תרבות עם רדיד אלומיניום עבור השלבים הנותרים כדי למנוע photobleaching.
- בעזרת מברשת, להעביר את הרשתית בזהירות לשקופית כך הרקמות טמונות שטוחות כמו קופהsible. אוויר יבש במשך 10 דקות. הר באמצעות הרכבה בינונית אנטי לדעוך.
- בדוק את-mounts שטוח ברשתית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכמת את מספר RGCs החיובית Brn3a בשלושה תחומים שאינם חופפים לכל ברבע רשתית כמתוארת. 18
6. כימות RGC אקסונים על חתכי רוחב עצב הראייה
- אסוף את עצב הראייה משלב 4.5 ו דגירה tetroxide אוסמיום 2% (OSO 4, MW 254.23 g / mol) עבור 2 שעות.
זהירות: בשל רעילות גבוהה, tetroxide אוסמיום צריך להיות מטופלים במנדף עם לבוש מעבדה המתאים. - מייבשים את עצב הראייה על ידי טבילה אותו ריכוז גדל והולך של אתנול (50%, 70%, 90%, 95% ו -100%) במשך 15 דקות כל אחד.
- הכן את שרף אפוקסי באמצעות המתכון הבא: 15.72 מ"ל שבץ-812, 6.45 מ"ל dodecenyl אנהידריד succinic, 7.83 מ"ל nadic מתיל אנהידריד, 0.45 מ"ל DMP-30.
- ברצף דגירת עצב הראייה בפתרונות המורכבמהיחסים הבאים של שרף אפוקסי פרופילן אוקסיד (MW 58.08 g / mol): 0: 1, 1: 1, 0.75: 0.25, ו 1: 0. עצב הראיה הוא מודגרות בכל פתרון ב RT ב- O / N תקופה.
- דגירה עצבי הראייה מוטבע שרף אפוקסי 100% (השלב האחרון מ -6.4) ב 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות נוספות.
- צור חתכי עצב ראייה דקים חצי (0.75 מיקרומטר) באמצעות microtome.
- כתם חתכי עצב ראייה עם toluidine כחול 1%.
- לכמת את אקסונים RGC בחמישה תחומים שאינם חופפים של כל מקטע עצב הראייה כפי 19 תיאר.
Representative Results
ההזרקה של microbeads המגנטי לתוך החדר הקדמי של עכברים בוגרים המתואר בפרוטוקול זה הביאה העלאה חזקה לשחזור של IOP. שבוע לאחר ההליך, IOP עלה מ 10 ± 0.6 מ"מ הכספי (ממוצע ± SEM), את IOP הבסיס הממוצע בעיניים נגדיות, עד 19 ± 0.5 מ"מ כספית בעיני יתר לחץ דם (t של הסטודנט -test; *** p <0.001, n = 12, טבלה 1, איור 2). IOP התייצב ואילך ונשאר גבוה בקצב ממוצע של 20 מ"מ כספית במשך לפחות 6 שבועות, בחנו זמן הנקודות הארוכות במחקר זה. IOP השיא הממוצע בעיניים מוזרקות microbead ב 2, 3, ו -6 שבועות לאחר הניתוח היה 25 מ"מ כספי. הרוב המכריע של עכברים שטופלו שפותח IOP הגבוה מתמשך, ולכן פרוטוקול זה אינו מחייב זריקה שנייה של microbeads.
כדי להעריך את מהלך הזמן של אובדן RGC במודל זה, סומה RGC היוראשון לכמת ידי immunostaining עם Brn3a, סמן ספציפי RGC 17. מספר התאים Brn3a החיובי היה לכמת על רשתיות שטוחות רכוב על 1, 2, 3 ו -6 שבועות לאחר הגיוס של יתר לחץ דם עיניים. למרות העלאת IOP משמעותית זוהתה מוקדם ככל 1 שבוע לאחר הזרקת microbead, ללא אובדן משמעותי של סומה RGC נצפה בתוך 2 השבועות הראשונים של ההליך (איור 3). RGC מוות משמעותי (22%), לעומת זאת, בא לידי ביטוי גם 3 שבועות (2,430 ± 67 RGCs / מ"מ 2, ממוצע ± SEM, n = 12) ו -6 שבועות (2,350 ± 74 RGCs / מ"מ 2, n = 10) פוסט אינדוקציה של יתר לחץ דם עינית, לעומת עיניים מלאות שלמים מעכברי un מופעל (3,141 ± 49 RGCs / מ"מ 2, n = 23) (ANOVA, p <0.001).
חוסר תפקוד וניוון של אקסונים RGC הוא תכונת קרדינל של גלאוקומה. לכן, אובדן axonal נבדק ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead ידיכימות של אקסונים RGC בחיתוכי עצב ראייה מוכתמים toluidine הכחול (איור 4). הפסד משמעותי של אקסונים RGC (25%) נצפתה ב 3 שבועות (28,401 ± 702 אקסונים / עצב, ממוצע ± SEM, n = 5) ו -6 שבועות (29,426 ± 948 אקסונים / עצב, n = 6) לאחר ההזרקה של microbeads לעומת עצבים שלא ניזוקו אופטיים מעיני מופעלי האו"ם (39,467 ± 137 אקסונים / עצב, n = 4) (ANOVA, p <0.001). ביחד, נתונים אלו מראים כי הזרקה של microbeads המגנטי לתוך תא עכבר הקדמי מוביל לשחזור מתמשך גובה IOP שתוצאתו soma RGC וניוון האקסון.
| זמן לאחר ניתוח OHT | N | לחץ תוך עיני ממוצע (מ"מ כספית) ± SEM | שיא IOP (מ"מ כספית) | ||||
| נגדי | בַּרקִית | difference | נגדי | בַּרקִית | |||
| שבוע 1 | 12 | 10 ± 0.4 | 19 ± 0.5 | 9 ± 0.6 | 12 ± 0.4 | 22 ± 0.6 | |
| 2 שבועות | 13 | 11 ± 0.5 | 20 ± 0.8 | 9 ± 0.5 | 12 ± 0.9 | 25 ± 0.7 | |
| 3 שבועות | 10 | 11 ± 0.8 | 20 ± 0.7 | 10 ± 0.9 | 13 ± 0.2 | 25 ± 0.9 | |
| 6 שבועות | 12 | 12 ± 0.5 | 20 ± 0.6 | 9 ± 0.7 | 13 ± 0.5 | 24 ± 0.6 | |
העלאת טבלה 1. הלחץ התוך עיני בבית Occlusi Microbead מגנטי Murineעל דגם. בשנת נקבה ערה C57 BL / 6 עכברים, IOP נמדדו באמצעות tonometer ריבאונד מכויל. עיניים מופעלות מוצגות עלייה בלחץ תוך עיניים זוהתה שלאחר ניתוח שבוע שנותרה גבוה במשך שישה שבועות לפחות לאחר ההליך.
באיור 1. Workflow של השלבים הכרוכים במודל של גלאוקומה ספיגה Microbead מגנטי Murine. צעד אחר צעד המתאר של כל ההליכים שבוצעו לפני, במהלך, ואחרי הניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הגדל איור 2. לחץ תוך עיני במודל ספיגה Microbead מגנטי Murine. ב ערC57 BL / 6 נקבות עכברים, IOP נמדדה באמצעות tonometer ריבאונד מכויל. IOPS עיניים מוזרק microbead היה גבוה משמעותי שלאחר ניתוח שבוע (ANOVA, p <0.001). IOPS נותר גבוה יחסית משמעותי לעין הנגדית של עכברים שהוזרקו במשך לפחות 6 שבועות (ANOVA, p <0.001). (שלמים: n = 12; 1 בשבוע: n = 12, 2 שבועות: n = 13, 3 שבועות: n = 10, 6 שבועות: n = 12). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. רשתית גנגליון תא מות הדגם הספיג Microbead מגנט Murine. RGCs היה דמיין ידי immunostaining של רשתית שטוחה רכוב באמצעות Brn3a רשתיות שליטות ללא פגע (א) רשתיות גלאוקומה קשות ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead להשרותיתר לחץ דם עינית (OHT) (B, C). ברי סולם: 20 מיקרומטר. (ד) ניתוח כמותי אישר כי הזרקת microbead הביא לאובדן soma משמעותי RGC ב 3 ו 6 שבועות לאחר ההליך לעומת שליטה העיניים. הצפיפות של סומה RGC פנימה בשלמותו, הלא גלאוקומת C57 / עכברי BL6 מוצגת כנקודת התייחסות (פסים לבנים, 100% הישרדות). ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM (Intact: n = 23; 1 בשבוע: n = 6, 2 שבועות: n = 6, 3 שבועות: n = 12, 6 שבועות: n = 10, ANOVA, *** p < 0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. אקסונלית ניוון במודל ספיגה Microbead מגנטי Murine. אקסונים RGC היו דמיינו ידי מכתים של חתכים עצב הראייה עם toluidine כחול בשליטה ללא פגע (א) רשתיות גלאוקומה קשות ב 3 ו 6 שבועות לאחר הזרקת microbead לגרום ליתר לחץ דם עינית (OHT) (B, C). ברי סולם: 10 מיקרומטר. (ד) ניתוח כמותי אישר כי הזרקת microbead הביא לאובדן האקסון RGC משמעותי בשבועות 3 ו -6 לאחר ההליך לעומת שליטה העיניים. הצפיפות של אקסונים RGC פנימה בשלמותו, הלא גלאוקומת C57 / עכברי BL6 מוצגת כנקודת התייחסות (פסים לבנים, 100% הישרדות). ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± SEM (Intact: n = 4; 3 שבועות: n = 5, 6 שבועות: n = 6, ANOVA, *** p <0.001). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
Discussion
טכניקת הווידאו המובאת כאן מספקת מפורטות צעד אחר צעד הוראות כיצד לבצע הזרקת intracameral של microbeads המגנטי ביעילות reproducibly לגרום העלאת IOP בעכברים. תוצאות הליך זה ב עלייה מתמשכת IOP שאינה דורשת זריקות נוספות ומקדם soma RGC לגילוי ואובדן האקסון בתוך 3 השבועות הראשונים של יתר לחץ דם עינית induction.Elevated IOP הוא גורם סיכון עיקרי לפיתוח גלאוקומה בבני אדם. לכן, זהו מודל גלאוקומת יתר לחץ דם תלוי עינית murine ערך כי יש פוטנציאל עבור מגוון רחב של יישומים.
חסרון נפוץ הקשורות הזרקת microbeads לתוך החדר הקדמי מתייחס חרוז ריפלוקס באמצעות זריקת כשהמחט היא נסוגה, עלולה לגרום לחסימה חלקית בלבד של יצוא מהימי ולהבדלים מוגברים. כדי לטפל בבעיה זו, כמה משינויים מהותיים יושמו. firs t, ההכנה הקפדנית של microneedle זכוכית נקיה, חד עם שפוע facetted חיוני הזריקה המוצלחת של microbeads. Microneedle הוכן כראוי מאפשר חדירה מבוקרת וחלקה של הקרנית עם יישום מינימאלי של לחץ על פני השטח של עין העדינה. לנקב קרנית הקטנה מונע זרימה חוזרת של microbeads. בנוסף, microneedle המיקרוסקופי מפחית את הסיכון של מבנים סמוכים תהליכים מזיקים כגון קשתית ואת העדשה, אשר עלול לגרום דלקת שאינה קשור למחלה. שנית, הבקשה של מגנט כף יד לאזורים עיניים אסטראטגי במהלך ואחרי ההזרקה עוד היבט קריטי של הטכניקה הזו. במהלך ההזרקה, המגנט משמש כדי למשוך את microbeads המגנטי ריפלוקס מניעת הלשכה הקדמי של microbeads כאשר microneedle היא נסוגה. לאחר הזריקה, המגנט מכן נעשה שימוש כדי לכוון את microbeads לזווית iridocorneal לחסום יצוא הומור מימי.
אוהל "> בעיה נוספת נתקל לעתים קרובות במודלים חסימה microbead הוא כי זריקות חרוז חוזרות לעתים קרובות יש צורך להשיג מתמשכת IOP העלאת 10,11. זו עשויה להיות התוצאה של microbeads dislodging מהזווית iridocorneal עם הזמן. השילוב של מגנט כף יד, כמתואר לעיל, ואת המיקום של העכבר שלאחר ניתוח משפר באופן משמעותי את התוצאה. שימוש הרדמה בזריקות, המאפשרים גמיש כדי להזיז את הראש במהלך ההליך ודורש תקופת החלמה שלאחר ניתוח ארוך יותר, הוא מועדף. מיקום של עכבר בעין המופעלת כלפי מעלה במשך כמה שעות לאחר הניתוח תורם ליישוב microbeads בזווית iridocorneal ומפחית את הסיכון של פירוק בחזרה לתוך החדר הקדמי.הבטחה כי מספר החרוזים המוזרקים הוא יחסית עקבי היא עוד שלב קריטי כדי למזער וריאציות בין-חיה. מאז microbeads להתיישב בבית בottom של הצינור, יש צורך homogenize פתרון microbead המלא ולסגת הנפח המתאים לתוך microneedle מבעוד מועד. הזרקה של חרוזים פחות לתוך החדר הקדמי עלולה לגרום לחסימה החלקית של מבני ניקוז הומור המימיים, אשר צפוי לגרום העלאת IOP עניה או משתנית. מן הראוי לציין כי, למרות המטרה הסופית של הזרקת microbead היא לרומם IOP, יש לנקוט זהירות כאשר מדידות לחץ תוך עיני מעכברים ער גבוהים יותר מאשר ערכי השיא שדווח במחקר זה (~ 25 מ"מ כספית). IOPS גבוהה מאוד להגדיל את הסיכון לנזק איסכמי עלולים גם הם לגרום כאב לחיה. את העלאתו של IOP צריכה להיחשב כאחד גורמים רבים להעריך את ההצלחה של הניתוח. ככזה, התוצאה של ההליך צריך תעיד מבוסס על מספר פרמטרים ובכלל זה העלאת IOP, מוות soma RGC, ואובדן האקסון.
אף על פי הפרוטוקול המתואר כאן תוצאות ברוב microbeads מוצלחly ליישוב בזווית, מגבלת פוטנציאל של מודל זה היא כי חרוזים אלה שנותרו צף החדר הקדמי עלולים להפריע הדמית רשתית חייה דרך הקרנית, כמו גם מבחני אלקטרו או התנהגותיים הדורשים מעבר של אור יעיל. היבט חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון בעת ניצול מודל חסימה microbead זו היא כי מידת הגובה IOP וניוון RGC עוקבות משתנה עם גיל ורקע הגנטי של העכבר פעל [4]. לכן, במידה של העלאת IOP ואת ציר הזמן של ניוון RGC יהיה צורך שנקבע לכל קו עכבר מהונדס ספציפיים ו / או טווח הגילאים.
אחד מאפיינים של מודל זה הוא שתוצאות IOP גבוהות לאובדן ההדרגתי של מות RGC במהלך שלושת השבועות הראשונים לאחר הזרקת microbead, ומות RGC משמעותי מזוהות ב 3 שבועות לאחר ההליך. לפיכך, מודל זה מאפשר בחינת שינויים מוקדמים ו / או עדינים המתרחשים ד זהisease, לפני גלויים soma RGC ואובדן האקסון. עלייה משמעותית למות RGC לא נצפתה בין 3 ו -6 שבועות לאחר הגיוס של יתר לחץ דם עיניים. למעשה, אובדן סומה האקסון RGC נותר יציב ברמה של ~ 22 - 25% בין 3 ל -6 שבועות למרות מוצלח ומתמשך העלאת IOP בנקודות זמן אלה. משכו זמן ארוך יותר של IOP המתמשכת עשוי להידרש אובדן RGC נוסף להתרחש C57BL / 6 עכברים, שכפי הנראה להיות עמיד יותר בפני ניזקי RGC לעומת זני עכבר אחרים. 5 שינויים נוספים הפרוטוקול המובא כאן, לרבות התאמת גודל חרוז וזריקות נוספות, ייתכן שתידרש כדי ללמוד אובדן RGC בנקודות מאוחר יותר זמן. לכן, הפרוטוקול שלנו הוא אידיאלי עבור מחקרים התמקדו בשינויי pathophysiological מוקדם מתואמים עם ניוון מוחיה צנוע RGC אשר רלוונטיים התפרצות והתקדמות מוקדם גלאוקומת אדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P.
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
