Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
מתכות חיוניות לשחק תפקיד חיוני פונקציות ביולוגיות נורמליות, כוללים מסלולי שליח משניים, שבילים מטבוליזם ופונקציות אברון. 30% מכלל החלבונים נחשבים מטאלופרוטאין 1 ו -50% מכלל האנזימים 2. מטאלו להשתמש במתכות אלה עקבות כמו קו-פקטורים לזרז תגובות כימיות, לייצב את מבנה החלבון, ועל התפקידים רגולטוריות כגון שליחים משניים. חלק יסודות קורט הנחקרים ביותר לגבי ניווניות של מערכת העצבים הם נחושת, ברזל ואבץ 3. הם חשבו להיות מעורבים מסלולים רבים מחלה שבה ידי dyshomeostasis יכול להשפיע לרעה. לדוגמא מעמד המתכת של סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) משפיעה באופן ישיר על תוחלת החיים ואת הפנוטיפ של מודלים בעכברים טרנסגניים מסוג המשפחתי של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 4. במחלת האלצהיימר, טכניקות metalloproteomics שימשו לגלות ירידה במעמד מתכת של transferrin ב plasma 5. מחקרים אלה מדגישים את מטאלופרוטאין התפקיד החשוב יכול לשחק מחלה.
המחקר של מטאלופרוטאין ישירות רקמות ביולוגיות הוא תחום מתפתח. למרות שחלק מטאלו מתאפיינים, הרוב עדיין להישאר uncharacterized או לא ידוע 6. אחד האתגרים הגדולים מטאלופרוטאין מדידה היא הדרישה לשמור על מצב יליד החלבון 7. טכניקות proteomic מלמטה למעלה קלסיים להסתמך על העיכול של החלבונים לתוך פפטידים. תהליך זה משבש את האינטראקציה הלא קוולנטיים של מתכות והחלבונים שלהם. לכן, אין מידע על מצב המתכת של חלבון הוא זכה.
אחת הדרכים להתגבר על בעיה זו היא באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל באמצעות זיווג עם פלזמה מצמידים אינדוקטיבי – 8,9 ספקטרומטריית מסה (SEC-ICP-MS). זה מייצר מידע אודות בגודל המשוער של החלבון וכן כל מתכות כי הם associated עם זה 10. יתר על כן, הדרת גודל היא טכניקה chromatographic עדינה שיכול לשמר את מדינת יליד תסביך אנזים או חלבון-חלבון. אחד היתרונות של שימוש פלזמה מצמידים אינדוקטיבי – ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא טבע כמותי של הטכנולוגיה. באמצעות סט של סטנדרטים מטאלופרוטאין אפשר לספק quantitation המוחלט של מטאלופרוטאין מ דגימות ביולוגיות 9,11. זו מושגת על ידי יצירת עקומת סטנדרט ידי הזרקת מטאלופרוטאין הידוע על פני טווח של ריכוזי מתכות.
פרוטוקול זה מציג דוגמה כיצד ניתן להשיג זאת על פי מגוון מדדים מטאלופרוטאין. במאמר זה אנו שואפים ליצור עקומות סטנדרטיות עבור מתכות כי נחקרות בעיקר בתחומים ביולוגיים כוללים ברזל (Fe), נחושת (Cu), אבץ (Zn), יוד (I), קובלט (Co).
הבטיח למצב הטבעי של החלבון אומר תשומת לב מיוחדת המאגרים בשימוש ואחסון של המדגם יש צורך. לא כל טכניקות כרומטוגרפיה או טכניקות הכנת מדגם יכולות להיות מועסקות. חשוב כי המאגרים בשימוש בכל רחבי הכנת מדגם כרומטוגרפיה הם נטולים chelators מתכת מאגרי שימוש מחקי ריכוזי pH ו מלח פיסיולוגיים. מצבים אחרים שעדיף להימנע מהם כוללים חימום המדגם או תוספת של denaturants חלבון (למשל, אוריאה). זה קריטי כדי למזער את מספר מחזורי הפשרת הקפאה. היכולת של למאגר נבחר כדי לאגד מתכות divalent כן, חשובה ומהווה סיבה כי מאגרים חנקו טריס או אמוניום נבחרים על מאגרים מבוססים פוספט.
הרזולוציה הנמוכה וקיבולת שיא של קרוב משפחה כרומטוגרפיה הדרה גודל לצורות אחרות של כרומטוגרפיה הוא המגבלה העיקרית של הטכניקה הזו. עם זאת, האופי העדין של chromatogra הדרת הגודלPHY חשוב לשמור על מדינת יליד החלבון ובכך לשמר את אג"ח מתכת-חלבון החלש יחסית. הדרישה לשמור על מצב יליד החלבונים דורשת תשומת לב מיוחדת לטיפול הדגימות כולל הגבלת מספר מחזורי הפשרת הקפאה, הימנעות chelators מתכת (למשל, EDTA) או מלחים chaotropic ודטרגנטים.
ברזולוציה נמוכה זו של שפעות הטכניקה הזו את היכולת לכמת את כמות מתכת קשורה חלבון מסוים אם הוא נמצא מדגם מורכב כמו הפסגות לראות יכיל יותר חלבון אחד. לפיכך, הסכום של מתכת נקבע באמצעות שילוב השיא יהיה אינדיקציה מהסכום הכולל של מתכת קשורה כל החלבונים משחרר בנקודה זו בזמן ולא רק חלבון אחד ספציפי. על מנת להתגבר על מגבלה זו החלבון של עניין יצטרך להיות מטוהרים נוספים בתנאי ילידים. זה היה מאפשר כימותהמתכת קשורה חלבון זה תדווח עם רמה גבוהה יותר של certainity. מגבלה נוספת פוטנציאל של טכניקה זו תהיה אובדן החלבון עקב אי הפיך מחייבים לעמודה. על מנת לקבוע אם זה קורה ניסוי התאוששות צריכה להתבצע לפיה כמות החלבון משחרר את הטור מנותחת כדי לקבוע אם זו תואמת את הכמות המוזרקת. אותו הדבר ניתן לעשות זאת על ידי מדידת תוכן המתכת של חומר elution ואת החומר המוצא ידי בתפזורת ICP-MS. התאוששות טור יכולה להשתנות בהתאם לתנאי בשימוש, אבל זה הוכח כי התאוששות מלאה של חלבונים מעמודת הדרה גודל אפשרית 9. לכן חשוב לבדוק אם יש או אין כל אובדן בתנאי ההפעלה שבשימוש.
שינויים בפרוטוקול יכולים להיות קשורים בסטנדרטי מטאלופרוטאין המשמשים כמו גם האלמנטים מנותחים. סוג לסטנדרטים מטאלופרוטאין לנוed ישתנו בהתאם האלמנטים שיש בהם עניין. עבור אלמנטים כגון Cu, Fe וחלבונים Zn, SOD ו- פריטין מועסקים. כל מטאלופרוטאין אחר שיש להם ידוע stoichometries יכול לשמש גם וכמה דוגמאות הוכחו כאן.
סיבוך חמור אחד שיכול לנבוע באמצעות טכניקה זו היא הצטברות של גבישי מלח ב הלפיד של ICP-MS. כדי למנוע הצטברות של גבישי מלח, הלפיד הוא נשטף עם מים מזוקקים לאחר כל 500 – 1,000 מ"ל של חיץ כי כבר עבר דרך מערכת או כאשר הוא נקבע על ידי בדיקה ויזואלית כי לפיד יש לשטוף. בעיה נוספת שיכול להתעורר היא ירידה מהירה יותר מניקיון קונוסים המדגם והפקה. אלה יש לנקות באות הפרוטוקולים של היצרן על בסיס קבוע.
הכנת המדגם הראשונית היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול. אם יש שינויים כלשהם לחלבון – מתכת מורכבת information שנוצר לא יהיה תקף. זוהי אחת המגבלות העיקריות של הטכניקה; בנוסף לשימוש ברזולוציה הנמוכה, עמודת הדרת הגודל מניב תצוגה מפורטת מוגבלת של המורכבות האמיתית של מטאלופרוטאין בביולוגיה.
הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת הרחבת הידע של metalloproteome של אורגניזם. ניתוח גורף רק נותן אינדיקציה גסה של שינויים בסכום של מתכת בתוך מדגם. מלבד השיקולים הכלליים שצריכים להילקח בחשבון, שיטה זו מספקת כלי שיכול לשמש כדי לכמת את כמות מתכת קשורה חלבונים כמו גם זיהוי מטאלופרוטאין שונה על ידי השוואת העקבות שהתקבלו. השימוש בטכניקה זו יכול להיות מועסק על מנת לזהות הבדלים בין מצבי מחלה. מטאלופרוטאין המזוהה אז יכול להיחקר נוסף כדי לסייע לקבוע את התפקיד שהם ממלאים תהליכי מחלה. היישום של ICP-MS למקף יש גידולבעתיד כדי לקבוע את התפקיד של תרופות שיש להן heteroatom כגון פלטינה, יוד או נחושת כמו ICP-MS יכול לשמש כדי לזהות את החלבונים כי התרופה נקשרה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות תמיכת תכנית תמיכת תשתית התפעולית של הממשלה ויקטוריאני, בתכנית פרויקטי הצמדת המועצה למחקר האוסטרלית (עם Agilent Technologies), המועצה למחקר רפואית והבריאות הלאומיות של אוסטרליה, בנק המוח ויקטוריאני, מרכז המחקר השיתופי לבריאות נפש ואת Neuroproteomics מִתקָן.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |