Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

معايير التحليل الكمي Metalloproteomic عن طريق الحجم استبعاد ICP-MS

doi: 10.3791/53737 Published: April 13, 2016

Introduction

المعادن الأساسية تلعب دورا حيويا في الوظائف البيولوجية الطبيعية، بما في ذلك مسارات رسول الثانوية، مسارات الأيض ووظائف عضية. ويعتقد 30٪ من البروتينات لتكون metalloproteins 1 و 50٪ من جميع الإنزيمات 2. Metalloenzymes استخدام هذه المعادن النزرة مثل العوامل المساعدة على تحفيز التفاعلات الكيميائية، وتحقيق الاستقرار في بنية البروتين، والأدوار التنظيمية مثل رسل الثانوية. بعض العناصر النزرة الأكثر دراسة في ما يخص التنكس العصبي هي النحاس والحديد والزنك 3. ويعتقد أنها تشارك في العديد من مسارات المرض حيث من dyshomeostasis يمكن أن تؤثر بطريقة سلبية. على سبيل المثال وضع معدن الفائق (الاحمق) يؤثر بشكل مباشر على مدى الحياة والنمط الظاهري من نماذج الفئران المعدلة وراثيا من نوع عائلي من مرض التصلب الجانبي الضموري (ALS) (4). في مرض الزهايمر، وقد استخدمت تقنيات metalloproteomics لاكتشاف انخفاض في وضع المعدن من ترانسفيرين في صlasma 5. وتبرز هذه الدراسات يمكن أن metalloproteins الدور الهام الذي تقوم به في المرض.

دراسة metalloproteins مباشرة من الأنسجة البيولوجية هو حقل النامية. على الرغم من أن بعض metalloenzymes اتسمت، فإن الغالبية لا تزال uncharacterized أو غير معروف (6). أحد التحديات الرئيسية في metalloproteins قياس هو شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتين 7. الكلاسيكية من أسفل إلى أعلى تقنيات البروتين تعتمد على هضم البروتينات إلى ببتيدات. يعطل هذه العملية تفاعل غير التساهمية من المعادن والبروتينات الخاصة بهم. وهكذا، واكتسبت أي معلومات عن حالة المعادن من البروتين.

طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام اللوني حجم الإقصاء يقترن إضافة بالحث البلازما - الشامل 8،9 الطيف (SEC-ICP-MS). وهذا يولد المعلومات حول حجم تقريبي البروتين وكذلك أي المعادن التي ASSOCiated معها 10. وعلاوة على ذلك، حجم الإقصاء هو أسلوب الكروماتوغرافي لطيف التي يمكن أن الحفاظ على الدولة الأم إنزيم أو البروتين البروتين مجمع. ومن مزايا استخدام البلازما إضافة بالحث - الطيف الكتلي (ICP-MS) هو طابع كمي للتكنولوجيا. باستخدام مجموعة من المعايير metalloproteins فمن الممكن لتوفير الكميات المطلقة من metalloproteins من العينات البيولوجية 9،11. ويتحقق ذلك عن طريق توليد منحنى القياسية عن طريق حقن metalloproteins تعرف على مجموعة من تركيزات المعادن.

ويظهر هذا البروتوكول مثال عن كيفية هذا لا يمكن أن يتحقق لمجموعة متنوعة من المعايير metalloprotein. في هذه الورقة ونحن نهدف إلى إنشاء منحنيات القياسية للمعادن التي يتم التحقيق فيها إلى حد كبير في المجالات البيولوجية بما في ذلك الحديد (الحديد) والنحاس (النحاس) والزنك (الزنك) واليود (I)، والكوبالت (المشارك).

Protocol

1. إعداد المخازن والعينات

  1. إعداد 500 مل من العازلة، 200 ملي نترات الأمونيوم درجة الحموضة 7،6-7،8 (تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الأمونيوم (NH 4 OH)) مع السيزيوم (جيم) والتناقض (بينالي الشارقة) إضافة إلى تركيز النهائي من 10 جزء في البليون. استخدام السيزيوم والتناقض عن المعايير الداخلية لمراقبة أي انحراف في رد ICP-MS. قبل عازلة مرشح لاستخدام من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
  2. تحضير العينة حسب نوع العينة: السائل، نسيج أو خلية ثقافة.
    1. للعينات التي تتطلب التجانس (على سبيل المثال، الأنسجة أو الخلايا)، تأكد من أنها لا تحتوي على مواد التنظيف. استخدام العازل تريس لإعداد العينات. بدلا من ذلك، استخدم مخازن الفوسفات ولكنها يمكن أن تؤثر سلبا على metalloproteome مع مرور الوقت أو مع دورات ذوبان التجميد 12.
    2. التجانس الأنسجة أو ثقافة الخلية عينات من dounce اليدوي أو صوتنة لمدة 5 دقائق باستخدام تريس مخزنة المالحة (50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 150 مم كلوريد الصوديوم(كلوريد الصوديوم) + ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) مثبطات الأنزيم البروتيني الحرة).
    3. توضيح الخليط بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق. جمع طاف الناتجة عن ذلك. الاحتفاظ بعينات عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب طرد جميع العينات قبل تحميل في اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) قارورة لمنع الجسيمات من حظر العمود حجم الإقصاء اللوني (SEC).
  3. تطبيع المبلغ الإجمالي للبروتين تحميلها على العمود عبر العينات. تحديد تركيزات البروتين في 280 نانومتر باستخدام حجم الصغير للأشعة فوق البنفسجية طيفي 13. الحمل بين 20 و 150 ميكروغرام من البروتين. استخدام حقن كميات نموذجية تتراوح 2-80 ميكرولتر اعتمادا على تركيز العينة.
    1. تنظيف ذراع عينة من الصغير معمل حجم الأشعة فوق البنفسجية مع الماء المقطر قبل تحميل عينة. الذراع العينة التي يتم فيها تحميل عينات البروتين.
    2. فارغ الصك ضد 2 ميكرولتر من العينة العازلة ه. ثم، تحميل 2 ميكرولتر من كل عينة على الذراع وقياس الامتصاصية في 280 نانومتر.
    3. تحديد التركيزات. للحصول على عينات من البروتين الخام، استخدام معامل انقراض 1 عبس = 1 ملغ / مل. لتحديد تركيز البروتين في عينات، استخدام قانون بير لامبرت، A = ε xlxc، حيث A هو الامتصاصية، ε هو معامل الانقراض، ل هو طول المسار في سم و c التركيز.

2. تحليل السائبة المعايير Metalloprotein طريق إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي

  1. الاحماء وضبط أداة تستخدم بروتوكولات الشركة المصنعة.
  2. بمجرد تحسنت أداة صعودا وضبطها، نفذ الجزء الأكبر ICP-MS.
    ملاحظة: الحلول المالية من metalloproteins النقاء عموما بحاجة إلى أن تضعف قبل القياس. ويمكن تقدير تركيز المعادن من مستوى من البروتين المعروف: stochiometries المعادن والبروتين concentra يقدرنشوئها. ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد التخفيف الذي سوف يكون من المناسب أن تقع ضمن نطاق المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه.
    1. تمييع المعايير metalloprotein، ثايروجلوبولين، الفيريتين، سيرولوبلازمين، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود وفيتامين ب 12، للتأكد من أنها تقع ضمن مجموعة من 0-500 ميكروغرام / لتر، وذلك باستخدام حمض النيتريك 1٪. لتحقيق المعايير ضمن هذا النطاق، لا تستخدم التخفيفات تتجاوز 1 في 20. تنفيذ التخفيفات المسلسل في الماء لتخفيف الأسهم قبل ذلك إذا لزم الأمر.
    2. إعداد ترتيب الحقن. أولا، تحليل مستويات معايرة سبعة، بتركيزات تتراوح 0-500 ميكروغرام / لتر، تليها المعايير metalloprotein. مستويات معايرة السبعة هي 0، 1، 5، 10، 50، 100 و 500 ميكروغرام / لتر.
    3. تحديد العناصر المثيرة للاهتمام. هنا، استخدم الحديد، النحاس، الزنك، شركة وأنا، لأنها هي العناصر التي المعايير بروتين ملزمة ل. حدد العناصر في طريقة الشراء عن طريق فتح علامة التبويب محدد عنصر وإضافة إيليمي اليلة والجماهير نظير كل منهما التي سيتم تحليلها.
    4. لتحليل عينة مع الصك والبرمجيات أداة تلقائيا بإنشاء منحنيات المعايرة لكل من العناصر التي يجري تحليلها. يتم إنشاء منحنيات المعايرة من قبل البرنامج عن طريق التآمر التهم / ثانية من المعدن الكشف على كمية من المعدن أن المعيار هو المقصود لاحتواء، في ميكروغرام / لتر. استخدام منحنيات المعايرة لتحديد تركيز المعادن في عينات غير معروفة.
      ملاحظة: استخدام منحنى المعايرة، والبرنامج يحدد تركيز المعادن في كل من المعايير metalloprotein.
    5. من نتائج تحليل بكميات كبيرة، وتوليد معايير metalloprotein التي تشمل العناصر النزرة الأكثر وفرة ثلاثة في أنسجة الثدييات باستخدام مزيج من النحاس والزنك الفائق (الاحمق) المخفف إلى 200 ميكروغرام / لتر من النحاس والزنك والفيريتين (FTN) في المباراة النهائية تركيز 2000 ميكروغرام / لتر من الحديد.
jove_title "> 3. إعداد نظام HPLC والحجم الاستبعاد اللوني العمود موازنة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذا القسم بالتوازي مع السابق، لأنها على حد سواء المطلوبة عن 1-1،5 ساعة لإكمال.

  1. مضخات تطهير HPLC مع العازلة في الخطوة 1.1 و تطهير مضخات لمدة 5 دقائق في معدل التدفق من 5 مل / دقيقة.
  2. مرة واحدة يتم إزالة النظام، تعيين معدل التدفق عند 0.1 مل / دقيقة، وربط العمود استبعاد حجم (4.6 س 300 ملم، 3 ميكرون، 150 أ).
    ملاحظة: اتصال الرطب بين الأنبوب والعمود يتجنب أي فقاعات الهواء التي حوصر أثناء الاتصال من العمود.
  3. قم بتوصيل الطرف الآخر من العمود إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية المقرر أن قياس الامتصاصية في 280 نانومتر باستخدام أنابيب نظرة خاطفة.
  4. زيادة تدريجية في معدل تدفق العمود في الزيادات من 0،05 حتي 0،1 مل / دقيقة حتى معدل التدفق النهائي من 0.4 مل / يتم التوصل دقيقة. في حين أن هذا يحدث، والتحقق من وصلات الأنابيب إلى العمود لأي تسرب. مراقبة الضغطمن هذا النظام لضمان عدم تجاوز متطلبات العمود بملاحظة أثر الضغط على اللوني في البرنامج.
  5. ترك عمود للتوازن في معدل التدفق المطلوبة خلال 5-10 أحجام العمود. بعد معايرتها ذلك، ربط الصكوك للسماح للتحدث تحليل العينات.
  6. إعداد طريقة HPLC ما يصل الى ضخ العازلة وفوق العمود عند 0.4 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.

4. إعداد وتشغيل الحجم الاستبعاد - إلى جانب بالحث البلازما - الطيف الكتلي

ملاحظة: قد تختلف إجراءات التشغيل بين الصكوك والنماذج. اتصل فني متخصص أداة لمعرفة المزيد حول كيفية تكوين ICP-MS المستخدمة.

