Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
Essentielle metaller spiller en afgørende rolle i normale biologiske funktioner, herunder sekundære messenger veje, stofskifte veje og organel funktioner. 30% af alle proteiner menes at være metalloproteiner 1 og 50% af alle enzymer 2. Metalloenzymer bruger disse spormetaller som cofaktorer at katalysere kemiske reaktioner, stabilisere proteinstruktur, og for regulatoriske roller som sekundære budbringere. Nogle af de mest undersøgte sporstoffer i forhold til neurodegeneration er kobber, jern og zink 3. De menes at være involveret i mange smitteveje hvor ved dyshomeostasis kan have en negativ effekt. For eksempel metallet status superoxiddismutase (SOD) direkte påvirker levetiden og fænotypen af de transgene musemodeller af familiær type amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 4. I Alzheimers sygdom, er metalloproteomics teknikker blevet anvendt til at opdage et fald i metal status transferrin i pLasma 5. Disse undersøgelser fremhæver den vigtige rolle metalloproteiner kan spille i sygdom.
Studiet af metalloproteiner direkte fra biologiske væv er et felt fremkaldning. Selvom nogle metalloenzymer er blevet karakteriseret, de fleste stadig karakteriseret eller ukendt 6. En af de store udfordringer i måling metalloproteiner er kravet om at opretholde den oprindelige tilstand af proteinet 7. Klassisk bottom-up proteomiske teknikker stole på fordøjelsen af proteinerne til peptider. Denne proces afbryder den ikke-kovalent interaktion med metaller og deres proteiner. Således er ingen oplysninger om metal status af et protein vundet.
En måde at overvinde dette problem er ved hjælp gelpermeationskromatografi parret med induktivt koblet plasma – massespektrometri 8,9 (SEC-ICP-MS). Dette genererer information om proteinets omtrentlige størrelse samt eventuelle metaller, der er Associated med det 10. Endvidere størrelseseksklusion er en blid kromatografisk teknik, der kan bevare den native tilstand af et enzym eller protein-protein-kompleks. En fordel ved anvendelse af induktivt koblet plasma – massespektrometri (ICP-MS) er den kvantitative beskaffenhed af teknologien. Anvendelse af et sæt metalloproteiner standarder er det muligt at tilvejebringe absolut kvantificering af metalloproteiner fra biologiske prøver 9,11. Dette opnås ved at generere en standardkurve ved indsprøjtning kendte metalloproteiner over et område af metalkoncentrationer.
Denne procedure viser et eksempel på hvordan dette kan opnås for en række metalloprotein standarder. I dette papir vil vi skabe standardkurver for metaller, der i vid udstrækning undersøgt i biologiske områder, herunder jern (Fe), kobber (Cu), zink (Zn), iod (I), og cobalt (Co).
Sikring af indfødte tilstand af proteinet betyder særlig vægt på bufferne brugt og er nødvendige oplagring af prøven. Ikke alle kromatografiteknikker eller prøveforberedelse teknikker kan anvendes. Det er vigtigt, at de anvendte buffere hele prøveforberedelse og chromatografi er blottet for metalchelatorer og bruge buffere, som efterligner fysiologiske pH og saltkoncentrationer. Andre forhold for at undgå omfatte opvarmning prøven eller tilsætning af protein denatureringsmidler (f.eks urinstof). Det er afgørende at minimere antallet af fryse tø cyklusser. Evnen af den valgte puffer til at binde divalente metaller er også vigtig og er en grund, Tris eller ammoniumnitrat buffere valgt frem phosphatbaserede puffere.
Den lave opløsning og maksimal kapacitet gelpermeationskromatografi forhold til andre former for kromatografi er en væsentlig begrænsning ved denne teknik. Men den blide karakter størrelsesudelukkelse chromatograPHY er vigtigt at opretholde den native tilstand af proteinet og dermed bevare de relativt svage metal-protein-bindinger. Kravet om at opretholde den native tilstand af proteinerne kræver særlig opmærksomhed på behandlingen af de prøver, herunder begrænsning af antallet af fryse-tø-cykler, undgå metalchelatorer (f.eks EDTA) eller chaotrope salte og detergenter.
Denne lav opløsning ved denne teknik påvirker evnen til at kvantificere mængden af metal er forbundet med et specifikt protein, hvis det er i en kompleks prøve som toppunkterne vil indeholde mere end ét protein. Derfor vil mængden af metal bestemmes ved anvendelse af peak integration være en indikation af den samlede mængde metal forbundet med alle proteinerne eluerede ved dette tidspunkt og ikke kun et specifikt protein. For at overvinde denne begrænsning skulle oprenses yderligere under native betingelser proteinet af interesse. Dette ville give mulighed for kvantificering afmetallet er forbundet med dette protein, der skal rapporteres med en højere grad af certainity. En anden potentiel begrænsning ved denne teknik ville være tab af protein på grund af ikke reversibel binding til søjlen. For at afgøre, om dette sker et opsving eksperiment bør udføres hvorved mængden af protein eluerer fra søjlen analyseres for at bestemme, om dette svarer til beløbet injiceres. Det samme kan gøres ved at måle metalindholdet i elueringen materiale og udgangsmaterialet ved bulk ICP-MS. Genindvindingskolonnen kan variere afhængigt af de anvendte betingelser, men det har vist sig, at fuldstændig genvinding af proteiner fra en størrelse eksklusion søjle er mulig 9. Derfor er det vigtigt at kontrollere, om der er nogen tab under de driftsforhold, der anvendes.
Modifikationer af protokollen kan relateres til de metalloprotein standarder, der anvendes, såvel som de elementer analyseres. Den type metalloprotein standard osed vil variere afhængigt af de elementer, der er af interesse. For elementer såsom Cu, Fe og Zn-proteiner, er SOD og ferritin anvendes. Enhver anden metalloprotein der har kendte stoichometries kan også anvendes og nogle få eksempler er blevet vist her.
En væsentlig komplikation, der kan opstå som følge af anvendelse af denne teknik er opbygningen af saltkrystaller i brænderen af ICP-MS. For at forhindre ophobning af saltkrystaller, er faklen vaskes med destilleret vand efter hver 500 – 1000 ml buffer, som er blevet passeret gennem systemet, eller når det afgøres ved visuel inspektion, at faklen skal vaskes. Et andet problem, der kan opstå, er et hurtigere fald i renligheden af prøven og udvinding kegler. Disse skal rengøres regelmæssigt efter fabrikantens protokoller.
Den oprindelige prøveforberedelse er den mest kritiske trin i protokollen. Hvis der er nogen ændringer i protein – metal kompleks infsninger genereret vil ikke være gyldig. Dette er en af de største begrænsninger af teknikken; Desuden er anvendelsen af den lave opløsning, størrelseseksklusionssøjle giver en begrænset detaljeret afbildning af den sande kompleksitet metalloproteiner i biologi.
Den her beskrevne teknik tillader udvidelse af kendskabet til metalloproteome af en organisme. Bulk analyse giver kun en rå indikation af ændringer i mængden af metal i en prøve. Udover de almindelige hensyn, der skal tages i betragtning, giver denne teknik et værktøj, der kan anvendes til at kvantificere mængden af metal er forbundet med proteiner samt identifikation metalloproteiner der afviger ved sammenligning sporene opnåede. Anvendelsen af denne teknik kan anvendes til at identificere forskelle mellem sygdomstilstande. De identificerede metalloproteiner kan derefter undersøges nærmere for at hjælpe med at bestemme, hvilken rolle de spiller i sygdomsprocesser. Anvendelsen af bindestreg ICP-MS har en voksendefremtiden at fastlægge den rolle, lægemidler, der har et heteroatom, såsom platin, iod eller kobber som ICP-MS kan anvendes til at identificere de proteiner, lægemidlet binder.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende støtte fra victorianske regering Operative Support Infrastructure Program, den australske Forskningsråd Linkage Projects Scheme (med Agilent Technologies), Australian National Sundhed og Medical Research Council, den victorianske hjerne bank, Cooperative Research Centre for Mental Health og Neuroproteomics facilitet.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |