Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
المعادن الأساسية تلعب دورا حيويا في الوظائف البيولوجية الطبيعية، بما في ذلك مسارات رسول الثانوية، مسارات الأيض ووظائف عضية. ويعتقد 30٪ من البروتينات لتكون metalloproteins 1 و 50٪ من جميع الإنزيمات 2. Metalloenzymes استخدام هذه المعادن النزرة مثل العوامل المساعدة على تحفيز التفاعلات الكيميائية، وتحقيق الاستقرار في بنية البروتين، والأدوار التنظيمية مثل رسل الثانوية. بعض العناصر النزرة الأكثر دراسة في ما يخص التنكس العصبي هي النحاس والحديد والزنك 3. ويعتقد أنها تشارك في العديد من مسارات المرض حيث من dyshomeostasis يمكن أن تؤثر بطريقة سلبية. على سبيل المثال وضع معدن الفائق (الاحمق) يؤثر بشكل مباشر على مدى الحياة والنمط الظاهري من نماذج الفئران المعدلة وراثيا من نوع عائلي من مرض التصلب الجانبي الضموري (ALS) (4). في مرض الزهايمر، وقد استخدمت تقنيات metalloproteomics لاكتشاف انخفاض في وضع المعدن من ترانسفيرين في صlasma 5. وتبرز هذه الدراسات يمكن أن metalloproteins الدور الهام الذي تقوم به في المرض.
دراسة metalloproteins مباشرة من الأنسجة البيولوجية هو حقل النامية. على الرغم من أن بعض metalloenzymes اتسمت، فإن الغالبية لا تزال uncharacterized أو غير معروف (6). أحد التحديات الرئيسية في metalloproteins قياس هو شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتين 7. الكلاسيكية من أسفل إلى أعلى تقنيات البروتين تعتمد على هضم البروتينات إلى ببتيدات. يعطل هذه العملية تفاعل غير التساهمية من المعادن والبروتينات الخاصة بهم. وهكذا، واكتسبت أي معلومات عن حالة المعادن من البروتين.
طريقة واحدة للتغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام اللوني حجم الإقصاء يقترن إضافة بالحث البلازما – الشامل 8،9 الطيف (SEC-ICP-MS). وهذا يولد المعلومات حول حجم تقريبي البروتين وكذلك أي المعادن التي ASSOCiated معها 10. وعلاوة على ذلك، حجم الإقصاء هو أسلوب الكروماتوغرافي لطيف التي يمكن أن الحفاظ على الدولة الأم إنزيم أو البروتين البروتين مجمع. ومن مزايا استخدام البلازما إضافة بالحث – الطيف الكتلي (ICP-MS) هو طابع كمي للتكنولوجيا. باستخدام مجموعة من المعايير metalloproteins فمن الممكن لتوفير الكميات المطلقة من metalloproteins من العينات البيولوجية 9،11. ويتحقق ذلك عن طريق توليد منحنى القياسية عن طريق حقن metalloproteins تعرف على مجموعة من تركيزات المعادن.
ويظهر هذا البروتوكول مثال عن كيفية هذا لا يمكن أن يتحقق لمجموعة متنوعة من المعايير metalloprotein. في هذه الورقة ونحن نهدف إلى إنشاء منحنيات القياسية للمعادن التي يتم التحقيق فيها إلى حد كبير في المجالات البيولوجية بما في ذلك الحديد (الحديد) والنحاس (النحاس) والزنك (الزنك) واليود (I)، والكوبالت (المشارك).
ضمان الدولة الأم من البروتين يعني اهتماما خاصا للمخازن المستخدمة وهناك حاجة إلى تخزين العينة. ليس كل تقنيات اللوني أو تقنيات إعداد عينة يمكن استخدامها. من المهم أن المخازن المؤقتة المستخدمة في جميع أنحاء إعداد العينات واللوني خالية من chelators المعدنية ومخازن الاستخدام التي تحاكي درجة الحموضة والملح تركيزات الفسيولوجية. وتشمل الشروط الأخرى لتجنب التدفئة العينة أو إضافة denaturants البروتين (على سبيل المثال، اليوريا). فمن الأهمية بمكان أن تقليل عدد دورات ذوبان التجميد. قدرة المخزن المؤقت اختياره لربط المعادن ثنائي التكافؤ هو أيضا مهم وهو السبب في أن تريس أو الأمونيوم نترات مخازن يتم اختيار اكثر من مخازن الفوسفات.
القرار وذروة انخفاض قدرة اللوني حجم استبعاد نسبة إلى أشكال أخرى من اللوني وجود قيود كبير من هذه التقنية. ومع ذلك، فإن طبيعة لطيفة من حجم الإقصاء chromatograفيز مهم للحفاظ على حالة الأم من البروتين، وبالتالي الحفاظ على الروابط المعدنية البروتين ضعيفة نسبيا. شرط للحفاظ على حالة الأم من البروتينات يتطلب اهتماما خاصا لمعالجة العينات بما في ذلك الحد من عدد دورات ذوبان التجميد، وتجنب chelators معدنية (على سبيل المثال، EDTA) أو أملاح chaotropic والمنظفات.
هذا القرار منخفضة من هذه الآثار التقنية والقدرة على قياس كمية من المعدن يرتبط مع بروتين معين إذا كان في عينة معقدة مثل قمم ينظر سوف تحتوي على بروتين أكثر من واحد. ولذلك، فإن كمية من المعدن مصممة باستخدام ذروة التكامل يكون مؤشرا من المبلغ الإجمالي من المعادن المرتبطة مع كل من البروتينات ويبلغ حجمه في هذه المرحلة من الوقت وليس واحدا فقط بروتين معين. ومن أجل التغلب على هذا القيد البروتين من الفائدة سوف يتعين زيادة تنقيته تحت الظروف المحلية. وسيتيح ذلك لتقدير حجمالمعدن المرتبطة بهذا البروتين ورود أنباء عن بدرجة أعلى من certainity. أن الحد محتمل آخر لهذه التقنية أن فقدان البروتين بسبب عكسها غير ملزم إلى العمود. من أجل تحديد ما إذا كان هذا يحدث تجربة الانتعاش ينبغي الاضطلاع بها حيث يتم تحليل كمية البروتين يبلغ حجمه قبالة العمود لتحديد ما إذا كان هذا يطابق كمية حقن. ونفس الشيء يمكن أن يتم ذلك عن طريق قياس المحتوى المعدني للمواد شطف والمواد بدءا من الجزء الأكبر ICP-MS. انتعاش عمود يمكن أن تختلف تبعا للظروف استخدامها، ولكن ثبت أن الشفاء الكامل من البروتينات من عمود استبعاد حجم ممكن 9. وبالتالي فمن المهم أن تحقق ما إذا كان أو لم يكن هناك أي خسارة تحت ظروف التشغيل المستخدمة.
تعديلات على بروتوكول يمكن أن تكون ذات صلة المعايير metalloprotein التي تستخدم فضلا عن عناصر تحليلها. نوع metalloprotein معيار لناسوف إد تختلف اعتمادا على العناصر التي تهم. لعناصر مثل النحاس، الحديد والبروتينات والزنك، ويعمل الهيئة العامة للسدود والفيريتين. ويمكن أيضا أن أي metalloprotein الأخرى التي لديها stoichometries المعروف أن تستخدم وثبت بضعة أمثلة منها هنا.
واحد المضاعفات الرئيسية التي يمكن أن تنشأ عن استخدام هذا الأسلوب هو تراكم بلورات الملح في شعلة ICP-MS. لمنع تراكم بلورات الملح، ويتم غسلها الشعلة مع الماء المقطر بعد كل 500 – 1000 مل من العازلة التي تم تمريرها من خلال نظام أو عندما يتم تحديد ذلك عن طريق التفتيش البصري أن الشعلة يجب غسلها. مشكلة أخرى التي يمكن أن تنشأ هو تراجع أكثر سرعة في نظافة العينة واستخراج المخاريط. هذه تحتاج إلى تنظيفها بشكل منتظم التالية بروتوكولات الشركة المصنعة.
إعداد العينة الأولي هو الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول. إذا كانت هناك أية تغييرات على بروتين – مجمع المعدن المشعormation الوقود النووي الناتجة لن تكون صالحة. هذا هو واحد من أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية. بالإضافة إلى استخدام دقة منخفضة، العمود استبعاد حجم الغلة على عرض تفصيلي محدود من التعقيد الحقيقي للmetalloproteins في علم الأحياء.
تقنية الموضحة هنا يسمح للتوسع المعرفة من metalloproteome للكائن الحي. تحليل السائبة فقط يعطي مؤشرا الخام من التغييرات لكمية من المعدن ضمن العينة. إلى جانب الاعتبارات العامة التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار، وتوفر هذه التقنية أداة التي يمكن استخدامها ل quantitate كمية من المعادن المرتبطة البروتينات وكذلك metalloproteins تحديد تختلف بمقارنة آثار التي تم الحصول عليها. يمكن استخدامها لاستخدام هذه التقنية لتحديد الاختلافات بين الحالات المرضية. وmetalloproteins تحديدها ويمكن بعد مزيد من التحري للمساعدة في تحديد الدور الذي تلعبه في عمليات المرض. تطبيق الواصلة ICP-MS لديه زراعةالمستقبل لتحديد دور الأدوية التي لها متجانسة مثل البلاتين واليود أو النحاس، حيث أن ICP-MS يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تربط المخدرات.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نعترف بدعم من برنامج حكومة فيكتوريا التشغيلي دعم البنية التحتية، وخطة مشاريع الربط مجلس البحوث الأسترالي (مع اجيلنت تكنولوجيز)، والمركز الاسترالي مجلس البحوث الطبية، البنك الدماغ الفيكتوري، الصحة الوطنية والتعاونية لأبحاث الصحة النفسية وNeuroproteomics منشأة.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |