Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma – mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.
Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer’s and Parkinson’s disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma – mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.
metais essenciais desempenham um papel fundamental em funções biológicas normais, incluindo as vias de segundo mensageiro, vias do metabolismo e das funções de organelos. 30% de todas as proteínas são pensados para ser metaloproteínas 1 e 50% de todas as enzimas 2. Metaloenzimas usar esses traços de metais como cofatores para catalisar reações químicas, estabilizar a estrutura da proteína, e para as funções reguladoras, como mensageiros secundários. Alguns dos oligoelementos mais estudadas no que diz respeito a neurodegeneração são de cobre, ferro e zinco 3. Eles são pensados para ser envolvida em muitas vias de doença onde por dyshomeostasis pode ter efeitos adversos. Por exemplo, o estado de metal de superóxido dismutase (SOD) directamente impactos o tempo de vida e do fenótipo dos modelos de ratinhos transgénicos de tipo familiar de esclerose lateral amiotrófica (ALS) 4. Na doença de Alzheimer, metalloproteomics técnicas têm sido utilizadas para descobrir uma diminuição no estado de metal de transferrina em pLasma 5. Estes estudos destacam os importantes metaloproteínas papel pode desempenhar na doença.
O estudo de metaloproteínas directamente a partir de tecidos biológicos é um campo em desenvolvimento. Embora alguns metaloenzimas foram identificados, a maioria ainda permanecem descaracterizados ou desconhecida 6. Um dos grandes desafios na metaloproteínas de medição é o requisito para manter o estado nativo da proteína 7. Classical bottom-up técnicas proteômicas contar com a digestão das proteínas em peptídeos. Este processo interrompe a interacção não-covalente de metais e suas proteínas. Assim, nenhuma informação sobre o estado de metal de uma proteína é obtida.
Uma maneira de superar esse problema é usando cromatografia de exclusão de tamanho emparelhado com plasma indutivamente acoplado – 8,9 espectrometria de massa (SEC-ICP-MS). Isto gera informação sobre o tamanho aproximado da proteína, assim como quaisquer metais que são Associated com ele 10. Além disso, de exclusão por tamanho é uma técnica cromatográfica suave que pode preservar o estado nativo de um complexo enzimático ou proteína-proteína. Uma vantagem do uso de plasma acoplado indutivamente – espectrometria de massa (ICP-MS) é a natureza quantitativa da tecnologia. Utilizando um conjunto de padrões de metaloproteínas é possível fornecer de metaloproteínas quantificação absoluta de amostras biológicas 9,11. Isto é conseguido através da geração de uma curva padrão através da injecção de metaloproteínas conhecidos ao longo de um intervalo de concentrações de metal.
Este protocolo mostra um exemplo de como isto pode ser conseguido por uma variedade de padrões de metaloproteínas. Neste trabalho pretendemos criar curvas padrão para metais que são amplamente investigadas em áreas biológicas, incluindo ferro (Fe), cobre (Cu), zinco (Zn), iodo (I), e cobalto (Co).
Garantir o estado nativo da proteína significa atenção especial aos padrões usados e armazenamento da amostra são necessários. Nem todas as técnicas de cromatograf ia ou técnicas de preparação da amostra podem ser empregues. É importante que os tampões utilizados durante toda a preparação da amostra e são desprovidos de cromatografia de quelantes metálicos e utilização tampões que imitam o pH e concentração de sal fisiológico. Outras condições a evitar incluem aquecimento da amostra ou adição de desnaturantes de proteínas (por exemplo, ureia). É crítico para minimizar o número de ciclos de descongelamento congelamento. A capacidade do tampão escolhido para se ligar metais divalentes é também importante e é um motivo que Tris ou tampões de amónio nitrato são escolhidos entre tampões à base de fosfato.
A resolução e baixa capacidade de pico da cromatograf ia de exclusão por tamanho em relação a outras formas de cromatograf ia é uma grande limitação desta técnica. No entanto, a natureza gentil de exclusão de tamanho chromatograPHY é importante para manter o estado nativo da proteína e, assim, conservar as ligações de metal-proteína relativamente fracas. O requisito para manter o estado nativo de proteínas exige uma especial atenção para o tratamento das amostras, incluindo a limitação do número de ciclos de descongelamento congelamento, evitando quelantes de metais (por exemplo, EDTA) ou os seus sais caotrópicos e detergentes.
Esta baixa resolução desta técnica impactos a capacidade de quantificar a quantidade de metal associada a uma proteína específica se for numa amostra complexa como os picos observados irá conter mais do que uma proteína. Portanto, a quantidade de metal determinada usando o pico de integração seria uma indicação da quantidade total de metal associado com todas as proteínas eluindo neste ponto de tempo e não apenas uma proteína específica. A fim de superar esta limitação a proteína de interesse teria que ser ainda purificado sob condições nativas. Isto permitiria a quantificação deo metal associados com esta proteína a ser comunicados com um grau mais elevado de certezas. Outra limitação potencial desta técnica seria a perda de proteína devido a ligação não reversíveis para a coluna. A fim de determinar se isto está a acontecer uma experiência de recuperação deve ser levada a cabo por meio de que a quantidade de proteína eluindo da coluna é analisado para determinar se esta corresponde à quantidade injectada. O mesmo pode ser feito por medição do teor de metal do material de eluição e do material de partida por grandes quantidades de ICP-MS. Coluna de recuperação pode diferir dependendo das condições usadas, mas demonstrou-se que a recuperação completa de proteínas a partir de uma coluna de exclusão por tamanho é possível 9. Assim, é importante verificar se há ou não qualquer perda nas condições de operação que está sendo usado.
As modificações introduzidas no protocolo pode ser relacionada com as normas metaloproteínas que são utilizados, bem como os elementos analisados. O tipo de padrão metaloproteína nósed irá variar de acordo com os elementos que são de interesse. Para elementos, tais como Cu, Fe e Zn proteínas, SOD e ferritina são empregados. Qualquer outro metaloproteína que têm stoichometries conhecidos também pode ser utilizado e alguns exemplos foram mostrados aqui.
Uma das principais complicações que podem surgir de usar esta técnica é a acumulação de cristais de sal na tocha do ICP-MS. Para evitar a acumulação de cristais de sal, o maçarico é lavada com água destilada a cada 500 – 1000 ml de tampão que foi passado através do sistema, ou quando é determinado por inspecção visual que a tocha seja lavada. Outro problema que pode surgir é um declínio mais rápido na limpeza das amostras e extração cones. Estes precisam ser limpos regularmente seguindo os protocolos do fabricante.
A preparação da amostra inicial é a etapa mais crítica no protocolo. Se houver qualquer alteração na proteína – complexo de metal do informação gerado não será válida. Esta é uma das principais limitações da técnica; Além disso, o uso de baixa resolução, coluna de exclusão de tamanho produz uma vista detalhada limitada da verdadeira complexidade de metaloproteínas em biologia.
A técnica aqui descrita permite a expansão do conhecimento do metalloproteome de um organismo. análise de massa só dá uma indicação bruta de mudanças para a quantidade de metal dentro de uma amostra. Além das considerações gerais que precisam de ser tomadas em consideração, esta técnica fornece uma ferramenta que pode ser usada para quantificar a quantidade de metal associados a proteínas, bem como para identificar metaloproteínas que diferem pela comparação dos traços obtidos. A utilização desta técnica pode ser empregue para identificar diferenças entre os estados de doença. As metaloproteínas identificados, em seguida, pode ser investigado para ajudar a determinar o papel que desempenham nos processos de doença. A aplicação de hífen ICP-MS tem um crescimentofuturo para determinar o papel dos fármacos que possuem um heteroátomo, tal como a platina, o iodo ou o cobre como o ICP-MS pode ser utilizada para identificar as proteínas que se ligam a droga.
The authors have nothing to disclose.
Nós gostaríamos de agradecer o apoio do Programa do Governo de Victoria Apoio Operacional Infra-estrutura, o regime de Projetos Linkage Australian Research Council (com a Agilent Technologies), o Centro Australiano de Investigação Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho, o banco de cérebros vitoriana, Cooperativa para a Saúde Mental eo Neuroproteomics instalação.
Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
Ceruloplasmin | Sigma | ||
Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
Conalbumin | Sigma | C7786 | |
Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
Ferritin | Sigma | F4503 | |
ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6x300mm, 3μm, 150Å | Agilent | 5190-2508 | |
Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
Vitamin B12 | Sigma | V2876 |