Summary
هنا، نقدم بروتوكول للحث على ارتفاع ضغط الدم في العين في العين الفئران ينتج عنه خسائر في خلايا الشبكية كما لوحظ في الزرق. يتم حقن ميكروبيدات المغناطيسي في الغرفة الأمامية وتنجذب إلى زاوية القزحية القرنوية باستخدام مغناطيس لمنع تدفق الخلط المائي.
Abstract
وقد تم استخدام نماذج القوارض الزرق ضروري لفهم الآليات الجزيئية التي تكمن وراء الفيزيولوجيا المرضية لهذا المرض الاعصاب سياقاتها. مع ظهور العديد من خطوط الماوس المعدلة وراثيا، وهناك اهتمام متزايد في نماذج الفئران محرض من ارتفاع ضغط الدم في العين. هنا، نقدم نموذجا انسداد الزرق على أساس حقن ميكروبيدات المغناطيسي في الغرفة الأمامية للعين باستخدام إبرة مجهرية معدلة مع شطبة الأوجه. تنجذب ميكروبيدات المغناطيسية إلى زاوية القزحية القرنوية باستخدام مغناطيس يده لمنع تصريف الخلط المائي من الغرفة الأمامية. هذا الاضطراب في ديناميات النتائج المائية في الارتفاع المطرد للضغط العين، مما يؤدي بعد ذلك الى خسارة في خلايا الشبكية، كما لوحظ في مرضى الجلوكوما البشري. نموذج ميكروبيدات انسداد الواردة في هذا المخطوط هو بسيط مقارنة بالطرازات الأخرى محرض الزرق وأيضا للغايةفعالة وقابلة للتكرار. الأهم من ذلك أن التعديلات المقدمة هنا التقليل القضايا المشتركة التي غالبا ما تنشأ في نماذج انسداد. أولا، استخدام إبرة مجهرية الزجاج المشطوف يمنع ارتداد ميكروبيدات ويضمن الحد الأدنى من الضرر يحدث في القرنية خلال الحقن، وبالتالي تقليل الآثار الناجمة عن الإصابات. ثانيا، استخدام ميكروبيدات المغناطيسية يضمن القدرة على جذب معظم حبات إلى زاوية القزحية القرنوية، والحد من فعالية عدد من الخرز عائم في الغرفة الأمامية وتجنب الاتصال مع الهياكل الأخرى (على سبيل المثال، القزحية، عدسة). وأخيرا، استخدام المغناطيس يده يسمح المرونة عند التعامل مع العين الماوس صغيرة لكفاءة توجيه ميكروبيدات المغناطيسية وضمان أن يكون هناك ارتداد القليل من ميكروبيدات من العين عندما يتم سحب إبرة مجهرية. وباختصار، فإن انسداد نموذج الفأر ميكروبيدات المقدمة هنا هو أداة تحقيق قوية لدراسة التغيرات الاعصاب التي تحدث أثناء ظهور وتطور من غلوغيبوبة.
Introduction
الجلوكوما هو المسببة للعمى حالة مستمرة بلا رجعة من شأنها أن تؤثر على ما يقدر بنحو 80 مليون شخص في جميع أنحاء العالم بحلول عام 2020 1. وفي مرضى الجلوكوما، هو سبب فقدان البصر بسبب وفاة الانتقائي للخلايا الشبكية العقدة (RGCs)، والخلايا العصبية الإخراج الذي نقل المعلومات البصرية من شبكية العين إلى الدماغ. الجلوكوما هو مرض الاعصاب المرتبطة بالعمر مع العديد من عوامل الخطر التي تعتبر الأكثر شيوعا هو ارتفاع ضغط العين (IOP). في الواقع، IOP هو عامل خطر قابل للتعديل الوحيد في الزرق والعلاجات الحالية تركز فقط على إدارة ضغط العين. ومع ذلك، والعوامل الوراثية الخلوية، والبيئية متعددة تؤثر على ظهور وتطور هذا المرض. ولذلك، فهم الآليات المختلفة التي تسهم في نهاية المطاف إلى موت الخلايا العصبية لا بد من تطوير علاجات فعالة لزرق.
نماذج حيوانية من الزرق ضرورية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المرض وتحديد واختبارعلاجات واعدة. وقد دفع تزايد توافر خطوط الماوس المعدلة وراثيا بما في ذلك سلالات خروج المغلوب الشرطية والفئران تحمل استشفاف الفلورسنت المشفرة وراثيا الحاجة إلى نماذج الزرق الفئران محرض. وقد تم تطوير عدة نماذج من القوارض الزرق على مر السنين (إعادة النظر في 2،3). في كثير من هذه النماذج، والتي يسببها الزرق عن طريق تعطيل ديناميات الخلط المائي، مما أدى إلى ارتفاع الضغط داخل المقلة. نماذج الانسداد، الذي يتم حقن ميكروبيدات أو غيرها من المواد في الغرفة الأمامية للعين لمنع تصريف مائي، اكتسبت شعبية في السنوات الأخيرة ويرجع ذلك جزئيا إلى السهولة النسبية لزيادة IOP 4-14.
تم تعديل نموذج ميكروبيدات انسداد الزرق، وحمل لأول مرة في الرئيسيات 12، الأرانب 8، والجرذان 4،9،11، مؤخرا لاستخدامها في الفئران 5،6،10. في هذه الدراسات، وحقن intracameral من ميكروبيدات البوليسترين، وحدها أو فيتوليفة مع المواد اللزجة، أسفرت عن IOP الارتفاع مما يؤدي إلى احق 6،10 الموت RGC. ومع ذلك، الجزر عندما يتم سحب الإبرة من العين وتهجير ميكروبيدات من زاوية القزحية القرنوية من المشاكل الشائعة التي تنشأ أثناء العملية. للحد من هذه السلبيات، وقد استخدمت مغناطيس لجذب ميكروبيدات المغناطيسية إلى زاوية القزحية القرنوية العين 4،9.
بروتوكول الموصوفة هنا هو إجراء تعديل على أساس دراسات سابقة 9،10 يستخدم ميكروبيدات المغناطيسية والمغناطيس يده تكييفها للعين الماوس (الشكل 1). وقد تم إدخال العديد من التعديلات الهامة في بروتوكول لدينا لضمان زيادة IOP فعالة وقابلة للتكرار في الفئران. أولا، ويتم حقن ميكروبيدات باستخدام إبرة مجهرية زجاج أعدت بعناية مع شطبة الأوجه. والأسطح الملساء الناتجة من إبرة مجهرية وكذلك طرفها شحذ يضمن الحد الأدنى من الضرركما لحقت ثقوب القرنية. استخدام هذا إبرة مجهرية زجاج النتائج أيضا في زيادة السيطرة عندما يدخل رأس إبرة مجهرية في الغرفة الأمامية، مما يقلل من خطر الهياكل القريبة الضارة مثل القزحية والعدسة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حقن آفة صغيرة تسهل القرنية إصلاح الذات، ويقلل من الآثار الناجمة عن الإصابات غير المرغوب فيها.
ثانيا، حقن ميكروبيدات المغناطيسية واستخدام المغناطيس يده يسمح مراقبة دقيقة لجذب الخرز إلى زاوية القزحية القرنوية في العين الماوس صغيرة. ميكروبيدات المغناطيسية التي هي 4.5 ميكرون في القطر استخدمت لهذا الحجم ميكروبيدات لم تسد افتتاح إبرة مجهرية إعداد والأهم من ذلك، حقن مرة واحدة، منعت هذه ميكروبيدات بشكل فعال تصريف الخلط المائي. هذا النهج ليس فقط يقلل الجزر من ميكروبيدات حقن، ولكن يضمن أيضا أن الحد الأقصى لعدد ميكروبيدات يتراكم في المنطقة المستهدفة لمنع بشكل فعال مائي الصرف الفكاهة. Furthermore، ويقلل من هذه الاستراتيجية أيضا عدد من الخرز عائم في الغرفة الأمامية وتجنب الاتصال مع غيرها من الهياكل، مثل القزحية والعدسة، ومنع مرور إلى غرفة الخلفي. بشكل جماعي، هذه التعديلات تضمن أن الجراحة حقن ميكروبيدات يتم تنفيذ بسهولة نسبية وفي الوقت المناسب مما أدى إلى تحريض تكرار للغاية وفعال ومستدام من ارتفاع ضغط الدم في العين في الفئران.
Protocol
تم تنفيذ الإجراء التالي في الامتثال للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان لاستخدام حيوانات التجارب وبيان لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث البصرية من جمعية للبحوث في الرؤية والعيون (ARVO).
1. إعداد إبرة مجهرية لالأمامي Intracameral حقن
- مع مجتذب، توليد إبرة مجهرية من الشعرية البورسليكات الزجاج
- تحت المجهر، واستخدام شفرة حادة لخلق بعناية فتح في غيض من إبرة مجهرية. يجب أن يكون افتتاح الناتجة على شكل بيضاوي الشكل يبلغ قطرها محور الرئيسية والثانوية حوالي 190 ميكرون و 70 ميكرون، على التوالي. قياس مجال افتتاح إبرة مجهرية على استعداد بصور الحصول الأولى مع حاكم وضعت تحت المجهر تليها الكمي باستخدام برنامج تحليل الصور.
- في نظام micropipette شطف، وضع إبرة مجهرية في 20 degreالبريد الزاوية بالنسبة إلى لوحة شطف بحيث افتتاح إبرة مجهرية لمس لوحة. شطبة لحوالي 10 دقيقة حتى حواف مسطحة وناعمة. إضافة بضع قطرات من الماء المقطر للمساعدة في هذه العملية.
- تدوير إبرة مجهرية لشطبة حواف اثنين المحيطة افتتاح حتى غيض حاد.
- نظيف كل الحطام والمياه من افتتاح قمة إبرة مجهرية باستخدام منفضة الهباء الجوي.
- تدرس بعناية إبرة مجهرية النهائي تحت المجهر. microneedles تجاهل مع الكسور للحد من خطر كسر إبرة مجهرية أثناء الجراحة.
- تعقيم إبرة مجهرية من قبل الشطف أولا مع الإيثانول، ثم بمحلول الملح المعقم متوازن (BSS).
2. إعداد الحل ميكروبيدات المغناطيسي
ملاحظة: والمغلفة ميكروبيدات المغناطيسية المستخدمة في هذه الدراسة مع مجموعة الايبوكسي. لمنع أي آثار سلبية، مثل التثاقل من الخرز والتفاعلات الجزيئية غير المرغوب فيها، يجب أن هذه المجموعات الايبوكسيأولا إزالتها من ميكروبيدات قبل الشروع في عملية جراحية الحقن.
- إزالة المجموعات الايبوكسي من الخرز المغناطيسي
- تحضير محلول 0.02 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم، MW 39.997 جم / مول) في 10X عازلة تريس (MW 121.14 جم / مول).
- دوامة بلطف مخزون حل ميكروبيدات المغناطيسي (4.5 ميكرون قطر، 4 × 10 8 حبات / مل) حتى يتم تعليق الخرز بالتساوي في الحل.
- الماصة بسرعة 1 مل من محلول حبة المغناطيسي إلى 50 مل من 0.02 M هيدروكسيد الصوديوم في 10X عازلة تريس.
- تناوب لمدة 24 ساعة على RT لإزالة المجموعات الايبوكسي من الخرز.
- جمع حبات من خلال تأمين مغناطيس على الجزء السفلي من الأنبوب. توجيه الأنبوب أفقيا لضمان أن تكون جميع حبات ينجذب إلى المغناطيس. تدوير ل4 ساعة إضافية في RT.
- مع micropipette، وإزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه من الخرز.
- دوامة بلطف بيليه في 50 مل من 10X Tالريس العازلة حتى يتم تعليق الخرز جيدا.
- كرر الخطوات من 2.1.4 إلى 2.1.6.
- تركيز وإعادة تعليق من ميكروبيدات المغناطيسي في محلول معقم الملح المتوازن
ملاحظة: من الضروري التركيز على الأسهم من حل حبة المغناطيسي في محلول معقم ملح متوازن (BSS) للوصول إلى تركيز النهائي من 1.6 × 10 6 حبات / ميكرولتر بحيث 2.4 × 10 6 حبات يمكن حقنه في الغرفة الأمامية في الحجم النهائي من 1.5 ميكرولتر، وهو يتناسب مع العين الماوس صغيرة.
- تغسل حبات في 5 مل من الماء درجة مختبر نقي للغاية قبل vortexing بلطف لمدة 2 دقيقة.
- جمع حبات من جذبهم إلى أسفل الأنبوب مع المغناطيس.
- مع micropipette، وإزالة بعناية الماء من دون إزعاج بيليه من الخرز.
- كرر الخطوات من 2.2.1 إلى 2.2.3 ثلاث مرات أكثر.
- في غطاء تدفق الصفحي، تغسل حبات مع 500 ميكرولتر من BSS التي كتبها pipettinز صعودا وهبوطا. تنفيذ الخطوات المتبقية في هذا القسم تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
- جمع حبات من جذبهم إلى أسفل الأنبوب مع المغناطيس.
- مع micropipette، وإزالة بعناية BSS دون إزعاج بيليه من الخرز.
- كرر الخطوات من 2.2.5 إلى 2.2.7 ثلاث مرات أكثر.
- و resuspend قبل pipetting حبات صعودا وهبوطا في 250 ميكرولتر من BSS.
- ضمان أن الحل حبة هو المتجانس جيدا. ثم، بسرعة قسامة 25 ميكرولتر من تعليق في العقيمة 0.5 مل أنابيب. التركيز النهائي من الحل الأسهم حبة هو 1.6 × 10 6 حبات / ميكرولتر.
- تخزينها في 4 درجات مئوية.
3. تحريض بصري ارتفاع ضغط الدم
ملاحظة: القسم 3 هو عملية من شخصين. في حالة عدم وجود عمل معين يتمثل في أن يقوم بها شخص معين، يتم التعرف على الشخص المناسب. بشكل عام، شخص 1 مقابض الماوس تحت المجهر بينما شخص 2 هو صesponsible لمعالجة مضخة محقنة مكروية. إجمالي مدة العملية الجراحية يجب أن تكون أقل من 10 دقيقة (الخطوات 3،9 حتي 3،17).
- إجراء عمليات في الكبار C57BL / 6 الفئران. الفئران منزل في بيئة موحدة مع الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. في هذه الورقة، استخدم أنثى C57BL / 6 الفئران بين 3 و 4.5 أشهر من العمر. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفها للذكور والفئران من مختلف الأعمار، فضلا عن غيرها من سلالات الفئران، بما في ذلك المعدلة وراثيا وخروج المغلوب الفئران.
- قياس IOP الأساسي في الفئران مستيقظا قبل التخدير وميكروبيدات الحقن باستخدام مقياس التوتر انتعاش معايرة. تطبيق قطرة واحدة من هيدروكلوريد بروباراكايين على القرنية.
- كبح بلطف الماوس عن طريق عقد الجلد بين الأذنين. ضع الماوس على الفوق ذلك أن هذا الحيوان هو مريح وعيون يمكن الوصول إليها. عقد مقياس التوتر عمودي على سطح القرنية واتخاذ لا يقل عن ثلاثة مجموعات من القراءات العشر على التوالي في العين للحصول علىIOP المتوسط. ويفضل قياس IOP في الفئران مستيقظا لتجاوز الآثار المتعلقة التخدير في معهد جامعة هارفارد. بدلا من ذلك، IOP يمكن قياسها في الفئران anesthetised بعد الخطوة 3.4.
- إعداد المخزون الماوس كوكتيل التخدير خليط يتكون من 20 ملغ / مل الكيتامين، 2 ملغ / مل زيلازين، و 0.4 ملغ / مل آسيبرومازين.
- حث التخدير في الماوس عن طريق إدارة داخل الصفاق من خليط كوكتيل (1 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم). ويفضل استخدام كوكتيل حقن مخدر على التخدير الغاز (على سبيل المثال، الأيزوفلورين) لأنه يتيح مرونة عند التعامل مع رئيس الماوس كما لم يتم توصيل الحيوان إلى قناع استنشاق. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فترة أطول للشفاء المطلوبة مع حقن مخدر يضمن ميكروبيدات تستقر في الزاوية القزحية القرنوية دون طرد مرة أخرى في الغرفة الأمامية.
- إدارة 0.05 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم تحت الجلد البوبرينورفين.
- علاج العين مع إرنست و يونغ تروبيكاميدالبريد إسقاط للحث التلاميذ تمدد. نظرا لصغر حجم الغرفة الأمامية الفئران، يجب أن تكون متسعة التلميذ لتصور بسهولة تحديد المواقع والنهوض إبرة مجهرية أثناء الحقن.
- تطبيق مرهم موضعي على العين المقابل (التي تديرها الامم المتحدة) لتجنب جفاف القرنية أثناء العملية.
- إرفاق إبرة مجهرية نظيفة للجمعية حقن مضخة محقنة مكروية. استبدال إبرة مجهرية بعد كل عملية لتجنب التلوث والحيوان.
- شخص 1: نقل الماوس anesthetised إلى منصة التشغيل. تحت المجهر، تأكد من أن التلميذ المتوسعة بشكل كامل وأن عضلات العين والاسترخاء حتى لا يكون هناك أي حركة العين. غياب حركات العين يضمن الاستقرار خلال الحقن. قم بمسح انخفاض تروبيكاميد العين من العين باستخدام مسحات ماصة.
- شخص 2: تخلط الحل ميكروبيدات المغناطيسي من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- باستخدام مضخة محقنة مكروية، تحميل فورا ميكرoneedle (المعد في القسم 1) مع 1.5 ميكرولتر من الحل ميكروبيدات المغناطيسي المتجانس (2.4 × 10 6 حبات). تأكد من أن فقاعات الهواء غائبة في غيض من إبرة مجهرية. بعد تحميل إبرة مجهرية، تنفيذ الخطوات 3،12-3،13 بأسرع وقت ممكن حتى لا يبقى الحل ميكروبيدات المغناطيسي في تعليق متجانسة.
- ضع إبرة مجهرية تحميل بزاوية 45 درجة، وضعت قريب الأمامية لحوف. شخص 1: دعم العين باستخدام ملقط البلاستيك. تأكد من أن الزاوية بين إبرة مجهرية وملقط البلاستيكية حوالي 90 درجة.
- شخص 2: مع إبرة مجهرية تحميل، ثقب بلطف القرنية بحيث غيض من إبرة مجهرية يدخل الغرفة الأمامية. تأكد من أن إبرة مجهرية تحميل يبقى في زاوية 45 درجة بالنسبة إلى حوف خلال ثقب. تجنب أي اتصال مع العدسة أو القزحية. تأكد من أن إبرة مجهرية لا يدخل الغرفة الخلفية. شخص 1: مواصلة دعم العينباستخدام ملقط البلاستيك.
- شخص 1: بدون تحريك الرأس الماوس، ووضع المغناطيس بجانب العين، مقابل رأس إبرة مجهرية، لجذب حبات مغناطيسية في الغرفة الأمامية وتقليل الاتصال من الخرز مع السطح الداخلي للقرنية. شخص 2: استخدام مضخة محقنة مكروية، وضخ 1.5 ميكرولتر من الحل حبة المغناطيسي في الغرفة الأمامية. يتم حقن محلول ميكروبيدات على مدى فترة من 15 إلى 30 ثانية. شخص 1: متابعة اضغط على العكس المغناطيس إلى طرف إبرة مجهرية خلال كامل مدة الحقن.
- شخص 2: وبمجرد حقن حجم كامل من الخرز، وسحب ببطء إبرة مجهرية من العين. شخص 1: لتجنب ارتداد من ميكروبيدات، والاستمرار في جذب حبات مغناطيسية نحو الغرفة الأمامية من خلال عقد المغناطيس بجانب العين لمدة 30 إلى 60 ثانية إضافية.
- شخص 1: عن طريق المغناطيس، يجذب حبات إلى زاوية القزحية القرنوية. تأكد من أن حبات تشكل حلقة موزعة بالتساويحول محيط الغرفة الأمامية. خلال هذه الخطوة، وتجنب جذب الخرز إلى القرنية كما أنهم يميلون إلى التمسك السطح الداخلي للقرنية عند الاتصال.
- علاج العين تعمل مع قطرة العين المضادات الحيوية للحد من خطر العدوى.
- السماح للفأرة على التعافي على وسادة الحرارة حتى مستيقظا تماما (~ 3-4 ساعة). ضع الماوس بحيث يواجه العين تعمل صعودا. وهذه المواقع منع تراكم حبات حقن إلى السطح الداخلي للقرنية بواسطة الجاذبية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الموقف يقلل من احتمالات الإصابة كما سوف العين تعمل لا تكون على اتصال مع أي الفراش و / أو غيرها من المواد التي قد تكون موجودة في القفص. في حال أن يعرض حيوان أي دلالة على الشدة وإدارة جرعات إضافية من البوبرينورفين حسب الحاجة.
- السماح الفئران للتعافي من الإجراء لا يقل عن 2 أيام قبل أخذ القياسات IOP. قياس IOP كما هو موضح في 3.2. مونيتور IOP مرة واحدة على الأقل في الأسبوع أو أكثر في كثير من الأحيان، حسب الحاجة، وفي نفس الوقت من اليوم لتقليل التقلبات المرتبطة الإيقاعية.
- لقياس الضغط داخل المقلة، استخدم العين المقابل من الماوس تعمل بمثابة الرقابة الداخلية. بدلا من ذلك، استخدام القياسات من سليمة الضوابط غير تشغيلية، أو الفئران الشام التي تديرها كما ساذجة.
4. تقييم الشبكية العقدة سوما خلية وأكسون البقاء على قيد الحياة
- يروي الفئران تعرض لارتفاع ضغط الدم في العين عن طريق الحقن intracardial 0.1 M حل العازلة الفوسفات (PBS) وتليها مباشرة الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA).
- يروي سليمة الفئران، غير تشغيلية كما هو موضح في 4.1 واستخدامها والضوابط لم يصب. لا ينصح استخدام العينين المقابل من الفئران تعمل على تقييم RGC البقاء على قيد الحياة بسبب التغيرات في عيون المقابل التالية إصابة تم الإبلاغ 15،16، ويمكن أن خلطا بين تفسير البيانات. بدلا من ذلك، استخدام عيون الشام التي تديرها حقنوا 10.5 ميكرولتر من BSS والضوابط.
- باستخدام microscissors، وقطع بعناية النسيج الضام حول العين لعزلها من محجر العين. فصل العصب البصري من العين عن طريق قطع عليه على مستوى رأس العصب البصري.
- باستخدام 30 إبرة G، وجعل ثقب في القرنية للسماح للاختراق من الحل تثبيتي في العين. وضع العين في 4٪ PFA واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية لتثبيت إضافية.
- وضع العصب البصري في محلول يحتوي على 2٪ PFA و 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M الصوديوم كاكوديلات (MW: 214 غرام / مول)، واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية لمدة تثبيت إضافية.
5. شبكية العين الكمي لRGC سوما الكثافة على شقة محمولة
ملاحظة: يتم تكييف الإجراء التالي من بروتوكول من جانب نادال نيكولا آخرون 17 ويحدد الكمي من RGCs باستخدام الأجسام المضادة ضد علبة مثلية / POU 3A البروتين المجال الدماغ محددة (Brn3a) على شبكية العين يتصاعد مسطحة. ميث البديلالمواد المستنفدة للأوزون لوصفها RGCs يمكن أن تستخدم أيضا بما في ذلك المناعية مع الأجسام المضادة ضد بروتين ملزم RNA مع الربط المتعدد (RBPMS) أو وضع العلامات إلى الوراء مع Fluorogold أو الجاذبة.