  1. وضع برنامج المقارنات الدولية - MS في وضع الاستعداد قبل تغيير الإعداد الأجهزة.
    1. مرة واحدة في وضع الاستعداد، وإيقاف الاتصالات لأخذ العينات السيارات وتغيير إدخال عينة إلى "الآخر".
      ملاحظة: اعتمادا على البرمجيات والصعبوير التكوين اختيار "HPLC" كمصدر إدخال عينة يمكن استخدامها. اتصل فني متخصص أداة لمعرفة ما إذا كان هذا الخيار متاحا.
  2. استخدام نظرة خاطفة أنابيب (ID 0.13 مم) لربط تدفق خارج من كاشف الأشعة فوق البنفسجية مباشرة إلى البخاخات على ICP-MS.
  3. قوة عمل نسخة احتياطية من برنامج المقارنات الدولية - MS وتسمح أداة في عملية الاحماء لمدة 10 - 20 دقيقة.
  4. بعد أن أشعلت البلازما، قم بتوصيل كابل بعيد من ICP - MS إلى الجزء الخلفي من الاوتوماتيكى HPLC. هل هذا مرة واحدة وقد أشعلت البلازما. وإلا فإن النظام HPLC سوف تلقائيا اغلاق منذ ICP - MS ليست على.
  5. تغيير أسلوب ICP-MS لجمع البيانات عن LC-ICP-MS.
    1. تغيير طريقة الشراء من الطيف لاكتساب الوقت عزم (الهيئة).
    2. حدد العناصر التي يتعين تحليلها، الحديد، النحاس، الزنك، شركة، وكذلك أي عناصر أخرى من المصالح، وتعيين أوقات التكامل (عادة ما بين 0،05 حتي 0،3 ثانية). بعد عناصر الفائدةإعادة اختياره، وضبط اكتساب الوقت لتتناسب مع وقت التشغيل لاللوني (على سبيل المثال، 900 ثانية لاللوني المدى 15 دقيقة).
    3. يدويا ضبط ICP - MS لالهليوم الحساسية والتصادم الخلية (هو) معدلات تدفق الغاز مع العازلة اللوني المتدفقة باستخدام جيم وبينالي الشارقة المدرجة في المخزن المؤقت. معدلات التدفق وعادة ما تكون ~ 1 مل / دقيقة أقل من تلك المستخدمة لتحليل الأكبر. وبمجرد أن التهم أيون المعدن قد استقرت والانحراف المعياري النسبي (RSD) القيم هم أقل من 5٪، والنظام جاهز للاستخدام.
  6. جعل عينة قوائم تشغيل في كل من البرامج ICP-MS HPLC و. تحتوي القائمة عينة المدى الترتيب فيها كل من العينات غير ليتم حقنه وكذلك الاسم الذي سيتم حفظ البيانات. تأكد من أن العدد الكلي للعينات في المباراة قائمة بين البرنامجين.
  7. بدء الدفعة عينة لICP-MS قبل HPLC، وحقن العينة من قبل HPLC سوف يؤدي ICP - MS للبدء في جمعالبيانات. إذا لم يتم ذلك في الترتيب الصحيح أنه سيؤدي إلى البيانات المفقودة.
  8. توليد نقاط منحنى المعايرة عن طريق حقن كميات متفاوتة من الهيئة العامة للسدود وFTN معيار مختلط من 200 ميكروغرام / لتر إلى 6000 ميكروغرام / لتر حقن على عمود النحاس والزنك و2،000 ميكروغرام / لتر إلى 60000 ميكروغرام / لتر بالنسبة الحديد. وتتراوح أحجام حقن 1-30 ميكرولتر.
    ملاحظة: هذه النطاقات تركيز تشمل تركيزات الحديد والنحاس والزنك احظ عادة في الخليط المعقدة. للعينات التي تحتوي فقط على تنقية البروتينات ينبغي تعديل مداه الأقصى من منحنى وفقا لذلك. إذ أن كمية المعادن المرتبطة البروتين قد تتطلب مجموعة أصغر أو أكبر لأن هناك أقل تلوث في عينة من العوامل الأخرى.
  9. تحليل كل من زراعة الأنسجة عينات غير معروفة، البلازما أو الخلية.

5. تحليل البيانات، التلاعب والتخيل

  1. تخزين البيانات في قيمة مفصولة بفواصل (CSV) تنسيق ملف وتحميل طn لبرامج معالجة كما هو مطلوب.
  2. من أجل السيطرة على الانجراف الصك، تقسيم التهم في الثانية لكل عنصر من التهم في الثانية إما جيم أو بينالي الشارقة.
  3. توليد منحنيات المعايرة لكل من العناصر.
    1. تحديد المنطقة الواقعة تحت ذروة المعدنية التي تتطابق مع metalloprotein التي كان من المحتم أن لكل من الحقن عن طريق أداء ذروة التكامل في برنامج تحليل البيانات المفضل.
    2. رسم المنطقة تحت ذروة المعدنية ضد المبلغ الإجمالي للمعدن الذي تم حقنه على العمود في كل شوط، 200 - 6000 ميكروغرام / لتر النحاس والزنك و2،000 - 60،000 ميكروغرام / لتر بالنسبة الحديد. إجراء تحليل الانحدار الخطي وفقا لبروتوكول البرمجيات.
    3. استخدام النتائج المنحدر من تحليل الانحدار الخطي كعامل لتحويل التهم في الثانية إلى جزء من الغرام / ثانية. تقسيم كل من التهم لكل نقطة البيانات الثاني عبر اللوني من التدرج من قيمة خط.
  4. الرسم البياني للبيانات فيجزء من الغرام / ثانية ضد الوقت اللوني. تحديد المنطقة تحت قمم الفائدة. المنطقة تحت الذروة تمثل المبلغ الإجمالي من المعدن التي يرتبط بها بروتين ل، في ص.
  5. توليد المعايرة على أساس الوزن الجزيئي للmetalloproteins المعروف والوقت الذي أزل. استخدم هذا لتقدير حجم قمم البروتين في عينات معقدة.

Representative Results

استخدام المعايير metalloprotein يسمح لمعايرة العمود حجم الاستبعاد. ويبين الشكل 1A الشخصية شطف للمعايير ثايروجلوبولين، الفيريتين، سيرولوبلازمين، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود وفيتامين ب 12 على أساس المعدن أنهم لا بد أن (الحديد، شارك والنحاس والزنك وأنا). ويبين الشكل 1B منحنى المعايرة للعمود حجم الإقصاء على أساس الوزن الجزيئي للمعايير البروتين والوقت شطف التي قدمت في شكل حجم شطف (هاء) مقسوما على حجم الفراغ من عمود (فو). البروتينات المستخدمة لتوليد هذا المنحنى القياسي وكونكانافالين A، كونالبومين، سيرولوبلازمين، الفيريتين، الهيئة العامة للسدود وثايروجلوبولين.

ويبين الشكل 2A شطف من الفيريتين على مجموعة من 2000 - 60000 خريج من الحديد حقن على عمود والشكل 2D هو تحليل الانحدار القيام بها باستخدام صمنطقة EAK. أرقام 2B و2C هي ملامح شطف للنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود لالنحاس والزنك و2E و2F ونتائج تحليل الإنحدار تم إنشاؤها باستخدام مناطق الذروة. وتستخدم نتائج تحليل الانحدار لتحويل البيانات الخام في التهم / ثانية إلى جزء من الغرام / ثانية حتى كمية من المعادن المرتبطة البروتين يمكن تحديد الكمية. ويتم التحويل عن طريق تقسيم التهم / ثانية من قبل المنحدر من الانحدار الخطي (على سبيل المثال، 334.6 (العدد / ثانية) س (ثانية / PG) من النحاس).

وكما ذكر، هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد metalloproteins في العينات البيولوجية المعقدة. لقد تعرض الدماغ البشري والبلازما لهذه التقنية وأرقام 3 و 4 على التوالي، وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها. ويرد الدماغ البشري مفصولة SEC-ICP-MS في أرقام 3A-3C، كل واحدة منها تمثل مختلف المعادن من الفائدة (النحاس والزنك أو الحديد). أرقام 4A-4C تظهر آثار التي تم الحصول عليها عندما يتعرض البلازما البشرية لهذه التقنية. سوف تعقد وفرة من العينة يؤثر على عدد من القمم التي ينظر إليها. كما يهيمن البلازما المتوقع من قبل عدد قليل من metalloproteins بما في ذلك سيرولوبلازمين وترانسفيرين.

الشكل 1
الشكل 1. معايرة الحجم الاستبعاد اللوني - إضافة بالحث البلازما - الطيف الكتلي عن طريق المعروفة الشخصي Metalloproteins (A) شطف للمعايير metalloprotein بناء على المعادن كل منها. (ب) الوزن الجزيئي معايرة منحنى لثايروجلوبولين معايير البروتين (ط)، الفيريتين (ب)، سيرولوبلازمين (ج)، كونالبومين (د)، والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود (ت) وكونكانافالين ألف (السادس). "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. استخدام فيريتين والنحاس / الزنك الهيئة العامة للسدود كما معايير Metalloprotein لتحديد كمية النحاس، الحديد أو الزنك المصاحبة لMetalloproteins في عينة بيولوجية معقدة (A) لمحة شطف للالفيريتين على نطاق حقن 2000 - 60000 ميكروغرام / لتر من الحديد. (ب) و (ج) لمحة شطف عن الهيئة العامة للسدود النحاس / الزنك على نطاق حقن 200 - 6000 ميكروغرام / لتر من النحاس والزنك، على التوالي. (د) و (ه) و (F) تظهر نتائج تحليل الانحدار للمعادن الحديد والنحاس والزنك، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل 3. النحاس والحديد والزنك Metalloproteome من الإنسان الدماغ. (A) النحاس أثر (ب) أثر الحديد (C) الزنك أثر. يظهر شطف المعايير البروتين لكل معدن من أثر أسود مع الوزن الجزيئي بهم مبين في الرسم البياني. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. النحاس والحديد والزنك Metalloproteome البلازما البشرية. (A) النحاس أثر (ب) أثر الحديد (C) الزنك أثر. يظهر شطف المعايير البروتين لكل معدن من أثر أسود مع الوزن الجزيئي فيdicated تحت الرسم البياني. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ضمان الدولة الأم من البروتين يعني اهتماما خاصا للمخازن المستخدمة وهناك حاجة إلى تخزين العينة. ليس كل تقنيات اللوني أو تقنيات إعداد عينة يمكن استخدامها. من المهم أن المخازن المؤقتة المستخدمة في جميع أنحاء إعداد العينات واللوني خالية من chelators المعدنية ومخازن الاستخدام التي تحاكي درجة الحموضة والملح تركيزات الفسيولوجية. وتشمل الشروط الأخرى لتجنب التدفئة العينة أو إضافة denaturants البروتين (على سبيل المثال، اليوريا). فمن الأهمية بمكان أن تقليل عدد دورات ذوبان التجميد. قدرة المخزن المؤقت اختياره لربط المعادن ثنائي التكافؤ هو أيضا مهم وهو السبب في أن تريس أو الأمونيوم نترات مخازن يتم اختيار اكثر من مخازن الفوسفات.

القرار وذروة انخفاض قدرة اللوني حجم استبعاد نسبة إلى أشكال أخرى من اللوني وجود قيود كبير من هذه التقنية. ومع ذلك، فإن طبيعة لطيفة من حجم الإقصاء chromatograفيز مهم للحفاظ على حالة الأم من البروتين، وبالتالي الحفاظ على الروابط المعدنية البروتين ضعيفة نسبيا. شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتينات يتطلب اهتماما خاصا لمعالجة العينات بما في ذلك الحد من عدد دورات ذوبان التجميد، وتجنب chelators معدنية (على سبيل المثال، EDTA) أو أملاح chaotropic والمنظفات.

هذا القرار منخفضة من هذه الآثار التقنية والقدرة على قياس كمية من المعدن يرتبط مع بروتين معين إذا كان في عينة معقدة مثل قمم ينظر سوف تحتوي على بروتين أكثر من واحد. ولذلك، فإن كمية من المعدن مصممة باستخدام ذروة التكامل يكون مؤشرا من المبلغ الإجمالي من المعادن المرتبطة مع كل من البروتينات ويبلغ حجمه في هذه المرحلة من الوقت وليس واحدا فقط بروتين معين. ومن أجل التغلب على هذا القيد البروتين من الفائدة سوف يتعين زيادة تنقيته تحت الظروف المحلية. وسيتيح ذلك لتقدير حجمالمعدن المرتبطة بهذا البروتين ورود أنباء عن بدرجة أعلى من certainity. أن الحد محتمل آخر لهذه التقنية أن فقدان البروتين بسبب عكسها غير ملزم إلى العمود. من أجل تحديد ما إذا كان هذا يحدث تجربة الانتعاش ينبغي الاضطلاع بها حيث يتم تحليل كمية البروتين يبلغ حجمه قبالة العمود لتحديد ما إذا كان هذا يطابق كمية حقن. ونفس الشيء يمكن أن يتم ذلك عن طريق قياس المحتوى المعدني للمواد شطف والمواد بدءا من الجزء الأكبر ICP-MS. انتعاش عمود يمكن أن تختلف تبعا للظروف استخدامها، ولكن ثبت أن الشفاء الكامل من البروتينات من عمود استبعاد حجم ممكن 9. وبالتالي فمن المهم أن تحقق ما إذا كان أو لم يكن هناك أي خسارة تحت ظروف التشغيل المستخدمة.

تعديلات على بروتوكول يمكن أن تكون ذات صلة المعايير metalloprotein التي تستخدم فضلا عن عناصر تحليلها. نوع metalloprotein معيار لناسوف إد تختلف اعتمادا على العناصر التي تهم. لعناصر مثل النحاس، الحديد والبروتينات والزنك، ويعمل الهيئة العامة للسدود والفيريتين. ويمكن أيضا أن أي metalloprotein الأخرى التي لديها stoichometries المعروف أن تستخدم وثبت بضعة أمثلة منها هنا.

واحد المضاعفات الرئيسية التي يمكن أن تنشأ عن استخدام هذا الأسلوب هو تراكم بلورات الملح في شعلة ICP-MS. لمنع تراكم بلورات الملح، ويتم غسلها الشعلة مع الماء المقطر بعد كل 500 - 1000 مل من العازلة التي تم تمريرها من خلال نظام أو عندما يتم تحديد ذلك عن طريق التفتيش البصري أن الشعلة يجب غسلها. مشكلة أخرى التي يمكن أن تنشأ هو تراجع أكثر سرعة في نظافة العينة واستخراج المخاريط. هذه تحتاج إلى تنظيفها بشكل منتظم التالية بروتوكولات الشركة المصنعة.

إعداد العينة الأولي هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. إذا كانت هناك أية تغييرات على بروتين - مجمع المعدن المشعormation الوقود النووي الناتجة لن تكون صالحة. هذا هو واحد من أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية. بالإضافة إلى استخدام دقة منخفضة، العمود استبعاد حجم الغلة على عرض تفصيلي محدود من التعقيد الحقيقي للmetalloproteins في علم الأحياء.

تقنية الموضحة هنا يسمح للتوسع المعرفة من metalloproteome للكائن الحي. تحليل السائبة فقط يعطي مؤشرا الخام من التغييرات لكمية من المعدن ضمن العينة. إلى جانب الاعتبارات العامة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار، وتوفر هذه التقنية أداة التي يمكن استخدامها ل quantitate كمية من المعادن المرتبطة البروتينات وكذلك metalloproteins تحديد تختلف بمقارنة آثار التي تم الحصول عليها. يمكن استخدامها لاستخدام هذه التقنية لتحديد الاختلافات بين الحالات المرضية. وmetalloproteins تحديدها ويمكن بعد مزيد من التحري للمساعدة في تحديد الدور الذي تلعبه في عمليات المرض. تطبيق الواصلة ICP-MS لديه زراعةالمستقبل لتحديد دور الأدوية التي لها متجانسة مثل البلاتين واليود أو النحاس، حيث أن ICP-MS يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تربط المخدرات.

Acknowledgments

ونود أن نعترف بدعم من برنامج حكومة فيكتوريا التشغيلي دعم البنية التحتية، وخطة مشاريع الربط مجلس البحوث الأسترالي (مع اجيلنت تكنولوجيز)، والمركز الاسترالي مجلس البحوث الطبية، البنك الدماغ الفيكتوري، الصحة الوطنية والتعاونية لأبحاث الصحة النفسية وNeuroproteomics منشأة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump Agilent G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler Agilent G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat Agilent G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector Agilent G1314E
Agilent 7700 ICP-MS Agilent G3282A
 Ammonium hydroxide trace metal basis    Sigma 338818
 Ammonium nitrate  Sigma  256064 Make fresh 200mM solution on day of experiment
 Antinomy  Choice analytical  10002-3 
 Ceruloplasmin  Sigma
 Cesium  Choice analytical  100011-1 
 Complete, EDTA free protease inhibitors   Roche 11873580001
 Conalbumin  Sigma C7786
 Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)  Sigma L7647
 Cu, Zn Superoxide dismutase  Sigma S9697
 Ferritin  Sigma F4503
 ICP-MS multielemental calibration standards  AccuStandard Made up to required concentrations in 1% nitric acid
 Microvolume UV spectrophotometer  Thermo Scientific
 65% Nitric acid  Millipore 100441 Diluted to 1% for use
 Peek tubing   Agilent 5042-6461
 Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å  Agilent 5190-2508
 Sodium Chloride  Chem Supply SA046
 Tris Hydrochloride  ICN Biomedicals inc.  103130
 Thyroglobulin  Sigma T9145
 Vitamin B12  Sigma V2876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120, (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. e1610 (2009).
معايير التحليل الكمي Metalloproteomic عن طريق الحجم استبعاد ICP-MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).More

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter