Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

doi: 10.3791/53737 Published: April 13, 2016

Introduction

מתכות חיוניות לשחק תפקיד חיוני פונקציות ביולוגיות נורמליות, כוללים מסלולי שליח משניים, שבילים מטבוליזם ופונקציות אברון. 30% מכלל החלבונים נחשבים מטאלופרוטאין 1 ו -50% מכלל האנזימים 2. מטאלו להשתמש במתכות אלה עקבות כמו קו-פקטורים לזרז תגובות כימיות, לייצב את מבנה החלבון, ועל התפקידים רגולטוריות כגון שליחים משניים. חלק יסודות קורט הנחקרים ביותר לגבי ניווניות של מערכת העצבים הם נחושת, ברזל ואבץ 3. הם חשבו להיות מעורבים מסלולים רבים מחלה שבה ידי dyshomeostasis יכול להשפיע לרעה. לדוגמא מעמד המתכת של סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) משפיעה באופן ישיר על תוחלת החיים ואת הפנוטיפ של מודלים בעכברים טרנסגניים מסוג המשפחתי של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4. במחלת האלצהיימר, טכניקות metalloproteomics שימשו לגלות ירידה במעמד מתכת של transferrin ב plasma 5. מחקרים אלה מדגישים את מטאלופרוטאין התפקיד החשוב יכול לשחק מחלה.

המחקר של מטאלופרוטאין ישירות רקמות ביולוגיות הוא תחום מתפתח. למרות שחלק מטאלו מתאפיינים, הרוב עדיין להישאר uncharacterized או לא ידוע 6. אחד האתגרים הגדולים מטאלופרוטאין מדידה היא הדרישה לשמור על מצב יליד החלבון 7. טכניקות proteomic מלמטה למעלה קלסיים להסתמך על העיכול של החלבונים לתוך פפטידים. תהליך זה משבש את האינטראקציה הלא קוולנטיים של מתכות והחלבונים שלהם. לכן, אין מידע על מצב המתכת של חלבון הוא זכה.

אחת הדרכים להתגבר על בעיה זו היא באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל באמצעות זיווג עם פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - 8,9 ספקטרומטריית מסה (SEC-ICP-MS). זה מייצר מידע אודות בגודל המשוער של החלבון וכן כל מתכות כי הם associated עם זה 10. יתר על כן, הדרת גודל היא טכניקה chromatographic עדינה שיכול לשמר את מדינת יליד תסביך אנזים או חלבון-חלבון. אחד היתרונות של שימוש פלזמה מצמידים אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא טבע כמותי של הטכנולוגיה. באמצעות סט של סטנדרטים מטאלופרוטאין אפשר לספק quantitation המוחלט של מטאלופרוטאין מ דגימות ביולוגיות 9,11. זו מושגת על ידי יצירת עקומת סטנדרט ידי הזרקת מטאלופרוטאין הידוע על פני טווח של ריכוזי מתכות.

פרוטוקול זה מציג דוגמה כיצד ניתן להשיג זאת על פי מגוון מדדים מטאלופרוטאין. במאמר זה אנו שואפים ליצור עקומות סטנדרטיות עבור מתכות כי נחקרות בעיקר בתחומים ביולוגיים כוללים ברזל (Fe), נחושת (Cu), אבץ (Zn), יוד (I), קובלט (Co).

Protocol

1. הכנת מאגרי דוגמאות

  1. הכן 500 מ"ל של חיץ, 200 מ"מ אמוניום חנקתי pH 7.6 - 7.8 (pH מותאם עם אמוניום הידרוקסיד (NH 4 OH)) צסיום (Cs) האנטינומיה (SB) הוסיף לריכוז סופי של 10 ppb. השתמש צסיום ו האנטינומיה כמו סטנדרטים פנימיים כדי לפקח על כל להיסחף בתגובת ICP-MS. חיץ מסנן לפני השימוש דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
  2. כן מדגם בהתאם לסוג של מדגם: נוזל, רקמה או תרבית תאים.
    1. לקבלת דוגמיות הדורשים הומוגניזציה (למשל, רקמה או תאים), להבטיח כי הם לא מכילים חומר ניקוי. השתמש מאגרים טריס להכנת מדגם. לחלופין, להשתמש מאגרים פוספט אבל הם יכולים להשפיע לרעה על metalloproteome לאורך זמן או עם מחזורי הפשרה להקפיא 12.
    2. Homogenize דגימות רקמה או תאים תרבות ידי dounce או sonication ידני 5 דקות באמצעות טריס שנאגרו מלוחים (50 8.0 מ"מ טריס pH, 150 נתרן כלורי מ"מ(NaCl) + חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מעכבי פרוטאז חינם).
    3. להבהיר homogenates על ידי צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 5 דקות. איסוף supernatant שהתקבל. שמור דגימות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל הדגימות יש centrifuged לפני הטעינה לתוך כרומטוגרפיה הנוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) בקבוקונים למנוע מחלקיקי חסימת כרומטוגרפיה הדרת גודל העמודה (SEC).
  3. לנרמל את הסכום הכולל של חלבון נטען על העמודה ברחבי הדגימות. לקבוע ריכוזי חלבון ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר UV נפח מיקרו 13. טען בין חלבון מיקרוגרם 20 ל -150. השתמש כרכי הזרקת טיפוסי הנעים בין 2 - 80 μl תלוי בריכוז המדגם.
    1. נקו את זרוע מדגם של ספקטרופוטומטר UV נפח מיקרו עם מים מזוקקים לפני הטעינה המדגם. זרוע מדגם המקום שבו דגימות החלבון נטענות.
    2. המכשיר בלנק נגד 2 μl של החיץ מדגם דואר. לאחר מכן, עומס 2 μl של כל דגימה על הזרוע ולמדוד את הספיגה ב 280 ננומטר.
    3. קביעת הריכוזים. לקבלת דוגמיות חלבון גולמי, השתמש מקדם הכחדה של 1 Abs = 1 מ"ג / מ"ל. כדי לקבוע את הריכוז של חלבון בדגימות, השתמש חוק בר-למברט, A = ε xlxc, כאשר A הוא ספיגת, ε הוא מקדם הכחדה, L הוא אורך הנתיב בסנטימטרים c הוא ריכוז.

2. ניתוח גורף תקני מטאלופרוטאין שימוש פלזמה מצמידה אינדוקטיבי - ספקטרומטריית מסה

  1. חימום לכוון את המכשיר תוך שימוש בפרוטוקולים של היצרן.
  2. ברגע המכשיר התחמם מכוון, לבצע בתפזורת ICP-MS.
    הערה: פתרונות מניות של מטאלופרוטאין המטוהר בדרך כלל צריכים להיות דלילים לפני המדידה. ריכוז המתכת של התקן ניתן לאמוד מתוך החלבון הידוע: stochiometries מתכת ואת Concentra החלבון המוערךtion. מידע זה יכול לשמש כדי לקבוע את דילול שתהלום ליפול בטווח של עקומת סטנדרט שנוצר.
    1. לדלל סטנדרטים מטאלופרוטאין, thyroglobulin, פריטין, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD וויטמין B 12, כדי להבטיח שהם נמצאים בטווח של 0 - 500 מיקרוגרם / L, באמצעות חומצה 1% חנקתית. כדי להשיג סטנדרטים בטווח זה, אין להשתמש דילולים עולים על 1 ב 20. בצעו דילולים סדרו במים לדלל את המניות לפני זה אם נדרש.
    2. הגדרת סדר הזריקות. ראשית, לנתח שבע רמות הכיול, בריכוזים הנעים בין 0 - 500 מיקרוגרם / L, ואחריו בסטנדרטי מטאלופרוטאין. השבע רמות הכיול הן 0, 1, 5, 10, 50, 100 ו -500 מיקרוגרם / ליטר.
    3. בחר אלמנטים של עניין. הנה, להשתמש Fe, Cu, Zn, Co ואני, כפי שהם האלמנטים שסטנדרטי החלבון מאוגדים. בחר את רכיבי שיטת הרכישה על ידי פתיחת הלשונית הבוררת אלמנט והוספת eleme nts והמוני איזוטופ שלהם כי הם להיות מנותח.
    4. ביצוע ניתוח מדגם עם המכשיר ואת תוכנת הכלי יוצרת באופן אוטומטי את עקומות הכיול עבור כל האלמנטים להיות מנותחות. עקומות הכיול נוצרות על ידי התוכנה על ידי התוויית הספירות / sec של המתכת המזוהית כנגד הסכום של מתכת כי ההתקן נועד להכיל, ב מיקרוגרם / ליטר. השתמש עקומות הכיול כדי לקבוע את הריכוז של מתכת הדגימות הידועות.
      הערה: שימוש עקומת הכיול, התוכנה קובעת את הריכוז של מתכת בכל אחד סטנדרטי מטאלופרוטאין.
    5. מתוצאות הניתוח בתפזורת, ליצור סטנדרטים מטאלופרוטאין הכוללים שלושת יסודות הקורט הנפוצים ביותר ברקמות יונקות באמצעות תערובת של Cu, סופראוקסיד דיסמוטאז Zn (SOD) מדולל ל 200 מיקרוגרם / ליטר של נחושת ואבץ ו פריטין (FTN) בכל סופי ריכוז של 2,000 מיקרוגרם / ליטר של ברזל.
jove_title "> 3. הגדרת מערכת HPLC ו איזון טור כרומטוגרפיה הדרה גודל

הערה: סעיף זה צריך להתבצע במקביל הקודם, שכן שניהם נדרשים כ -1 - 1.5 שעות כדי להשלים.

  1. טהר HPLC משאבות עם חיץ עשה צעד 1.1 ולטהר המשאבות למשך 5 דקות בקצב הזרימה של 5 מ"ל / דקה.
  2. ברגע שהמערכת היא מטוהר, להגדיר את קצב הזרימה ב 0.1 מ"ל / דקה ולחבר את העמודה הדרה גודל (4.6 x 300 מ"מ, 3 מיקרומטר, 150 א).
    הערה: חיבור רטוב בין הצינורות והטור נמנע מכל בועות אוויר להילכד במהלך חיבור של הטור.
  3. חבר את הקצה השני של עמודת גלאי UV להגדיר למדוד ספיגה ב 280 ננומטר באמצעות צינורות צצים.
  4. בהדרגה להגדיל את קצב הזרימה של העמודה במרווחים של 0.05 - 0.1 מ"ל / דקה עד קצב הזרימה הסופי של 0.4 מ"ל / דקה הוא הגיע. אמנם זה מתרחש, בדוק את חיבורי צינורות לעמודה עבור כל הדלפות. לפקח על לחץשל המערכת כדי לוודא שהוא אינו עולה על דרישות הטור ידי התבוננות עקבות לחץ על הכרומתוגרמה בתוכנה.
  5. השאר את העמודה כדי לאזן את קצב הזרימה הנדרשת מעל 5 - 10 כרכי טור. אחרי זה הוא equilibrated, לחבר את המכשירים כדי לאפשר ניתוח מדגם להתרחש.
  6. הגדר את שיטת HPLC עד לשאוב חיץ לאורך טור ב 0.4 מ"ל / דקה במשך 15 דקות.

4. הקמת והפעלת הדרה גודל - מצמידים אינדוקטיבי פלזמה - ספקטרומטריית מסה

הערה: נהלי עבודה עשויים להשתנות בין מכשירים ודגמים. לצור קשר עם המומחה הטכני המכשיר כדי ללמוד עוד על איך להגדיר את בשימוש ICP-MS.