- تشريح تحت المجهر، وإزالة الجزء الأمامي من العين عن طريق شق على طول حوف كامل حتى تنفصل القرنية بسهولة. إزالة القرنية والعدسة. بعناية فصل شبكية العين من العين عن طريق جعل التخفيضات على طول مشرشر أورا والعصب البصري.
- إعداد الشبكية شقة جبل بجعل أربعة شقوق صغيرة على مسافة واحدة من المحيط الخارجي للشبكية العين نحو العصب البصري لتحديد بوضوح أربعة أجزاء الشبكية. باستخدام فرشاة صغيرة، وإزالة بلطف أي الزجاجي المتبقية من الشبكية. إزالة أكبر قدر من الفكاهة زجاجي ممكن أمر بالغ الأهمية للحصول على إشارة المناعى نظيفة وقوية.
- نقل بعناية شبكية العين إلى لوحة الثقافة مسطحة القاع 48-جيدا تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني بحيث الشبكيةالتعويم الحر. تأكد من طبقة الخلايا العقدية متجهة لأعلى.
- وضع لوحة الثقافة في -70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذوبان شبكية العين، وزيادة permeabilize عن طريق الغسيل مرتين في طازجة 2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
- تمييع الضد Brn3a إلى 0،3-0،5 ميكروغرام / مل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ تريتون X-100 و 2٪ الحمار العادي المصل. احتضان شبكية العين في حل الأجسام المضادة الأولية Brn3a عن طريق هز بلطف O / N عند 4 درجات مئوية. شبكية العين يجب أن تكون مغمورة تماما في 150-200 ميكرولتر من الحل في جميع الأوقات.
- تمييع حمار المضادة للماعز مفتش الأضداد الثانوية إلى 2 ميكروغرام / مل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ تريتون X-100 واحتضان شبكية العين في هذا الحل لمدة 2 ساعة على RT مع اهتزاز لطيف. شبكية العين يجب أن تكون مغمورة تماما في حل الأجسام المضادة في جميع الأوقات. تغطية لوحة الثقافة مع رقائق الألومنيوم لالخطوات المتبقية لمنع photobleaching من.
- باستخدام فرشاة، ونقل بعناية شبكية العين على شريحة بحيث تكمن الأنسجة مسطحة كما نقاط البيعsible. الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة. جبل استخدام الألغام المضادة تتلاشى المتوسطة المتزايدة.
- فحص الشبكية يتصاعد مسطحة تحت المجهر الفلورسنت. تحديد عدد Brn3a RGCs إيجابية في ثلاثة مجالات غير متداخلة في الربع شبكية العين كما هو موضح. 18
6. الكمي لRGC محاور عصبية في العصب البصري أقسام الصليب
- جمع العصب البصري من الخطوة 4.5 واحتضان في 2٪ رباعي أكسيد الأوزميوم (أوسو 4، MW 254.23 جم / مول) لمدة 2 ساعة.
تنبيه: نظرا لسميته العالية، وينبغي التعامل مع رباعي أكسيد الأوزميوم في غطاء الدخان مع الملابس المختبر المناسب. - يذوى العصب البصري عن طريق غمر في زيادة تركيزات الإيثانول (50٪، 70٪، 90٪، 95٪، و 100٪) لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- إعداد راتنجات الايبوكسي باستخدام الوصفة التالية: 15.72 مل تضمين-812، 6.45 مل dodecenyl السكسينك، 7.83 مل نادك الميثيل أنهيدريد، 0.45 مل DMP-30.
- بالتتابع احتضان العصب البصري في حلول تتألفمن النسب التالية من راتنجات الايبوكسي لأكسيد البروبيلين (MW 58.08 جم / مول): 0: 1، 1: 1، 0.75: 0.25، و 1: 0. وحضنت العصب البصري في كل حل على RT لO / N الفترة.
- احتضان الأعصاب البصرية جزءا لا يتجزأ من 100 الراتنج الايبوكسي٪ (الخطوة الأخيرة من 6.4) عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة إضافية.
- توليد شبه رقيقة البصرية المقاطع العرضية العصبية (0.75 ميكرون) باستخدام مشراح.
- وصمة عار المقاطع العرضية العصب البصري مع 1٪ طولويدين الأزرق.
- تحديد المحاور RGC في خمسة مجالات غير متداخلة من كل قسم العصب البصري كما هو موضح 19.
Representative Results
أدى حقن ميكروبيدات المغناطيسي في الغرفة الأمامية من الفئران الكبار الموصوفة في هذا البروتوكول في الارتفاع القوي وقابلة للتكرار من معهد جامعة هارفارد. أسبوع واحد بعد العملية، وزيادة الضغط داخل المقلة من 10 ± 0.6 ملم زئبق (يعني ± SEM)، متوسط IOP الأساس في عيون المقابل، إلى 19 ± 0.5 ملم زئبق في عيون ارتفاع ضغط الدم (ر الطالب -test؛ *** ع <0.001، ن = 12، الجدول 1، الشكل 2). استقرت IOP بعد ذلك وبقيت مرتفعة بمعدل 20 ملم زئبق لمدة 6 أسابيع على الأقل، وهي أطول وقت نقطة فحصه في هذه الدراسة. وكان متوسط ذروة IOP في عيون حقن ميكروبيدات في 2 و 3 و 6 أسابيع بعد الجراحة 25 ملم زئبق. وضعت الغالبية العظمى من الفئران التي عولجت المستدام IOP عالية، لذلك هذا البروتوكول لا يتطلب حقن الثاني من ميكروبيدات.
لتقييم الوقت طبعا من فقدان RGC في هذا النموذج، كان RGC سوماكميا لأول مرة من قبل المناعية مع Brn3a، على بعد RGC محددة علامة 17. وكميا في عدد الخلايا Brn3a إيجابية على شبكية العين التي شنت مسطحة في 1 و 2 و 3 و 6 أسابيع بعد تحريض من ارتفاع ضغط الدم في العين. وعلى الرغم من الكشف عن ارتفاع الضغط داخل المقلة كبير في وقت مبكر من الأسبوع 1 بعد حقن ميكروبيدات، لم يلاحظ أي خسائر كبيرة في RGC سوما ضمن 2 أسابيع الأولى من الإجراء (الشكل 3). كبير الموت RGC (22٪)، ومع ذلك، كان واضحا في 3 أسابيع (2430 ± 67 RGCs / مم 2، يعني ± SEM، ن = 12) و 6 أسابيع (2350 ± 74 RGCs / مم 2، ن = 10) مرحلة ما بعد تحريض ارتفاع ضغط الدم في العين، مقارنة عيون مراقبة سليمة من الفئران التي تديرها الامم المتحدة (3141 ± 49 RGCs / مم 2، ن = 23) (أنوفا، ف <0.001).
ضعف وانحطاط من المحاور RGC هو سمة أساسية من الزرق. لذلك، تم فحص فقدان محور عصبي في 3 و 6 أسابيع بعد الحقن ميكروبيدات بواسطةالكمي من المحاور RGC في العصب البصري عبر أقسام ملطخة الأزرق طولويدين (الشكل 4). ولوحظ وجود خسارة كبيرة من المحاور RGC (25٪) في 3 أسابيع (28401 ± 702 المحاور / العصبية، يعني ± SEM، ن = 5) و 6 أسابيع (29426 ± 948 المحاور / العصبية، ن = 6) بعد حقن ميكروبيدات مقارنة الأعصاب البصرية سليمة من عيون تديرها الامم المتحدة (39467 ± 137 المحاور / العصبية، ن = 4) (أنوفا، ف <0.001). بشكل جماعي، وهذه البيانات تظهر أن حقن ميكروبيدات المغناطيسي في غرفة الماوس الأمامي يؤدي إلى استنساخه وIOP الارتفاع الذي ينتج في RGC سوما وانحطاط عصبي يستمر.
| الوقت بعد الجراحة OHT | N | يعني IOP (مم زئبق) ± SEM | ذروة IOP (مم زئبق) | ||||
| الجزء المقابل | زرق | ديfference | الجزء المقابل | زرق | |||
| 1 أسبوع | 12 | 10 ± 0.4 | 19 ± 0.5 | 9 ± 0.6 | 12 ± 0.4 | 22 ± 0.6 | |
| 2 أسابيع | 13 | 11 ± 0.5 | 20 ± 0.8 | 9 ± 0.5 | 12 ± 0.9 | 25 ± 0.7 | |
| 3 أسابيع | 10 | 11 ± 0.8 | 20 ± 0.7 | 10 ± 0.9 | 13 ± 0.2 | 25 ± 0.9 | |
| 6 أسابيع | 12 | 12 ± 0.5 | 20 ± 0.6 | 9 ± 0.7 | 13 ± 0.5 | 24 ± 0.6 | |
الجدول 1. ارتفاع ضغط العين في الفئران المغناطيسي ميكروبيدات Occlusiعلى نموذج. وفي أنثى مستيقظا C57 BL / 6 الفئران، تم قياس IOP باستخدام مقياس التوتر انتعاش معايرة. عرض العينين تعمل زيادة في الضغط داخل المقلة الكشف في أسبوع واحد بعد الجراحة التي ظلت مرتفعة لمدة ستة أسابيع على الأقل بعد العملية.
الشكل 1. سير العمل من الخطوات المتبعة في المغناطيسي ميكروبيدات انسداد نموذج الفئران من الزرق. خطوة بخطوة الخطوط العريضة لجميع الإجراءات المتبعة قبل وأثناء وبعد الجراحة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. زيادة في ضغط العين في الفئران المغناطيسي ميكروبيدات انسداد النموذجي. وفي مستيقظاالإناث C57 BL / 6 الفئران، تم قياس IOP باستخدام مقياس التوتر انتعاش معايرة. كانت مرتفعة للمعالج ادخال و اخراج العيون حقن ميكروبيدات بشكل كبير في الاسبوع ما بعد الجراحة واحدة (أنوفا، ف <0.001). ظلت معالج ادخال و اخراج مرتفعة بشكل ملحوظ نسبة إلى عين المقابل من حقن الفئران لمدة 6 أسابيع على الأقل (أنوفا، ف <0.001). (سليمة: ن = 12؛ 1 الأسبوع: ن = 12، 2 أسابيع: ن = 13، 3 أسابيع: ن = 10، 6 أسابيع: ن = 12). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم تصور الشكل 3. الشبكية العقدة موت الخلية في الفئران المغناطيسي ميكروبيدات انسداد النموذجي. RGCs بواسطة المناعية من شبكية العين شنت مسطحة باستخدام Brn3a في شبكية العين سليمة سيطرة (A)، وشبكية العين زرقية في 3 و 6 أسابيع بعد الحقن ميكروبيدات للحثارتفاع ضغط الدم في العين (OHT) (B، C). أشرطة النطاق: 20 ميكرون. (د) التحليل الكمي وأكد أن حقن ميكروبيدات أدى إلى فقدان هامة سوما RGC في 3 و 6 أسابيع بعد إجراء مقارنة للسيطرة على العينين. يظهر كثافة سوما RGC في حالها، C57 غير زرقي / BL6 الفئران كمرجع (أشرطة بيضاء، و 100٪ البقاء على قيد الحياة). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM (سليمة: ن = 23؛ 1 الأسبوع: ن = 6، 2 أسابيع: ن = 6، 3 أسابيع: ن = 12، 6 أسابيع: ن = 10، أنوفا، *** ع < 0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. محور عصبي تنكس في المحاور المغناطيسي ميكروبيدات انسداد النموذجي. RGC الفئران كانت تصور من قبل تلطيخ من العصب البصري عبر المقاطع مع طولويدين الأزرق فيالسيطرة على حالها (A)، وشبكية العين زرقية في 3 و 6 أسابيع بعد الحقن ميكروبيدات للحث على ارتفاع ضغط الدم في العين (OHT) (B، C). أشرطة النطاق: 10 ميكرون. (د) التحليل الكمي وأكد أن حقن ميكروبيدات أسفرت كبيرة فقدان محور عصبي RGC في 3 و 6 أسابيع بعد إجراء مقارنة للسيطرة على العينين. يظهر كثافة من المحاور RGC في حالها، C57 غير زرقي / BL6 الفئران كمرجع (أشرطة بيضاء، و 100٪ البقاء على قيد الحياة). يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM (سليمة: ن = 4؛ 3 أسابيع: ن = 5، 6 أسابيع: ن = 6، أنوفا، *** ع <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
Discussion
تقنية الفيديو المعروضة هنا يوفر مفصلة خطوة بخطوة تعليمات حول كيفية إجراء حقن intracameral من ميكروبيدات المغناطيسية للحث على نحو فعال وبتكاثر IOP الارتفاع في الفئران. هذه النتائج الإجراء في زيادة IOP حقت التي لا تتطلب حقن إضافية ويعزز اكتشاف سوما RGC وفقدان محور عصبي داخل 3 أسابيع الأولى من ارتفاع ضغط الدم في العين induction.Elevated IOP هو عامل خطر رئيسي لتطوير الزرق في البشر. لذلك، هذا هو الفئران العين نموذج الزرق التي تعتمد على ارتفاع ضغط الدم الثمين الذي لديه القدرة على مجموعة واسعة من التطبيقات.
والعيب المشترك المرتبطة حقن ميكروبيدات في الغرفة الأمامية يتعلق حبة الجزر من خلال موقع الحقن عندما يتم سحب الإبرة، والذي غالبا ما يؤدي إلى إعاقة جزئية فقط من تدفق مائي وزيادة التقلبات. لمعالجة هذه القضية، تم تنفيذ العديد من التعديلات الهامة. التنوب ر، وإعداد دقيق ل، إبرة مجهرية زجاج حادة نظيفة مع شطبة الأوجه أمر ضروري لنجاح الحقن من ميكروبيدات. وإبرة مجهرية أعدت بشكل صحيح يمكن اختراق للرقابة والسلس للالقرنية مع تطبيق الحد الأدنى من الضغط على سطح العين الحساسة. ثقب القرنية صغيرة يمنع ارتداد ميكروبيدات. بالإضافة إلى ذلك، إبرة مجهرية غرامة يقلل من خطر الهياكل القريبة الضارة مثل القزحية والعدسة، والذي يمكن أن يؤدي إلى التهاب غير المرتبطة المرض. ثانيا، تطبيق نقطة جذب يده إلى مناطق بصري الاستراتيجية أثناء وبعد الحقن جانبا مهما آخر لهذه التقنية. خلال الحقن، ويستخدم المغناطيس لرسم ميكروبيدات المغناطيسية إلى غرفة منع ارتداد الأمامي من ميكروبيدات عندما يتم سحب إبرة مجهرية. بعد الحقن، ثم يستخدم المغناطيس لتوجيه ميكروبيدات إلى زاوية القزحية القرنوية لمنع تدفق مائي النكتة.
خيمة "> وثمة مشكلة أخرى كثيرا ما تصادف في نماذج انسداد ميكروبيدات هو أن حقن حبة متكررة وغالبا ما تكون ضرورية لتحقيق حقت IOP ارتفاع 10،11. وهذا قد يكون نتيجة لميكروبيدات طرد من زاوية القزحية القرنوية مع مرور الوقت. إن الجمع بين المغناطيس يده، كما هو موضح أعلاه، وتحديد المواقع من الفأرة بعد العملية بشكل كبير على تحسين النتيجة. إن استخدام التخدير عن طريق الحقن، والتي تتيح المرونة لتحريك الرأس أثناء الإجراء، وتتطلب فترة نقاهة لفترة أطول بعد الجراحة، ويحظي. التنسيب لل الفأر مع العين تعمل متجهة لأعلى لبضع ساعات بعد الجراحة يساهم في تسوية ميكروبيدات في زاوية القزحية القرنوية ويقلل من خطر طرد مرة أخرى في الغرفة الأمامية.ضمان أن عدد حبات حقن يتسق نسبيا هو خطوة حاسمة أخرى لتقليل الاختلافات بين الحيوانات. منذ ميكروبيدات تستقر في بottom من الأنبوب، فمن الضروري أن التجانس التام الحل ميكروبيدات وسحب حجم مناسب في إبرة مجهرية في الوقت المناسب. حقن عدد أقل من الخرز في الغرفة الأمامية يمكن أن يؤدي إلى انسداد غير كامل من الهياكل الفكاهة الصرف المائية، التي من المرجح أن يؤدي ذلك إلى ضعف أو متغير الارتفاع IOP. وتجدر الإشارة، على الرغم من أن الهدف النهائي للحقن ميكروبيدات هو رفع الضغط داخل المقلة، ينبغي اتخاذ الحذر عند قياس IOP من الفئران مستيقظا أعلى من ذروة القيم الواردة في هذه الدراسة (~ 25 مم زئبق). غاية معالج ادخال و اخراج عالية تزيد من خطر الأضرار الدماغية، ويمكن أيضا أن يسبب الألم للحيوان. ينبغي النظر في ارتفاع الضغط داخل المقلة واحدة من العديد من العوامل في تقييم نجاح الجراحة. على هذا النحو، ينبغي قياس نتائج الإجراء بناء على عدة معايير منها ارتفاع الضغط داخل المقلة، RGC موت سوما، وفقدان محور عصبي.
على الرغم من أن بروتوكول الموصوفة هنا النتائج في معظم ميكروبيدات ناجحةلاي تسوية في زاوية، وجود قيود المحتملة لهذا النموذج هو أن تلك الخرزات التي لا تزال عائمة في الغرفة الأمامية قد تتداخل مع تصوير الشبكية الحية من خلال القرنية، وكذلك فحوصات الكهربية أو السلوكية التي تتطلب مرور الفعال للضوء. جانب آخر مهم في الاعتبار عند استخدام هذا النموذج انسداد ميكروبيدات غير أن مدى IOP الارتفاع والانحطاط RGC لاحق يختلف مع العمر والخلفية الوراثية للفأرة تعمل [4]. ولذلك، فإن مدى IOP الارتفاع والجدول الزمني للRGC انحطاط يجب أن يتم تحديد لكل خط محدد وراثيا الماوس و / أو الفئة العمرية.
وهناك ميزة هذا النموذج هي أن النتائج IOP مرتفعة في الفقدان التدريجي للوفاة RGC خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد الحقن ميكروبيدات، والموت كبير RGC تم الكشف في 3 أسابيع بعد العملية. وبالتالي، فإن هذا النموذج يمكن النظر في التغييرات في وقت مبكر و / أو الدقيقة التي تحدث في هذا دisease، قبل الصريحة RGC سوما وفقدان محور عصبي. لم يكن لوحظ زيادة كبيرة في وفاة RGC بين 3 و 6 أسابيع بعد تحريض من ارتفاع ضغط الدم في العين. في الواقع، لا تزال RGC سوما ومحوار خسارة مستقرة في ~ 22-25٪ ما بين 3 و 6 أسابيع على الرغم من النجاح وIOP ارتفاع حافظت على هذه النقاط مرة. قد تكون هناك حاجة لمدة أطول من IOP مستمرة لفقدان RGC إضافية تحدث في C57BL / 6 الفئران، التي يبدو أنها أكثر مقاومة للضرر RGC مقارنة مع سلالات الفئران الأخرى. 5 تعديلات إضافية على بروتوكول المعروضة هنا، بما في ذلك تعديل حجم حبة وحقن إضافية، قد تكون هناك حاجة لدراسة فقدان RGC في نقطة زمنية لاحقة. لذلك، لدينا بروتوكول مثالية للدراسات تركز على التغيرات المرضية المبكرة التي ترتبط مع متواضع التنكس العصبي RGC التي هي ذات الصلة إلى ظهور وتطور في وقت مبكر من الزرق البشري.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm |
| Stereo Microscope | Zeiss | MZ9.5 | Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery. |
| Footswitch | Linemaster | T-91-SE | |
| Stainless Steel Blade | Feather | No. 11 | |
| Microelectrode Beveler | Science Products | BV-10 | |
| Aerosol Duster | Fisher | 23-022-523 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Dynabeads M-450 Epoxy | Life Technologies | 14011 | Magnetic beads are 4.5 µm in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 108 beads/ml. Store at 4°C. |
| Mini-Tube Rotators | Fisher Scientific | 05-450-127 | |
| 3 Handheld Magnets | Geomag | 0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery. | |
| 25 ml serological pipet | Costar | 4489 | |
| Pipet | Drummond | 4-000-101 | |
| Biological Containment Hood | Biostad | 377355 | |
| Balanced salt solution (BSS) | Alcon | 0065-0800-25 | |
| P1,000 Micropipet | Gilson | F123602 | |
| Microtube 1.5 ml | Sarstedt | 72.690 | |
| P200 Micropipet | Gilson | F123601 | |
| 0.2 ml PCR tube | Sarstedt | 72737.002 | |
| Ketamine | Controlled substance | ||
| Xylazine | Bayer Healthcare | ||
| Acepromazine | Vetoquinol | ||
| U-100 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company | 329461 | |
| Balance | Ohaus | CS 200 | |
| Buprenorphine | Controlled substance | ||
| Tropicamide ophthalmic solution | Alcon | 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Platform | Fisher Scientific | 14-673-52 | 8 x 8 inch |
| Absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| P20 Micropipet | Gilson | F123600 | |
| Plastic forcep | Euroband | 1001 | Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye |
| Fluoroquinolone ophthalmic solution | Alcon | Vigamox | |
| Heating pad | Sunbeam | E12107-834 | |
| Tonometer | iCare | TV02 | TONOLAB rebound tonometer |
| Paraformaldehyde, Para | Fisher Scientific | T353-500 | |
| Dissection tools | |||
| Small brush | |||
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G7651 | |
| Sodium Cacodylate, tryhydrate | Canemco and Marivec | 124-65-2 | |
| Brn-3a antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-31984 | |
| Tissue Culture Plate, 48 well | Falcon | 353078 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Life Technologies | A-11058 | |
| Aluminum foil | |||
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Slow fade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5E | |
| Osmium tetroxide 2% aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 3294949 | |
| Embed-812 | Electron Microscopy Sciences | 14900 | |
| Dodecenyl succinic anhydride | Electron Microscopy Sciences | 13710 | |
| Nadic methyl anhydride | Electron Microscopy Sciences | 19000 | |
| DMP-30 | Electron Microscopy Sciences | 13600 | |
| Propylene oxide | Sigma-Aldrich | 110205-1L | |
| Embedding mold-Dykstra | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| Porter-Blum ultra-microtome | Sorvall | MT-2 | |
| Toluidine blue O (Certified Biological Stain) | Fisher-Scientific | T161-25 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).
- Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
- Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma. Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).
- Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J Vis Exp. , (2015).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).
- El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types. Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).
- Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension. Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).
- Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death. Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).
- Weber, A. J., Zelenak, D. Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres. J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).
- Ho, L. C., et al. In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).
- Yang, Q., et al. Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).
- Gallego, B. I., et al. IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma. J neuroinflammation. 9, 92 (2012).
- Rojas, B., et al. Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers. J neuroinflammation. 11, 133 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).
- Morquette, B., et al. REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury. Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).
- Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors. Cell Death Dis. 1, 27 (2010).
