RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
말라리아는 매년 개인의 수백만에 영향을 미치는 모기 매개 전염병이다. 세계 보건기구 (WHO)는 2013 년 오년 1 세 미만의 소아에서 발생한 78 퍼센트의 어느 인해 말라리아 약 584,000 죽음이 있었다는 것을보고합니다. 인간의 말라리아의 원인 병원체는 속 변형체 내에서 정단 복합체 충류 기생충과 여성 아노 펠 레스 모기에 의해 자신의 인간의 호스트 사이에 전송된다. 모기가 후속 혈액 식사에 감염되지 않은 개인에 다음 예금 감염 기생충에 감염된 개인으로부터 혈액 식사를한다, 때 변속기가 발생합니다. 속 아노 펠 레스 내 아노 펠 레스 gambiae는 최대의 vectorial 용량 종이며, 사하라 사막 이남의 아프리카 1-3에서 가장 눈에 띄는 말라리아 벡터이다.
현재, 살충제의 배치에 의해 모기 벡터 제어는 b에 계속인간 말라리아의 부담을 경감하기 위해 사용될 주요 방법으로 전자. 1960 년대 이후 살충제의 사용은 매우 성공적인 것으로 입증되었지만, 살충제 저항 상승은 신규 살충제 및 다른 벡터 제어 전략 4-7의 개발에 대한 필요성을 주도하고있다. 2010 년, WHO에보고 49 (63) 국가의 총 말라리아 벡터 1 살충제 저항성의 발생을 지적했다. 또한, Afrotropical 지역에서 저항 데이터를 평가하는 피어 리뷰 문학을 활용 IR 매퍼 도구는 2001 년과 2012 년 사이에 각각 7 피레스 로이드와 dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT)에 대한 내성 46 %와 27 % 증가, 거기보고합니다.
RNA 간섭 (RNAi의)는 페튜니아 식물 8,9 및 곰팡이 뉴로 crassa의 9,10- 유전자를 불 활성화하기 위해 사용될 수있는 기술로서 1990에서 확인되었다. 잠시 후,1998 년 RNAi를 먼저 주입 또는 공급 방법 9,11 통해 안티센스 또는 이중 가닥 RNA (dsRNA에)의 도입에 의해 동물 모델에서 유전자 발현을 감소시키는 수단으로서, 예쁜 꼬마 선충에 설명 하였다. 그 발견 이후, RNAi의 연구자들은 빠른 속도로 매우 선택적 전사 후 유전자 침묵 메커니즘을 통해 관심의 유전자의 기능적 역할을 조사하기 위해 역 유전학을 이용 할 수 있도록하여 기능 유전체학의 추구를 혁명을 일으켰다. 노랑 초파리와 같은 일부 생물에서, 간섭 RNA 구조를 표현하는 유전자 변형 생물체의 사용은 유전자 녹다운 (KD) 널리 성공했다. 에서 유전자의 사용 있지만. RNAi에 대한 gambiae이 이용되고있다 대규모 스크린을위한 유용 할 수있다, 유전자 변형 모기 균주의 발생은 노동 및 시간 집약적, 일반적으로 generati 관심의 유전자의 식별에서 이동 2-3 개월 복용 둘 다적절한 형질 전환 재고 (12)에. 현재 유전자 KD의 기본 방법. gambiae는 dsRNA에의, 성인 단계에서, 체액에 주입하여 특정 유전자 12, 13에 대한 구체적인이다. 이 과정은 일반적으로 훨씬 더 빠른 형질 전환 방법 (12)보다 증명, 유전자 KD의 평가에 관심있는 유전자의 식별에서 이동 약 1 개월 소요됩니다. 애벌레 단계의 RNAi하는 방법은 최근에 설립되었다. 14-17 먹이 나노 입자를 통해 또는 구두 전달로 gambiae Aedes aegypti 및 미세 조류 기반의 dsRNA를 개발의 초기 단계에서 기능 유전체학 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공하고, 18 분자. 직접 분사, 공급, 및 나노 입자 전달 방법에서, dsRNA를은 "짧은 RNA를 간섭"21 ~ 25 염기 길이 (siRNA를) (19, 20)에 효소 Dicer에 의해 표적 세포에 의해 자율적으로 흡수하고 분해된다. 이러한 siRNA를 다음 있습니다 incorpor로 ated RNA 유도 복합체 (RISC)를 침묵, 한 가닥은 RNA 바인딩 RISC 복합체에 결합 대상의 mRNA를 절단하여 그 수준을 감소시키고 그것의 번역 (19, 20)를 억제 할 수 있도록, 폐기 될로부터.
기본 모기 생물학의 많은 본질적인 기능은 호스트 환경 설정 (예를 들어, 후각, 맛보기), 짝짓기, 재생 및 면역 포함의 vectorial 용량을 조절한다. 이러한 생물학적 과정의 중요성을 감안할 때, 유전 또는 약리학 적 수준에서 자신의 변조 살충제 저항의 우회를 포함하는 벡터 제어를위한 새로운 기회를 제공하고, 벡터 관리에보다 광범위하게 통합 된 접근 방식에 대한 새로운 도구를 제공 할 가능성이 높습니다. 이러한 고유의 생물학적 기능을 기본 유전자의 역할을 평가하는 기능 유전체학의 사용은 새로운 목표의 식별을 가능하게하고 우리가 효과적으로 새로운,보다 효과적인 제어 전략에서을 만드는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것입니다이거 야. 우리의 번데기 단계에서의 RNAi를 개시하기위한 신속한 주입 방법의 개발과 사용에 대해 설명합니다. gambiae. 우리는 RNAi의 트리거의 번데기 주입 빨리 넉다운 유전자가 포스트 출현 성인에서 시작 된 경우 관찰되는 것보다 출현 이후, 즉, 초기 단계의 성인에서 생성 된 표현형의 관찰을 가능하게 관찰. 이 방법은 유전자 번데기 발달 구간에서 시작하여 성숙한 단계 등 번데기 개발 중에 개시 유전자 녹다운이 지속하고 영향을 줄 수 있다는 초기 성인 체액 액세스 유형의 세포,뿐만 아니라 세포 유형으로 연장 넉다운 수 있다는 변태 중에 더 체액 – 접근 이러한 출현 다음 성인 부속에있는 감각 신경 세포와 성인에서보다.
모기에 비 형질 전환의 RNAi를 유도하는 현재의 방법은 성인 hemocoel 12, 13 또는 RNAi의 트리거 코팅 된 나노 입자 14 ~ 17 또는 미세 조류 기반의 dsRNA를 18 분자의 애벌레 먹이로 dsRNA를 직접 주입을 포함한다. 성인 모기 타겟팅, 매우 가치있는 동안, 이전의 개발 기간 동안 작동 유전자의 큰 숫자를 제외 할 수 있습니다. 유충의 공급에 의해 초기화가 최저 번데기 통해 가변 단백질 지속성 전위에 부분적으로 인해 성인 단계에서 일치 표현형을 생성 할 수있다. 따라서,보다 완전 성인 단계에서 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 전 성인 발달 단계 중 기능뿐만 아니라 향상된 능력을 평가하는 수단을 제공한다 번데기 개발시 RNAi의 개시에서 특히 목적으로 추가 도입 방법. dsRNA를 주입 또는 발현 유전자 녹다운의 지속성에 기초하여 유전자 녹다운 방식과 마찬가지로예측 될 수 없다. 따라서, 성적 증명서 또는 단백질 수준은 관심의 개발 기간 동안 관심의 유전자를 평가해야한다. SRPN2 dsRNA를 주입 동물 SRPN2에 대한 5 일 후 분사에서 단백질 수준을 감소의 우리가 계속 관찰하지만, 단백질 회전율 및 반감기 등의 요소는 서로 다른 대상에 대해 다를 수 있습니다. 잘 농축 dsRNA를 사출에 사용되는 것이 아니라 보장하는 것이 중요하고, 아가 로스 겔에 그대로 나타난다. 우리는 최저 결과가 충분하지 않은 경우 실험자 이러한 요인을 재평가 추천 및 dsRNA를 각각의 농도는 특정 유전자의 대상에 대해 경험적으로 테스트 할 필요가있다.
우리의 번데기 단계에서 RNA 간섭을 개시하기위한 방법을 설명한다. gambiae 개발. 이 방법은 직접 초기 번데기의 hemocoel에 dsRNA를 미세 주입을 통해 도입에 의존하여 사출 품질의 평가를 할 수 있습니다염료 표지 된 dsRNA를 사용합니다. 주입 품질을 시각화 할 수있는 능력은 성공적인 최저 보장하는 중요한 향상을 구성하고 성인 단계에 초점을 이전에보고 된 대부분의 dsRNA를 기반 프로토콜에서 고려되지 않은 사출 기반 유전자 녹다운의 양상을 구성한다. 이 개발 기간이 중요한 발달 구간에서 역할을 할 수 유전자의 발현에 번데기를 표적으로하거나, 성인의 초기 단계에서 기능적으로 평가 될 수있다. 또한,이 방법은 변형시 액세스 셀 dsRNA를 세포에 전달하고, RNA 간섭의 확립을 가능하게 할 수 있지만 완전히 형성 성인 모기 덜 접근.
하커 등의 최근 마이크로 어레이 분석. (2012) (560)를 확인했다. 업 규제 또는 배아에서 성인에 이르기까지 서로 다른 발달 단계에서 최소 4 배에서 하향 조정했다 gambiae 성적 증명서. (56)의0 성적 증명서는 식별 (309)의 세트는 번데기 개발 (27) 중에 조절 하였다. 이러한 연구 결과는 번데기 단계에서 발생하는 것과, 유기체가 변태를 겪는 동안 간격을 포함하여 모기의 개발을 통해 차동 유전자 발현에 대한 많은 요구 사항이 있다는 것을 시사한다. 등 많은 곤충 종에서. gambiae, 이러한 개발 (즉, 번데기 cuticular 및 키틴 결합 단백질) 등의 과정에 관여하는 유전자 27-31과 면역 반응 (즉, 수신자 수용체 같은 단백질) 27,32-34 매우 번데기 단계에서 표현된다. 완전히 형성 성인 등장하면, 환경 생리 35 변화에 따라 유전자 발현이 계속된다. 특히, 초기 성인 개발 과정, 발달 유전자 (즉, 성인 cuticular 및 근질 단백질) (36)의 발현 증가뿐만 아니라 다른 주요 유전자가 (즉, </em>, 정자 특정 단백질과 사이토 크롬 P450 대사 효소) 27,36.
이 프로토콜 SRPN2의 개발에 사용하는 포지티브 제어 수단이다. gambiae 세린 프로테아제 억제제 (세르 핀). SRPN2 곤충 melanization 곤충 (21, 22)의 폭 넓은 선천성 면역 반응의 네가티브 조절에 중요한 역할을한다. 의사 – 종양 형성 (21, 22)를 쉽게 광학 현미경을 이용하여 관찰 표현형 성인 모기 결과 SRPN2의 최저. 이 별개의 표현형 쉽게 라이브 곤충 득점 할 수 있음을 감안할 때, 우리는 초기 번데기 단계의 RNAi 주사에 대한 SRPN2을 사용했다. 또한, SRPN2하여 초기 성인에서 번데기 RNAi의 주입 및 기능 평가를위한 좋은 목표를 제공, 모든 발달 단계 (37) 동안 표현된다. 우리는 우리가 개발 한 방법은 유도 유사한 성인 melanotic pseud 할 수 있음을 입증 개발 번데기 기간 동안 수행 dsRNA를 주사의 결과로서 오 – 종양 형성. 이 프로토콜을 개발, 우리는 (즉, 애벌레 – 번데기의 탈피 후 첫 24 시간)이 최적의 성인 출현을 얻기위한 중요한 초기 번데기 개발하는 동안 그 주사를 관찰했다. 불량한 출현 후 분사 획득되는 경우, 우리는 이하 광범위한 표피 경화와 번데기를 구하여 초기 번데기 주입이 달성 보장하기 위해 더 정확하게 유충 스테이징 바랍니다. 또한, 주입시 최적의 출현 비율의 표피 결과에 손상이 증가 배율을 최소화하는 것은 동물의 의도 영역이 천공되어 있는지 확인 할 수 있습니다. 바늘 복부 표피 뚫할지, 염료 표지 된 액체의 풀링 번데기의 외관에 명백 할 것이다 또는 여과지를 포화한다. 매우 개 이상의 표피 구멍이있는 모든 번데기를 폐기하는 것이 좋습니다.
성인 모기 주사의 성능에 많은 실험실의 폭 넓은 경험과 함께 jove_content은 "> 이전에 확인 된 미세 주입 방식은 번데기의 RNAi 실험에 사용하기위한 간단한 프로토콜 수정하여 적용 할 수 있습니다. 전반적으로,이 방법의 목표는 연구자에게 능력을 제공하는 것입니다 유전 분석은 상기 신규 한 벡터 제어 전략의 개발을 지원하는 연구를 가능하게 수행 될 수 역방향 동안 기간을 확대. 흥미롭게도, 이러한 Rhodnius의 prolixus 및 스포 도프 테라 프 루기 페르 다른 종에서 실험, 침묵 효과를 크게하는 경향이 유전자를 밝혀 사전 성인 중 시작 할 때 더 큰 개발의 모든 단계 동안. 38, 39 스테이지, 넉다운 RNAi를 매개 유전자는 신속성과 유전자 침묵의 지속성 및 대상 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 안정성에 대한 고려 될 수 있습니다. 이상적인 RNAi의 대상 유전자 PROTEI를 인코딩 자들을 경향n 또는 RNA 짧은 반감기와 높은 이직률 11,40을 갖는다.유전자의 RNAi 전략은 또한 사전 성인 단계 동안 신속성 및 RNAi의 지속성에 대한 고려 사항을 해결하기 위해 채용 될 수 있지만, 형질 전환 기법은 많은 결점 (모기 교배 곤충을 생성하기위한 예를 들면, 트랜스 제닉 라인의 생성에 필요한 시간, 실험 시간 프레임을 규제 dsRNA를 발현, 및 형질 전환 주식의 유지 보수)와 함께. 대조적으로, 우리의 프로토콜은 번데기 개발 과정 및 유래 및 변형 동안 액세스 할 수 있지만, 성인 덜 액세스 할 수있는 세포 유형에 유전자 최저를 시작하기위한 쉽고 빠른 방법을 제공한다. 염료 표지 된 dsRNA를 현탁액의 사용은 쉽게 주입 성공의 평가와 번데기에서 도입 된 물질이 분산이 가능합니다. 성인 주입 된 동물에 비해 번데기 주입 성인에서 종양 형성의 개시에 대한 우리의 데이타는 초기화와 일치의 iation 번데기 단계에서 최저의 RNAi는 매개. 우리의 G3 모기 라인을 사용하고 insectary 조건에서, 우리는 성인의 포스트 분사가 3~5일에게 포스트 출현을 주입 이르면 10 일 성인 melanotic 의사 종양 형성을 관찰합니다. 초기 번데기 단계의 주입을 수행함으로써, 우리는 초기 오일 주입 후 (즉, 3~4일가 등장 게시)으로 볼 수 melanotic 의사 종양 형성을 관찰합니다. 이러한 데이터는이 방법은 이전에 아래 – 연구 개발 기간 (즉, 번데기 개발) 동안 유전자 최저의 개시를 할 수 있음을 의미한다. 우리의 염료 라벨링 방법은 때문에 모든 애벌레 령충 동안 표피의 반투명 특성으로 새로운 애벌레 주입 프로토콜의 개발에 유용 할 수 있습니다. 본 연구에 사용 된 컨트롤이 최저 표현형을 표시하는 성인 단계로 진행을해야하지만, 미래의 실험을 제공합니다 초기 번데기의 주입 다음 번데기 특정 표현형을 평가하기늦은 번데기 개발 등의 추가 개발 기간에이 방법의 확장에 대한 귀중한 통찰력. 요약하면,이 방법은 RNAi를 매개 유전자 최저의 번데기 개시를위한 가치있는 RNAi의 프로토콜을 제공하고 벡터 곤충 연구 커뮤니티 내에서 사용할 수있는 기능 유전체학 도구를 확장합니다.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |