Summary
ここでは、緑内障に観察される網膜神経節細胞の損失をもたらすマウスの眼の高眼圧症を誘発するためのプロトコルを提示します。磁性マイクロビーズは、前房に注入し、房水の流出を阻止するために磁石を使用して、虹彩角膜角に引き寄せられます。
Abstract
緑内障のげっ歯類モデルの使用は、この多因子性神経変性疾患の病態生理学の根底にある分子機構を理解するために不可欠でした。多数のトランスジェニックマウス系統の出現により、高眼圧症の誘導マウスモデルにおける関心が高まっています。ここでは、ファセットベベルで修飾されたマイクロニードルを使用して、眼の前房への磁性マイクロビーズの注入に基づいて、緑内障の閉塞モデルを提示します。磁性マイクロビーズは、前房からの房水の排出を遮断するために、ハンドヘルド磁石を用いた虹彩角膜角に魅了されています。ヒトの緑内障患者で観察されるように、その後、網膜神経節細胞の喪失につながる眼圧の安定した高さの水力学におけるこの混乱。この原稿で提示マイクロビーズ閉塞モデルも非常に他の誘導性緑内障のモデルと単純な比較され、効果的かつ再現可能。重要なことは、ここで提示さの変更は、多くの場合、閉塞モデルで発生する一般的な問題を最小限に抑えることができます。まず、面取りガラスマイクロニードルの使用は、マイクロビーズの逆流を防ぎ、傷害関連の影響を低減し、最小限のダメージが注入時に角膜に起こることを保証します。第二に、磁性マイクロビーズの使用は、効果的に他の構造（ 例えば 、虹彩、レンズ）との接触を回避する前房内に浮遊するビーズの数を減少させる、虹彩角膜角に最もビーズを引き付ける能力を確実にします。効率的に磁性マイクロビーズを指示し、マイクロニードルが引き抜かれるときに、目からマイクロビーズの小さな逆流があることを確認するために、小さなマウスの眼を取り扱う際は最後に、ハンドヘルド磁石の使用は柔軟に行うことができます。要約すると、ここで紹介するマイクロビーズ閉塞マウスモデルはglauの発症および進行中に発生する神経変性変化を研究するための強力な調査ツールです。コマ。
Introduction
緑内障は、失明は、網膜神経節細胞（RGC）の選択的な死によって引き起こされる、緑内障患者では。2020年1によって世界中で8千万人に影響を与える進行性で不可逆的な盲目状態であるから、視覚情報を伝達する出力ニューロン脳へ網膜。緑内障は、最も一般的な眼内圧上昇（IOP）である、多くの危険因子を有する年齢関連神経変性疾患です。確かに、IOPは緑内障でのみ修正可能なリスク因子であり、現在の治療法は、眼圧を管理するだけに焦点を当てます。しかし、複数の、遺伝的な細胞、および環境要因が、この疾患の発症および進行に影響を与えます。したがって、最終的には神経細胞死に貢献するさまざまなメカニズムを理解することは、緑内障のための有効な治療法を開発することが不可欠です。
緑内障の動物モデルは、疾患の病態生理を研究すると識別するために不可欠であるとテスト有望な治療薬。遺伝的にコード化された蛍光トレーサーを運ぶ条件付きノックアウト株とマウスを含むトランスジェニックマウス系統の可用性を高めるには、誘導性マウス緑内障モデルの必要性を推進しています。緑内障のいくつかのげっ歯類モデルは、（2,3に概説）、長年にわたって開発されてきました。これらのモデルの多くでは、緑内障は、眼圧の上昇が生じ、房水動態を破壊することによって誘導されます。マイクロビーズまたは他の物質が水性排出を遮断するために、眼の前房に注入された閉塞モデルは、IOP 4-14を増加させるために部分的にそれらの相対的な容易さ、近年人気を集めています。
最初の霊長類12で行わ緑内障のマイクロビーズ閉塞モデル、ウサギ8、およびラット4,9,11は 、最近マウス5,6,10における使用のために適合させました。これらの研究では、ポリスチレンマイクロビーズの房内注射、単独で、または中粘弾性材料との組み合わせが、その後のRGC死6,10につながるIOP上昇をもたらしました。しかし、針が虹彩角膜角からマイクロビーズの目と脱落から引き抜かれ還流が処置中に発生する一般的な問題です。これらの欠点を最小限に抑えるために、磁石は、眼4,9の隅角に磁性マイクロビーズを引き付けるために使用されています。
ここで説明するプロトコルは、磁性マイクロビーズとマウスの眼（ 図1）に適合した携帯型マグネットを使用した以前の研究9,10に基づいて修正された手順です。いくつかの重要な変更は、マウスにおいて効果的かつ再現性のIOPの増加を確保するために、私たちのプロトコルで導入されています。まず、マイクロビーズの注入は、ファセットベベルで慎重に準備したガラスマイクロニードルを使用して行われます。マイクロニードルの結果の滑らかな表面だけでなく、その鋭利な先端は、最小限の被害であることを保証しますそれは角膜を穿刺として与えました。マイクロニードルの先端部は、それによってそのような絞りやレンズなどの損傷近くの構造のリスクを減少させる、前房に入ると、このガラスマイクロニードルの使用はまた、増加した制御をもたらします。また、小さな注射病変は、角膜の自己修復を容易にし、不要な傷害関連の影響を低減します。
第二に、磁性マイクロビーズの注入およびハンドヘルド磁石の使用は、正確な制御が小さなマウスの眼の虹彩角膜角にビーズを誘致することができます。このマイクロビーズのサイズが用意したマイクロニードルの開口部を詰まらせ、重要なのは、1回注射しなかったため、直径4.5ミクロンを使用したある磁性マイクロビーズは、これらのマイクロビーズは効果的房水の排出を阻止しました。このアプローチは、注入されたマイクロビーズの逆流を減少させるだけでなく、マイクロビーズの最大数を効果的に房水の排出をブロックするために標的領域に蓄積することを保証するだけでなく。 Furthermoreが、この戦略はまた、絞りやレンズのような他の構造との接触を回避する前房内に浮遊するビーズの数を減少させ、後部チャンバーに通過を阻止します。まとめると、これらの変更は、マイクロビーズの注入手術が比較的容易にし、マウスでの高眼圧症の非常に、再現性の効果的、かつ持続的な誘導が得られ適時に行われていることを確認してください。
Protocol
以下の手順は、実験動物の使用と眼科での動物の使用とビジョンと眼科研究協会（ARVO）から視覚研究のための声明のための動物ケアに関するカナダの協議会のガイドラインに準拠して行きました。
前方房内注入のためのマイクロニードルの作製
- プラーと、ホウケイ酸ガラス毛細管からマイクロニードルを生成します
- 顕微鏡下で、慎重にマイクロニードルの先端に開口部を作成するために、鋭い刃を使用しています。得られた開口部は、それぞれ、約190ミクロンと70ミクロンのメジャーとマイナーの軸径の楕円形状を有していなければなりません。最初の画像解析ソフトウェアを用いて定量化に続いて、顕微鏡下に置き、定規を使用して画像を取得することにより調製されたマイクロニードルの開口部の面積を測定します。
- マイクロピペット面取りシステムでは、20 degreでマイクロニードルを配置面取りプレートに電子の角度マイクロニードル開口板に触れていることになります。縁が平らで滑らかになるまで約10分間ベベル。プロセスを助けるために、蒸留水を数滴加えます。
- 先端が鋭利になるまで開口を囲む2のエッジを面取りするマイクロニードルを回転させます。
- エアゾールダスターを使用して、マイクロニードル先端開口からすべての破片や水をきれいにしてください。
- 慎重に顕微鏡下で完成したマイクロニードルを調べます。手術中にマイクロニードル破壊の危険性を最小限にするために骨折とマイクロニードルを捨てます。
- その後、無菌の平衡塩溶液（BSS）と、エタノールで最初にリンスすることによってマイクロニードルを滅菌します。
磁気マイクロビーズソリューションの調製
注：この研究で使用される磁気ビーズは、エポキシ基でコーティングされています。このようなビーズの凝集や不要な分子間相互作用などの悪影響を防止するために、これらのエポキシ基がなければなりません最初の注射の手術を続行する前に、マイクロビーズから除去されます。
- 磁気ビーズからのエポキシ基の除去
- 10倍トリス緩衝液中0.02Mの水酸化ナトリウム（NaOH、MW 39.997グラム/モル）（MW 121.14グラム/モル）の溶液を調製します。
- ビーズが均一溶液中に懸濁されるまで穏やかに磁気マイクロビーズ溶液（4.5ミクロン直径、4×10 8ビーズ/ ml）のストックをボルテックス。
- すぐに10×トリス緩衝液中の0.02 M NaOHを50mlに磁気ビーズ溶液1mlをピペット。
- ビーズからのエポキシ基を除去するために、室温で24時間回転させます。
- チューブの底に磁石を固定することにより、ビーズを収集します。すべてのビーズが磁石に引き寄せられることを保証するために、水平にチューブを向けます。 RTでさらに4時間回転させます。
- マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなく、上清を除去します。
- ゆっくり10倍T 50mlにペレットをボルテックスビーズをよく懸濁されるまで、RISバッファ。
- 繰り返しは、2.1.6に2.1.4を繰り返します。
- 濃度および滅菌平衡塩溶液中の磁性マイクロビーズの再懸濁
注：2.4×10 6ビーズはで前房に注入することができるように、1.6×10 6ビーズ/μlの最終濃度に達するように、滅菌平衡塩類溶液（BSS）内の磁気ビーズ溶液のストックを濃縮することが必要です小さなマウスの眼に適した1.5マイクロリットルの最終容量。
- 静かに2分間ボルテックスすることにより超高純度の実験室グレードの水5ml中でビーズを洗浄します。
- 磁石をチューブの底にそれらを誘致することにより、ビーズを収集します。
- マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなく水を除去。
- 繰り返しは、2.2.1 2.2.3にさらに3回繰り返します。
- 層流フードでは、pipettinによってBSSの500μlのビーズを洗います上下グラム。層流フード内で無菌条件下で、このセクションの残りの手順を実行します。
- 磁石をチューブの底にそれらを誘致することにより、ビーズを収集します。
- マイクロピペットで、慎重にビーズのペレットを乱すことなくBSSを削除します。
- 繰り返しは、2.2.5 2.2.7にさらに3回繰り返します。
- 上下BSS250μlの中のビーズをピペッティングして再懸濁します。
- ビーズ溶液を十分に均質化されることを確認してください。その後、すぐに滅菌0.5ミリリットルチューブに懸濁液25μLを分取。ストックビーズ溶液の最終濃度は1.6×10 6ビーズ/μlです。
- 4℃で保存。
高眼圧症の3誘導
注：第3節では、2人の操作です。特定のアクションは、特定の人物によって実行される場合には、適切な人物が識別されます。人2はRであるが、一般的に、人1は、顕微鏡下でマウスを処理しマイクロシリンジポンプを操作するためのesponsible。外科処置の合計時間が10分未満であるべきである（3.17から3.9ステップ）。
- 大人のC57BL / 6マウスの手順を実行します。食料と水を自由摂取へのアクセス権を持つ標準的な環境でのハウスマウス。本論文では、年齢の3と4.5ヶ月の間に雌のC57BL / 6マウスを使用します。しかしながら、このプロトコルは、トランスジェニックおよびノックアウトマウスを含む雄と異なる年齢のマウス、ならびに他のマウス系統に適合させることができます。
- 較正されたリバウンド眼圧計を使用して前麻酔およびマイクロビーズの注入に覚醒したマウスにおいて、ベースラインIOPを測定します。角膜上プロパラカイン塩酸塩の1滴を適用します。
- そっと耳の間の皮膚を保持することによって、マウスを抑えます。動物が快適で、目がアクセスできるようにベンチトップ上にマウスを置きます。角膜表面に対して垂直眼圧計を持ち、取得するために、目ごとに10個の連続測定値の少なくとも3セットを取りますIOPの平均。覚醒したマウスにおけるIOPの測定は、IOPに麻酔関連の影響を回避することが好ましいです。代替的に、IOPは、ステップ3.4の後に麻酔したマウスで測定することができます。
- 20 mg / mlでケタミン、2 mg / mlとキシラジン、および0.4 mg / mlでアセプロマジンで構成される株価マウスカクテル麻酔液を調製します。
- カクテル混合物（体重の1μL/ g）を腹腔内投与によりマウスに麻酔を誘導します。マウスの頭部を取り扱う際には、動物が吸入マスクに接続されていないとして、それは柔軟性を可能にするため、注射用麻酔カクテルの使用は、ガス麻酔薬（ 例えば、イソフルラン）よりも好ましいです。さらに、注射麻酔薬で必要な長い回復期間は、マイクロビーズが前房内に戻って外れることなく、虹彩角膜角に落ち着くことが保証されます。
- ブプレノルフィンの皮下の体重1kg当たり0.05ミリグラムを管理します。
- トロピカミドのEYと目の治療電子瞳孔拡張を誘導するためにドロップします。マウスの前房のサイズが小さいため、瞳が簡単に注入中にマイクロニードルの位置決めと前進を視覚化するために拡張されなければなりません。
- 手順中に角膜の乾燥を避けるために、反対側の眼（非手術）に局所軟膏を適用します。
- マイクロシリンジポンプの注入アセンブリにきれいなマイクロニードルを取り付けます。クロス動物の汚染を避けるために、すべての操作の後にマイクロニードルを交換してください。
- 人1：オペレーティング・プラットフォームに麻酔マウスを転送します。顕微鏡下で、瞳孔が完全に拡張されていること、および眼球運動がないように、眼の筋肉がリラックスしていることを確認してください。眼球運動の欠如は、注入時の安定性を確保します。ゆっくり吸収性綿棒を使用して、目からトロピカミド点眼液を拭いてください。
- 人2：ピペッティングにより磁気マイクロビーズ液を混ぜます。
- マイクロシリンジポンプを使用して、すぐにMICRをロードoneedle均質化された磁気マイクロビーズ溶液（2.4×10 6ビーズ）の1.5μlを持つ（セクション1で調製しました）。気泡がマイクロニードルの先端に存在しないことを確認してください。マイクロニードルがロードされた後、磁気マイクロビーズ溶液が均一懸濁液中に残るように、できるだけ速やかに3.13に3.12のステップを実行します。
- 角膜輪部に前方に相対配置された45°の角度でロードされたマイクロニードルを、置きます。人1：プラスチック製のピンセットを用いて、目をサポートしています。マイクロニードルとプラスチックの鉗子との間の角度は約90°であることを確認してください。
- 人2：マイクロニードルの先端が前房に入るようにロードされたマイクロニードルを使用すると、静かに角膜を穿刺。ロードされたマイクロニードルを穿刺時の角膜縁に対して45°の角度のままでいることを確認してください。レンズやアイリスとの接触を避けてください。マイクロニードルは、房に入らないことを確認してください。人1：目のサポートを継続プラスチック製のピンセットを用いて。
- 人1：マウスのヘッドを移動せずに、前房内に磁気ビーズを引き付け、角膜の内面とビーズの接触を最小限にするために、マイクロニードルの先端部とは反対側の目、横に磁石を配置します。人2：マイクロシリンジポンプを使用して、前房内に磁気ビーズ溶液の1.5μLを注入します。マイクロビーズ溶液を15〜30秒間かけて注入します。人1：注射の全期間中に、マイクロニードルの先端に磁石の反対を押し続け。
- 人2：ビーズのフルボリュームが注入された後、ゆっくりと目からマイクロニードルを撤回。人1：マイクロビーズの逆流を避けるためには、さらに30〜60秒間の横の目に磁石を保持することによって、前房に向けた磁気ビーズを魅了し続けます。
- 人1：磁石を使用して、虹彩角膜角にビーズを引き付けます。ビーズが均等に分布して環を形成していることを確認してください前房の周囲。このステップの間、彼らが接触した際に、角膜の内面に固執する傾向があるとして、角膜にビーズを集めて避けます。
- 感染のリスクを最小限に抑えるために抗生物質の点眼で操作目を扱います。
- マウスが（〜3から4時間）完全に目を覚ましまで熱パッド上で回復させます。操作眼が上を向くようにマウスを置きます。この位置決めは、引力によって角膜の内面に注入されたビーズの蓄積を防ぐことができます。また、この位置は、操作目は任意の寝具および/またはケージ中に存在し得る他の材料と接触しないように、感染の可能性を減少します。必要に応じて動物が苦痛の兆候を表示する場合には、ブプレノルフィンの追加の用量を投与。
- マウスはIOP測定を行う前に少なくとも2日間手順から回復することを可能にします。 3.2で説明したようにIOPを測定します。モニ器IOP少なくとも週に一度以上の頻度で、必要に応じて、その日の同じ時刻に概日関連の変動を最小限に抑えることができます。
- IOP測定のために、内部コントロールとして動作し、マウスから反対側の眼を使用しています。また、無傷の、非操作または偽手術マウスのようなナイーブコントロールからの測定値を使用します。
網膜神経節細胞相馬と軸索生存4.評価
- 直ちに氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）、続いて0.1Mリン酸緩衝液（PBS）の心臓内注入によって高眼圧症に供したマウスを灌流。
- 4.1で説明したように、無傷の、非操作マウスを灌流し、損傷していないコントロールとしてそれらを使用しています。損傷後の反対側の眼の変化は15,16報告されており、データの解釈を混乱させる可能性があるため操作したマウスからの反対側の眼の使用は、RGCの生存率を評価することは推奨されません。代わりに、1を注入した偽手術目を使用対照としてBSSの0.5μlの。
- microscissorsを使用して、慎重に眼窩からそれを単離するために、眼の周囲の結合組織を切断します。視神経頭のレベルでそれを切断することにより、眼から視神経を区切ります。
- 30 G針を使用して、眼内に固定液の浸透を可能にするために、角膜に穴を作ります。 4％PFA中で目を置き、追加の固定のために4℃で1時間インキュベートします。
- （MW：214グラム/モル）、2％PFAおよび0.1 Mカコジル酸ナトリウム中の2.5％グルタルアルデヒドを含む溶液中で視神経を置き、追加の固定のために4℃でO / Nインキュベートします。
5.上のRGCソーマ密度の定量フラットマウント型網膜
17次の手順では、ナダルニコラらによってプロトコルから適応され、網膜のフラットマウント上で脳特異的ホメオボックス/ POUドメインタンパク質の3A（Brn3a）に対する抗体を用いたRGCの定量化の概要を示します。注意してください。代替メタRGCを標識するためのODSは、複数のスプライシング（RBPMS）またはフルオロゴールドまたはDiIを持つ逆行性標識法とRNA結合タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学などのもを使用することができます。
- 解剖顕微鏡下で、角膜が簡単に外れるまで、全輪部に沿って切開を行うことで、眼の前方部分を削除します。角膜とレンズを取り外してください。慎重鋸状縁と視神経に沿ってカットを行うことで、眼から網膜を切り離します。
- 明らかに4網膜象限を描写するために視神経に向かって網膜の周辺部から4小等距離の切開を行うことで、網膜フラットマウントを準備します。小さなブラシを使用して、静かに網膜から残りの硝子体を除去します。できるだけ多くの硝子体液の除去は、クリーンで強力な免疫組織化学的信号を得るために重要です。
- 網膜になるように慎重にPBS中の0.5％トリトンX-100を含む48ウェル平底培養プレートに網膜を転送します自由に浮遊。神経節細胞層が上を向いていることを確認します。
- 15分間-70℃で培養プレートを置きます。 PBS中で新鮮な2％トリトンX-100で2回洗浄することにより網膜、さらに透過処理を解凍した後。
- PBS、2％トリトンX-100及び2％正常ロバ血清を含有する0.5μgの/ mlの - 0.3 Brn3a抗体を希釈します。静かに4℃でO / Nを振ることによりBrn3a一次抗体溶液中で網膜をインキュベートします。網膜は、完全にすべての回で、溶液の150〜200μl中に浸漬する必要があります。
- PBS、2％トリトンX-100を含有する、穏やかに振盪しながら室温で2時間この溶液中で網膜をインキュベートするとmlの2μgの/へのロバ抗ヤギIgG二次抗体を希釈します。網膜は完全にすべての回で抗体溶液に浸漬する必要があります。光退色を防止するために、残りのステップのためにアルミホイルで培養プレートをカバーしています。
- 組織は、POSのように平らになるようにブラシを使用して、慎重にスライドに網膜を転送sible。 10分間空気乾燥しました。抗フェードマウンティング培地を使用してマウントします。
- 蛍光顕微鏡下で網膜のフラットマウントを調べます。記載されているように、網膜象限ごとに3つの非重複領域にBrn3a正のRGCの数を定量化する。18
視神経断面積上のRGC軸索の6.定量
- ステップ4.5から視神経を収集し、2時間、2％四酸化オスミウム（のOsO 4、MW 254.23グラム/モル）でインキュベートします。
注意：その高い毒性のために、四酸化オスミウムは、適切な実験室での服装とドラフト内で処理する必要があります。 - 15分ごとに（50％、70％、90％、95％、および100％）エタノールの濃度を増加させ、それを浸漬することにより視神経を脱水。
- 、15.72ミリリットル埋め込み-812 6.45ミリリットルドデセニル無水コハク酸、7.83ミリリットルナジックメチル無水物、0.45ミリリットルDMP-30：次のレシピを使用して、エポキシ樹脂を準備します。
- 順次構成されるソリューションで視神経をインキュベート0：1、1：0.75：0.25と1：以下のプロピレンオキシドへのエポキシ樹脂の比（MW 58.08グラム/モル）の0。視神経は、O / Nの期間室温で各溶液中でインキュベートします。
- さらに48時間、60℃で100％のエポキシ樹脂中に包埋視神経（6.4から最後のステップ）をインキュベートします。
- ミクロトームを用いて半薄い視神経断面（0.75μm）を生成します。
- 1％トルイジンブルーで視神経断面を染色します。
- 19が記載されているように、各視神経節の5の非重複領域にRGC軸索を定量化します。
Representative Results
このプロトコルで説明成体マウスの前房内への磁性マイクロビーズの注入は、IOPの堅牢性と再現性の上昇をもたらしました。 、*** P <0.001;一週間処置後、IOPは、高血圧の目には19±0.5ミリメートルHgの（スチューデントのt検定、10±0.6ミリメートルHgの（平均±SEM）、反対側の眼の平均ベースラインIOPから増加しましたN = 12、 表1、図2）。 IOPは、最長の時点では、本研究で検討し、その後安定し、少なくとも6週間は20ミリメートルHgの平均で上昇したままでした。手術後2、3、および6週目のマイクロビーズを注入した目で平均ピークIOPは、25ミリメートルHgのでした。処置したマウスの大部分は、したがって、このプロトコルは、マイクロビーズの目の注射を必要としない、持続的な高IOPを開発しました。
このモデルではRGC損失の経時変化を評価するために、RGCソーマがありました最初Brn3a、RGC特異的マーカー17を用いた免疫染色によって定量しました。 Brn3a陽性細胞の数は、高眼圧症の誘導後1,2,3、及び6週目にフラットマウント網膜上で定量しました。重要なIOP上昇は、マイクロビーズ、注射後早ければ1週間として検出されたが、RGCソーマの有意な損失は（ 図3）手順の最初の2週間以内に観察されませんでした。実質的なRGC死（22％）、しかし、3週間後に明らかであった（2430±67のRGC / mm 2であり、平均±SEM、N = 12）と6週間（2350±74のRGC / mm 2であり、n = 10）後非手術マウスから無傷の対照眼と比較して、高眼圧症の誘導、（3141±49のRGC / mm 2であり、n = 23）（ANOVA、P <0.001）。
RGC軸索の機能不全および変性は緑内障の基本的特徴です。したがって、軸索損失はマイクロビーズの注入による後3および6週間後に検査しましたトルイジンブルーで染色し、視神経の断面におけるRGC軸索の定量化（ 図4）。 RGC軸索の実質的な損失（25％）は、3週間で観察された（平均±SEM 28401±702軸索/神経、N = 5）、6週間（29426±948軸索/神経、n = 6）がマイクロビーズの注射後非手術眼（39467±137軸索/神経、N = 4）（ANOVA、P <0.001）から無傷の視神経に比べて。まとめると、これらのデータは、マウスの前房への磁性マイクロビーズの注入が再現可能につながり、RGCソーマと軸索変性をもたらすIOP上昇を持続することを示しています。
| OHT手術後の時間 | N | IOP（mmHgの）平均±SEM | ピークIOP（mmHgで） | ||||
| 反対側の | 緑内障 | ディfference | 反対側の | 緑内障 | |||
| 1週間 | 12 | 10±0.4 | 19±0.5 | 9±0.6 | 12±0.4 | 22±0.6 | |
| 2週間 | 13 | 11±0.5 | 20±0.8 | 9±0.5 | 12±0.9 | 25±0.7 | |
| 3週間 | 10 | 11±0.8 | 20±0.7 | 10±0.9 | 13±0.2 | 25±0.9 | |
| 6週間 | 12 | 12±0.5 | 20±0.6 | 9±0.7 | 13±0.5 | 24±0.6 | |
ネズミ磁気マイクロビーズOcclusiにおける眼圧の表1標高モデルに。アウェイク雌C57 BL / 6マウスでは、IOPを較正リバウンド眼圧計を用いて測定しました。オペ目は手続き後少なくとも6週間は上昇したまま1週間後の手術で検出されたIOPの増加を示しました。
緑内障のマウス磁気マイクロビーズ閉塞モデルに含まれるステップの図1.ワークフロー。中に、前に実行されたすべての手順をステップバイステップのアウトラインは、手術後。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデルにおける眼圧図2.増加。目を覚まして雌のC57 BL / 6マウスは、IOPを較正リバウンド眼圧計を用いて測定しました。マイクロビーズを注射した眼のIOPには有意に1週間の術後（ANOVA、P <0.001）で上昇しました。 IOPSが大幅に少なくとも6週間（ANOVA、P <0.001）のために注射したマウスの反対側の眼に比べて上昇したままでした。 （インタクト：N = 12; 1週間：N = 12、2週間：N = 13、3週間：N = 10、6週間：N = 12）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデル。RGCを図3.網膜神経節細胞死を誘導するためにマイクロビーズ注入後3,6週間で無傷のコントロール網膜（A）および緑内障網膜でBrn3aを用いた平面実装型網膜の免疫染色により可視化しました高眼圧症（OHT）（B、C）。スケールバー：20μmです。 （D）定量分析手順が目を制御するために比較した後、マイクロビーズの注入が3と6週目に有意なRGCソーマ損失をもたらしたことを確認しました。無傷の、非緑内障性C57 / BL6マウスにおけるRGCの細胞体の密度は、基準（白色バー、100％の生存率）として示されています。 N = 23; 1週間：値は、SEM（無傷の平均±として表現されたn個= 6、2週間：N = 6、3週間：N = 12、6週間：N = 10、ANOVA、*** P < 0.001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ネズミ磁気マイクロビーズ閉塞モデル図4.軸索変性。RGC軸索は、中のトルイジンブルーで視神経断面の染色により可視化しましたマイクロビーズの注入後3,6週間で無傷対照（A）及び緑内障網膜は眼圧症（OHT）（B、C）を誘導します。スケールバー：10ミクロン。 （D）定量分析手順が目を制御するために比較した後、マイクロビーズの注入が3と6週目に有意なRGC軸索の喪失をもたらしたことを確認しました。無傷の、非緑内障性C57 / BL6マウスにおけるRGC軸索の密度は、基準（白色バー、100％の生存率）として示されています。値の平均±SEMとして表されている（インタクト：N = 4; 3週間：N = 5、6週間：N = 6、ANOVA、*** P <0.001）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 。
Discussion
ここで紹介するビデオ技術は、効果的かつ再現性のマウスにおいてIOP上昇を誘導するために、磁性マイクロビーズの房内注入を実行する方法の詳細な手順を提供します。追加の注射を必要とし、高眼圧症induction.Elevated IOPの最初の3週間以内に検出可能なRGCソーマと軸索の損失を促進しない持続的なIOPの上昇でこの手順の結果は、ヒトにおける緑内障を開発するための主要な危険因子です。したがって、これは、広範囲のアプリケーションの可能性を有している貴重なマウス眼圧症依存緑内障モデルです。
前房内にマイクロビーズの注入に関連した共通の欠点は、針が引き抜かれたとき、多くの場合、房水の流出と増加変動の唯一の部分的な閉塞をもたらす、注射部位を介して逆流をビーズに関連します。この問題に対処するには、いくつかの重要な修正が実装されました。ファーズトン、ファセットベベルときれいな、シャープなガラスマイクロニードルの入念な準備は、マイクロビーズの成功注射のために不可欠です。適切に準備されたマイクロニードルは、繊細な眼表面への圧力の最小限のアプリケーションと角膜の制御とスムーズな浸透を可能にします。小さな角膜穿刺は、マイクロビーズの逆流を防止します。また、微細なマイクロニードルは、このような非疾患関連の炎症につながる可能性があり、虹彩やレンズなどの損傷近くの構造のリスクを低減します。第二に、中および注入後の戦略眼領域へのハンドヘルド磁石の適用は、この技術の別の重要な側面です。注入中に、磁石は、マイクロニードルが引き抜かれるとき、マイクロビーズの前房防止に還流した磁気マイクロビーズを描画するために使用されます。注射後、磁石は、その後、房水の流出を阻止するために虹彩角膜角のマイクロビーズを導くために使用されます。
10トン">多くの場合、マイクロビーズ閉塞モデルで遭遇する別の問題が繰り返さビーズ注射は、多くの場合、持続的なIOP上昇10,11を達成するために必要であるということである。これは、時間と虹彩角膜角から外れるマイクロビーズの結果である可能性がある。ハンドヘルド磁石の組み合わせ、上述の、および術後のマウスの位置が大幅に結果を改善する。柔軟性が処置中にヘッドを移動し、より長い術後回復期間を必要とすることができるように注射用麻酔薬の使用が有利である。の配置として操作眼は手術後の時間のカップルのための上向きを持つマウスは、虹彩角膜角でマイクロビーズの和解に寄与し、前房に戻って脱落の危険性を減少させます。注入されたビーズの数が比較的一致していることを保証することは、動物間の変動を最小限にするもう一つの重要なステップです。マイクロビーズは、Bに落ち着くので、チューブのottomは、完全にマイクロビーズ液を均質化し、タイムリーにマイクロニードルへの適切な量を撤回する必要があります。前房への少ないビーズの注入は貧しいまたは可変IOP上昇につながる可能性がある、房水の排水構造の不完全閉塞につながる可能性があります。マイクロビーズの注入の究極の目的は、IOPを高めることであるが、目を覚ましたマウスからのIOP測定は、この研究（〜25 mmHgの）で報告されたピーク値よりも高い場合注目すべきは、注意が取られるべきです。非常に高いIOPSが虚血性損傷のリスクを増加させ、また、動物に苦痛を引き起こす可能性があります。 IOPの上昇は、手術の成功を評価するために、多くの要因の一つとして考えられるべきです。このように、手順の結果は、IOP上昇、RGCソーマ死、および軸索の損失を含むいくつかのパラメータに基づいて測られるべきです。
ここで説明するプロトコルは、ほとんどのマイクロビーズ成功したことになるが、LY角度でのセトリング、このモデルの潜在的な制限は、前房内に浮遊したまま、これらのビーズは、角膜を通してライブ網膜イメージングだけでなく、光の効果的な通過を必要とする電気生理学的または行動アッセイを妨害するかもしれないということです。このマイクロビーズ閉塞モデルを利用する際に考慮すべきもう一つの重要な側面は、IOP上昇とそれに続くRGC変性の程度は年齢や操作マウスの遺伝的背景[4]によって変化することです。したがって、IOP上昇の程度およびRGC変性のタイムラインは、それぞれ特定のトランスジェニックマウスのラインおよび/または年齢層のために決定する必要があります。
このモデルの特徴は、マイクロビーズの注入後の最初の3週間の間にRGC死が徐々に失われ、大幅なRGC死で上昇したIOPの結果は処置後3週間で検出されていることです。したがって、このモデルは、この（d）に発生する初期および/または微妙な変化の検査を可能にします前明白なRGCソーマと軸索の損失にisease、。 RGC死の有意な増加は、高眼圧症の誘導後3及び6週間の間に認められませんでした。成功したのにもかかわらず、3および6週間の間、25％とこれらの時点でのIOPの上昇を持続 - 、実際には、RGCの細胞体と軸索損失は〜22で安定していました。持続IOPの長い期間をC57BLで他のマウス系統と比較して、RGCの損傷に対してより耐性であるように見える/ 6マウスを、発生する追加のRGC喪失のために必要となる場合があります。5さらなる改変をここで紹介するプロトコルに、ビーズサイズの調整を含みますそして追加の注射は、後の時点でのRGC喪失を研究するために必要になることがあります。したがって、我々のプロトコルは、ヒトの緑内障で発症し、早期の進行に関連するささやかなRGCの神経変性と相関早期病態生理学的変化に焦点を当てた研究に最適です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
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