  1. מניחים את ICP - MS למצב המתנה לפני שינוי הגדרת חומרה.
    1. כאשר אתה במצב מתנה, לכבות את התקשורת עבור סמפלר האוטומטי ולשנות את המבוא המדגם "אחר".
      הערה: בהתאם לתוכנה וקשהכלי תצורה ובחירה "HPLC" כמקור מבוא מדגם יכול לשמש. לצור קשר עם המומחה הטכני המכשיר ללמוד אם אפשרות זו זמינה.
  2. השתמש צינורות צצים (מזהה 0.13 מ"מ) כדי לחבר את הזרימה מן גלאי UV ישירות nebulizer על ICP-MS.
  3. כוח לגבות את ICP - MS ולאפשר המכשיר להתחמם במשך 10 - 20 דקות.
  4. לאחר הפלזמה הציתה, חבר את הכבל המרוחק מן ICP - MS לחלק האחורי של autosampler HPLC. האם זו פעם הפלזמה הציתה; אחרת מערכת HPLC תכובה באופן אוטומטי מאז ICP - MS זה לא לעניין.
  5. שינוי שיטת ICP-MS לאסוף נתונים עבור MS-LC-ICP.
    1. לשנות את שיטת הרכישה מתוך ספקטרום לרכישת נחישות זמן (TRA).
    2. בחר את היסודות להיות מנותחים, Fe, Cu, Zn, Co, אני וכן כל מרכיבים אחרים של עניין, ופעמי אינטגרציה להגדיר (בדרך כלל בין 0.05 - 0.3 שניות). לאחר האלמנטים של ענייןמחדש הנבחר, להתאים את זמן הרכישה כדי להתאים את זמן הריצה עבור כרומטוגרפיה (למשל, 900 שניות לריצה כרומטוגרפיה 15 דק ').
    3. באופן ידני לכוון את ICP - MS הליום תא רגיש התנגשות (הוא) ספיקות גז עם למאגר כרומטוגרפיה זורם באמצעות Cs ו Sb כלול במאגר. ספיקות הוא בדרך כלל ~ 1 מ"ל / דקה פחות מאלה ששימשו לניתוח בתפזורת. לאחר ספירת יון המתכת התייצבה וסטיית תקן יחסית (RSD) ערכים הם מתחת ל -5%, המערכת מוכנה לשימוש.
  6. לעשות רשימות מדגם להצגה היא בחלוקת HPLC ותוכנות ICP-MS. המדגם בטווח הרשימה מכילה את הסדר שבו כל אחת מהדגימות הוא להיות מוזרק כמו גם השם שבו הנתונים יישמרו. בדוק כי המספר הכולל של דגימות במשחק הרשימה בין שתי התוכניות.
  7. התחלה יצוות המדגם עבור ICP-MS לפני HPLC, כמו ההזרקה של המדגם על ידי HPLC יפעיל את ICP - MS להתחיל לאסוףנתונים. אם זה לא נעשה בסדר הנכון זה יביא נתונים חסרים.
  8. צור נקודות עקומת כיול על ידי הזרקת כמויות משתנות של SOD ורמת מעורבות FTN מ 200 מיקרוגרם / ליטר ל -6,000 מיקרוגרם / ליטר מוזרק על עמודה עבור Cu & Zn ו -2,000 מיקרוגרם / ליטר עד 60,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Fe. כרכי הזרקה נעים בין 1 ל 30 μl.
    הערה: טווחי ריכוז אלה להקיף את ריכוזי Fe, Cu ו Zn בדרך כלל שנצפו homogenates המורכב. לקבלת דוגמיות המכילים חלבונים מטוהרים רק הטווח המקסימאלי של העקומה צריך להיות בהתאם. ככל שכמות מתכת הקשורים החלבון עשוי לדרוש מגוון קטן או גדול מאז יש זיהום פחות במדגם מגורמים אחרים.
  9. לנתח כל רקמת דגימות הידועות, תרבות הפלזמה או תא.

5. ניתוח נתונים, מניפולציה ויזואליזציה

  1. אחסן את הנתונים ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) פורמט הקובץ ולטעון in כדי תוכנות עיבוד כנדרש.
  2. על מנת לשלוט על נדידת מכשיר, לחלק את הספירה לשנייה עבור כל רכיב על ידי הספירה לשנייה לאף Cs או SB.
  3. צור עקומות כיול עבור כל האלמנטים.
    1. קבע את השטח מתחת לשיא המתכת התואם את מטאלופרוטאין כי הוא חייב לכל אחת הזריקות על ידי ביצוע אינטגרצית שיא תוכנת ניתוח נתונים המועדף.
    2. מגרש את השטח מתחת לשיא מתכת כנגד הסכום הכולל של המתכת שהוזרק על הטור בכל ריצה, 200 - 6,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Cu ו Zn ו -2,000 - 60,000 מיקרוגרם / ליטר עבור Fe. ביצוע ניתוח רגרסיה ליניארית על פי פרוטוקול התוכנה.
    3. השתמש בתוצאות המדרון מניתוח רגרסיה ליניארית כגורם להמיר ספירה לשנייה כדי pg / sec. מחלקים כל של ספירה לכל נקודות נתונים שניות ברחבי הכרומתוגרמה ידי השיפוע של ערך הקו.
  4. שרטט את הנתוניםpg / sec נגד הזמן הכרומתוגרמה. לקבוע את האזור תחת הפסגות של עניין. השטח מתחת לשיא מייצג את הסכום הכולל של מתכת כי החלבון מאוגד, ב pg.
  5. צור כיול לפי המשקל המולקולרי של מטאלופרוטאין הידוע לבין המועד שבו הם elute. השתמש באפשרות זו כדי להעריך את גודל פסגות חלבון בדגימות מורכבות.

Representative Results

השימוש בסטנדרטים מטאלופרוטאין מאפשר כיול של הטור הדרה גודל. איור 1 א מציג את הפרופיל elution עבור thyroglobulin סטנדרטים, פריטין, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD וויטמין B 12 מבוסס על המתכת כי הם קשרו (Fe, Co, Cu, Zn ואני). איור 1B מציג את עקומת הכיול עבור עמודת ההדרה גודל לפי המשקל המולקולרי של סטנדרטי חלבון וזמן elution שלהם, הציגה במתכונת של נפח elution (Ve) מחולקת בנפח החלל של עמודה (וו). החלבונים השתמשו כדי ליצור עקומת סטנדרט זה concanavalin A, conalbumin, ceruloplasmin, פריטין, SOD ו- thyroglobulin.

איור 2 א מראה את elution של פריטין על פני טווח של 2,000 - 60,000 pg של Fe מוזרק על עמודה ואיור 2D היא ניתוח רגרסיה בוצעה באמצעות peak באזור. איורים 2B ו 2C הם פרופילים elution עבור Cu / Zn SOD עבור Cu ו Zn ו 2E ו 2F הם הרגרסיה ניתוחי שנוצר באמצעות אזורים שיא. התוצאות של ניתוח רגרסיה משמשות כדי להמיר את הנתונים הגולמיים בספירה / sec כדי pg / sec כך כמות מתכת קשורה החלבון ניתן לקבוע באופן כמותי. ההמרה נעשית על ידי חלוקת ספירות / sec ידי שיפוע רגרסיה ליניארית (למשל, 334.6 (ספירות / sec x) (שניות / pg) של נחושת).

כאמור, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות מטאלופרוטאין בדגימות ביולוגיות מורכבות. מוח פלזמת אדם שהיה נתון הטכניקה הזו ומספרים 3 ו -4 בהתאמה, להראות את התוצאות שהתקבלו. המוח האנושי המופרד SEC-ICP-MS מוצג ציורי A3-3C, שכל אחד מהם מייצג מתכת שונה של ריבית (Cu, Zn או Fe). דמויות 4A-4C להראות את עקבות המתקבלות כאשר מפלסמה אנושית נתונה הטכניקה הזו. המורכבות והשפע של המדגם ישפיעו על מספר הפסגות, כי הם ראו. כפי הפלזמה צפויה הוא נשלט על ידי כמה מטאלופרוטאין כולל ceruloplasmin ו transferrin.

איור 1
כיול באיור 1. של כרומטוגרפיה הדרה גודל - מצמידים אינדוקטיבי פלזמה - ספקטרומטריית מסה באמצעות ידוע מטאלופרוטאין (א) פרופיל Elution לתקנים מטאלופרוטאין המבוססים על מתכות המיוחסים להם.. (ב) עקומת כיול משקל מולקולרי עבור thyroglobulin סטנדרטים חלבון (i), פריטין (ii), ceruloplasmin (iii), conalbumin (iv), Cu / Zn SOD (v) concanavalin A (vi). "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
השתמש באיור 2. של פריטין ו- Cu / Zn SOD כתקנים מטאלופרוטאין כדי לקבוע את סכום Cu, Fe או Zn הקשורים מטאלופרוטאין בדגימת ביולוגיות מורכבות (א) פרופיל Elution עבור פריטין מעל טווח זריקה 2,000 -. 60,000 מיקרוגרם / ליטר של ברזל. (ב) ו- (ג) פרופיל Elution עבור SOD Cu / Zn פני טווח זריקה של 200 - 6,000 מיקרוגרם / ליטר של נחושת ואבץ, בהתאמה. (ד), (ה) ו- (ו) להראות את התוצאות ניתוח רגרסיה עבור ברזל מתכות, נחושת ואבץ, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3. Cu, Fe ו Zn Metalloproteome של המוח האנושי. (א) זכר נחושת (B) הברזל קורט (C) אבץ עקבות. Elution של סטנדרטי חלבון לכל מתכת מוצג על ידי הזכר השחור עם המשקל המולקולרי שלהם הצביע מתחת לתרשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. Cu, Fe ו Zn Metalloproteome עבור אדם פלזמה. (א) זכר נחושת (B) ברזל קורט (C) אבץ עקבות. Elution של סטנדרטי חלבון לכל מתכת מוצג על ידי הזכר השחור עם המשקל המולקולרי שלהםdicated מתחת לתרשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הבטיח למצב הטבעי של החלבון אומר תשומת לב מיוחדת המאגרים בשימוש ואחסון של המדגם יש צורך. לא כל טכניקות כרומטוגרפיה או טכניקות הכנת מדגם יכולות להיות מועסקות. חשוב כי המאגרים בשימוש בכל רחבי הכנת מדגם כרומטוגרפיה הם נטולים chelators מתכת מאגרי שימוש מחקי ריכוזי pH ו מלח פיסיולוגיים. מצבים אחרים שעדיף להימנע מהם כוללים חימום המדגם או תוספת של denaturants חלבון (למשל, אוריאה). זה קריטי כדי למזער את מספר מחזורי הפשרת הקפאה. היכולת של למאגר נבחר כדי לאגד מתכות divalent כן, חשובה ומהווה סיבה כי מאגרים חנקו טריס או אמוניום נבחרים על מאגרים מבוססים פוספט.

הרזולוציה הנמוכה וקיבולת שיא של קרוב משפחה כרומטוגרפיה הדרה גודל לצורות אחרות של כרומטוגרפיה הוא המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו. עם זאת, האופי העדין של chromatogra הדרת הגודלPHY חשוב לשמור על מדינת יליד החלבון ובכך לשמר את אג"ח מתכת-חלבון החלש יחסית. הדרישה לשמור על מצב יליד החלבונים דורשת תשומת לב מיוחדת לטיפול הדגימות כולל הגבלת מספר מחזורי הפשרת הקפאה, הימנעות chelators מתכת (למשל, EDTA) או מלחים chaotropic ודטרגנטים.

ברזולוציה נמוכה זו של שפעות הטכניקה הזו את היכולת לכמת את כמות מתכת קשורה חלבון מסוים אם הוא נמצא מדגם מורכב כמו הפסגות לראות יכיל יותר חלבון אחד. לפיכך, הסכום של מתכת נקבע באמצעות שילוב השיא יהיה אינדיקציה מהסכום הכולל של מתכת קשורה כל החלבונים משחרר בנקודה זו בזמן ולא רק חלבון אחד ספציפי. על מנת להתגבר על מגבלה זו החלבון של עניין יצטרך להיות מטוהרים נוספים בתנאי ילידים. זה היה מאפשר כימותהמתכת קשורה חלבון זה תדווח עם רמה גבוהה יותר של certainity. מגבלה נוספת פוטנציאל של טכניקה זו תהיה אובדן החלבון עקב אי הפיך מחייבים לעמודה. על מנת לקבוע אם זה קורה ניסוי התאוששות צריכה להתבצע לפיה כמות החלבון משחרר את הטור מנותחת כדי לקבוע אם זו תואמת את הכמות המוזרקת. אותו הדבר ניתן לעשות זאת על ידי מדידת תוכן המתכת של חומר elution ואת החומר המוצא ידי בתפזורת ICP-MS. התאוששות טור יכולה להשתנות בהתאם לתנאי בשימוש, אבל זה הוכח כי התאוששות מלאה של חלבונים מעמודת הדרה גודל אפשרית 9. לכן חשוב לבדוק אם יש או אין כל אובדן בתנאי ההפעלה שבשימוש.

שינויים בפרוטוקול יכולים להיות קשורים בסטנדרטי מטאלופרוטאין המשמשים כמו גם האלמנטים מנותחים. סוג לסטנדרטים מטאלופרוטאין לנוed ישתנו בהתאם האלמנטים שיש בהם עניין. עבור אלמנטים כגון Cu, Fe וחלבונים Zn, SOD ו- פריטין מועסקים. כל מטאלופרוטאין אחר שיש להם ידוע stoichometries יכול לשמש גם וכמה דוגמאות הוכחו כאן.

סיבוך חמור אחד שיכול לנבוע באמצעות טכניקה זו היא הצטברות של גבישי מלח ב הלפיד של ICP-MS. כדי למנוע הצטברות של גבישי מלח, הלפיד הוא נשטף עם מים מזוקקים לאחר כל 500 - 1,000 מ"ל של חיץ כי כבר עבר דרך מערכת או כאשר הוא נקבע על ידי בדיקה ויזואלית כי לפיד יש לשטוף. בעיה נוספת שיכול להתעורר היא ירידה מהירה יותר מניקיון קונוסים המדגם והפקה. אלה יש לנקות באות הפרוטוקולים של היצרן על בסיס קבוע.

הכנת המדגם הראשונית היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. אם יש שינויים כלשהם לחלבון - מתכת מורכבת information שנוצר לא יהיה תקף. זוהי אחת המגבלות העיקריות של הטכניקה; בנוסף לשימוש ברזולוציה הנמוכה, עמודת הדרת הגודל מניב תצוגה מפורטת מוגבלת של המורכבות האמיתית של מטאלופרוטאין בביולוגיה.

הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת הרחבת הידע של metalloproteome של אורגניזם. ניתוח גורף רק נותן אינדיקציה גסה של שינויים בסכום של מתכת בתוך מדגם. מלבד השיקולים הכלליים שצריכים להילקח בחשבון, שיטה זו מספקת כלי שיכול לשמש כדי לכמת את כמות מתכת קשורה חלבונים כמו גם זיהוי מטאלופרוטאין שונה על ידי השוואת העקבות שהתקבלו. השימוש בטכניקה זו יכול להיות מועסק על מנת לזהות הבדלים בין מצבי מחלה. מטאלופרוטאין המזוהה אז יכול להיחקר נוסף כדי לסייע לקבוע את התפקיד שהם ממלאים תהליכי מחלה. היישום של ICP-MS למקף יש גידולבעתיד כדי לקבוע את התפקיד של תרופות שיש להן heteroatom כגון פלטינה, יוד או נחושת כמו ICP-MS יכול לשמש כדי לזהות את החלבונים כי התרופה נקשרה.

Acknowledgments

ברצוננו להודות תמיכת תכנית תמיכת תשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני, בתכנית פרויקטי הצמדת המועצה למחקר האוסטרלית (עם Agilent Technologies), המועצה למחקר רפואית והבריאות הלאומיות של אוסטרליה, בנק המוח ויקטוריאני, מרכז המחקר השיתופי לבריאות נפש ואת Neuroproteomics מִתקָן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump Agilent G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler Agilent G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat Agilent G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector Agilent G1314E
Agilent 7700 ICP-MS Agilent G3282A
 Ammonium hydroxide trace metal basis    Sigma 338818
 Ammonium nitrate  Sigma  256064 Make fresh 200mM solution on day of experiment
 Antinomy  Choice analytical  10002-3 
 Ceruloplasmin  Sigma
 Cesium  Choice analytical  100011-1 
 Complete, EDTA free protease inhibitors   Roche 11873580001
 Conalbumin  Sigma C7786
 Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)  Sigma L7647
 Cu, Zn Superoxide dismutase  Sigma S9697
 Ferritin  Sigma F4503
 ICP-MS multielemental calibration standards  AccuStandard Made up to required concentrations in 1% nitric acid
 Microvolume UV spectrophotometer  Thermo Scientific
 65% Nitric acid  Millipore 100441 Diluted to 1% for use
 Peek tubing   Agilent 5042-6461
 Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å  Agilent 5190-2508
 Sodium Chloride  Chem Supply SA046
 Tris Hydrochloride  ICN Biomedicals inc.  103130
 Thyroglobulin  Sigma T9145
 Vitamin B12  Sigma V2876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120, (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. e1610 (2009).
התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).More

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter