RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
الملاريا مرض معد يسببه البعوض الذي يؤثر على الملايين من الأفراد سنويا. منظمة الصحة العالمية (WHO) أن في عام 2013 كان هناك حوالي 584،000 حالة وفاة بسبب الملاريا، 78٪ منها وقعت في الأطفال الذين تقل أعمارهم عن خمس سنوات 1. مسببات الأمراض التي تسبب الملاريا البشرية هي طفيليات apicomplexan داخل المتصورة جنس وتنتقل بين المضيفين البشري عن طريق البعوض بعوضة الإناث. يحدث انتقال عندما يأخذ البعوض وجبة الدم من شخص مصاب، ومن ثم الودائع الطفيليات المعدية إلى فرد غير مصاب في وجبة الدم اللاحقة. ضمن جنس الأنوفيليس، بعوض الملاريا هو النوع مع أكبر قدرة اتجاهي وهو ناقل الملاريا الأبرز في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى 1-3.
حاليا، لا تزال مكافحة ناقلات البعوض عن طريق نشر المبيدات الحشرية إلى bالبريد الطريقة الرئيسية المستخدمة للحد من عبء الملاريا البشرية. على الرغم من أن استخدام المبيدات الحشرية منذ 1960s وقد ثبت أن تكون ناجحة للغاية، وأدى صعود مقاومة المبيدات الحشرية حاجة لتطوير المبيدات الحشرية جديدة واستراتيجيات مكافحة ناقلات بديل 4-7. خلال عام 2010، أشار ما مجموعه 49 من 63 بلدا تقارير لمنظمة الصحة العالمية وقوع مقاومة المبيدات الحشرية في نواقل الملاريا 1. بالإضافة إلى ذلك، أداة الأشعة تحت الحمراء مخطط، الذي يستخدم الأدب لاستعراض الأقران لتقييم البيانات المقاومة في المناطق المداري الإفريقي، تقارير أن ما بين 2001 و 2012 كان هناك 46٪ و 27٪ زيادة في مقاومة البيرثرويدات ومادة ال د. (دي دي تي)، على التوالي 7.
تم التعرف تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في 1990s في وقت مبكر كأسلوب التي يمكن أن تستخدم لتعطيل الجينات في مصنع بتونيا 8،9 وفي الفطر العصيباء المبوغة crassa 9،10. بعد ذلك بوقت قصير،في عام 1998، وقد تم توثيق رني لأول مرة في ايليجانس انواع معينة كوسيلة لخفض التعبير الجيني في نموذج حيواني من خلال إدخال العقاقير أو الحمض النووي الريبي مزدوج الجديلة (الرنا المزدوج الجديلة) عن طريق الحقن أو التغذية أساليب 9،11. منذ اكتشافه، قد أحدثت ثورة رني السعي لعلم الجينوم وظيفية من خلال السماح للباحثين الاستفادة من علم الوراثة العكسية للتحقيق بسرعة الأدوار الوظيفية من الجينات ذات الاهتمام عبر آلية إسكات الجينات انتقائية للغاية بعد النسخي. في بعض الكائنات الحية، مثل ذبابة الفاكهة، فإن استخدام الكائنات المعدلة وراثيا التي تعبر عن التدخل التركيبات RNA الناجح على نطاق واسع لإسقاط الموروثة (دينار كويتي). على الرغم من أن استخدام الجينات المحورة في آن. وقد استخدمت الغامبية للرني وقد تكون مفيدة للشاشات واسعة النطاق، وتوليد سلالات البعوض المعدلة وراثيا على حد سواء العمل والوقت مكثفة، مع الأخذ عموما 2-3 أشهر للانتقال من تحديد الجينات التي تهم الجيلعلى من الأسهم المعدلة وراثيا المناسب (12). حاليا، الوسيلة الرئيسية لدينار الجينات في آن. الغامبية هو عن طريق الحقن في الدملمف، خلال مرحلة البلوغ، من الرنا المزدوج الجديلة محدد لجين معين 12،13. هذه العملية تستغرق عادة حوالي شهر واحد للذهاب من تحديد الجينات التي تهم تقييم الجين دينار كويتي، يبرهن على أن تكون أسرع بكثير من الطرق المعدلة وراثيا 12. تم إنشاء طرق اليرقات المرحلة رني مؤخرا في آن. الرنا المزدوج الجديلة المستندة إلى الطحالب الغامبية والزاعجة المصرية عبر جسيمات متناهية الصغر تغذية 14-17 أو عن طريق التسليم عن طريق الفم من الجزيئات 18، مما يتيح فرصا لإجراء تحليل الجيني وظيفية خلال المراحل الأولى من التنمية. في الحقن المباشر، والتغذية، وطرق التسليم جسيمات متناهية الصغر، يؤخذ الرنا المزدوج الجديلة تصل بشكل مستقل من قبل الخلية المستهدفة والمشقوق بواسطة انزيم المقامر إلى 21-25 النوكليوتيدات طويلة "التدخل باختصار الرنا" (الرناوات siRNAs) 19،20. هذه الرناوات siRNAs ثم يتم incorporATED في الحمض النووي الريبي الناجم عن إسكات المعقدة (RISC)، والتي سيتم التخلص منها حبلا واحد، مما يتيح للمجمع RISC محددة RNA لربط ويلتصق مرنا الهدف، وبالتالي تقلل من مستوى، وتحول دون ترجمتها 19،20.
العديد من الميزات الجوهرية لعلم الأحياء البعوض الأساسي تعدل قدرة اتجاهي، بما في ذلك تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الشم، ذوق حاسة)، التزاوج والتناسل والحصانة. ونظرا لأهمية هذه العمليات البيولوجية، فمن المرجح أن تعديل على المستوى الجيني أو الدوائي سوف توفر فرصا جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض، بما في ذلك تزييف مقاومة المبيدات الحشرية، وتوفير أدوات جديدة لنهج متكامل على نطاق أوسع لإدارة ناقلات. فإن استخدام علم الجينوم وظيفية لتقييم دور الجينات الكامنة وراء هذه الميزات البيولوجية الجوهرية يمكن تحديد أهداف جديدة وتقديم رؤى جديدة في كيفية يمكننا خلق فعال الجديدة، الاستراتيجيه مراقبة أكثر فعاليةالمنشأ. وصفنا تطوير واستخدام طريقة الحقن السريع لبدء رني خلال طور العذراء من آن. الغامبية. ونلاحظ أن حقن مرحلة العذراء لالزناد رني يمكن رصد الظواهر الناتجة في البالغين مرحلة مبكرة، أي عاجلا بعد ظهور من شأنه أن يلاحظ إذا بدأت الجينات ضربة قاضية في البالغين بعد ظهور. هذه الأساليب تمكن الجينات ضربة قاضية تبدأ خلال الفترة التنموي العذراء وتمتد إلى مراحل الكبار، بحيث إسقاط الموروثة بدأت خلال تطوير العذراء يمكن أن يستمر ويؤثر على الكبار في وقت مبكر أنواع الخلايا اللمف الدموي يمكن الوصول إليها، وكذلك أنواع الخلايا التي هي أكثر الدملمف الوصول اليها خلال التحول مما كانت عليه في الكبار، مثل الخلايا العصبية الحسية الموجودة في الزوائد الكبار بعد ظهور.
الأساليب الحالية لإحداث غير المعدلة وراثيا رني في البعوض وتشمل الحقن المباشر للالرنا المزدوج الجديلة في hemocoel الكبار 12،13 أو تغذية اليرقات رني النانوية المغلفة الزناد 14-17 أو الرنا المزدوج الجديلة القائم على الطحالب الجزيئات 18. استهداف البعوض الكبار، في حين أن قيمة للغاية، يمكن استبعاد عدد كبير من الجينات التي تعمل خلال فترات النمو السابقة. ضربة قاضية بدأها تغذية اليرقات قد تسفر عن الظواهر غير متناسقة خلال مرحلة البلوغ بسبب، في جزء منه، إلى إمكانية استمرار البروتين المتغير من خلال طور العذراء. لذلك، إدخال وسيلة إضافية التي تهدف على وجه التحديد في البدء رني خلال تطوير العذراء ستوفر وسيلة لتقييم بشكل كامل وظائف الجينات خلال مراحل النمو قبل الكبار، وكذلك القدرات المعززة لتقييم وظيفة الجين خلال مراحل الكبار. كما هو الحال مع نهج الجينات ضربة قاضية على أساس حقن الرنا المزدوج الجديلة أو التعبير، واستمرار الجينات ضربة قاضيةلا يمكن التنبؤ بها. ولذلك، ينبغي تقييم نص أو مستويات البروتين لجين من الفائدة خلال فترات التنموية للاهتمام. على الرغم من أن نلاحظ استمرار انخفاض مستويات البروتين في اليوم 5 بعد حقن للSRPN2 في الحيوانات حقن الرنا المزدوج الجديلة SRPN2، يمكن لعوامل مثل دوران البروتين ونصف حياة تختلف عن أهداف مختلفة. ومن الأهمية بمكان أن تضمن لها، كذلك، أن الرنا المزدوج الجديلة لاستخدامها في حقن يتركز بشكل جيد ويبدو سليما على هلام الاغاروز. ونحن نوصي المجربون إعادة تقييم هذه العوامل إذا كانت النتائج ضربة قاضية ليست كافية، وربما تحتاج إلى اختبار تجريبي لأهداف الجينات المحددة تركيزات كل من الرنا المزدوج الجديلة.
نحن تصف طريقة لبدء التدخل RNA خلال طور العذراء من آن. تطوير الغامبية. ويعتمد هذا الأسلوب على مقدمة عبر Microinjection من الرنا المزدوج الجديلة مباشرة في hemocoel من الشرانق في وقت مبكر، ويسمح لتقييم جودة حقن من قبلاستخدام من المسمى صبغ الرنا المزدوج الجديلة. القدرة على تصور نوعية حقن يشكل تعزيز حاسم لضمان ضربة قاضية ناجحة وتشكل جانبا من جوانب ضربة قاضية الجينات القائم على حقن أنه لم يتم النظر في البروتوكولات القائمة على الرنا المزدوج الجديلة ذكرت معظم سابقا مع التركيز على مرحلة البلوغ. من خلال استهداف خادرة في بداية هذه الفترة التنموية، الجينات التي قد يكون لها دور خلال هذه الفترة تنموي محوري، أو خلال المراحل المبكرة من سن البلوغ يمكن تقييمها وظيفيا. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قد تمكن تسليم الرنا المزدوج الجديلة إلى الخلايا، وإنشاء تدخل الحمض النووي الريبي في الخلايا التي يمكن الوصول إليها خلال التحول، ولكن يصعب الوصول إليها في البعوض البالغ تشكيلها بالكامل.
تحليل ميكروأري مؤخرا هاركر وآخرون (2012) حددت 560 آن. النصوص الغامبية التي تصل التنظيم أو تنظيم أسفل من قبل ما لا يقل عن 4 أضعاف خلال مراحل نمو متميزة، بدءا من الجنين إلى الكبار. من 560 النصوص التي تم تحديدها، مجموعة من 309 والتنظيم صعودا خلال تطوير العذراء 27. وتشير هذه النتائج إلى أن هناك العديد من متطلبات التعبير الجيني الفرق في جميع أنحاء تنمية البعوض، بما في ذلك تلك التي تحدث خلال مرحلة العذراء، فاصل خلالها الكائن الحي يخضع التحول. في العديد من أنواع الحشرات، بما في ذلك. الغامبية، الجينات المسؤولة عن العمليات مثل التنمية (أي جليدية العذراء والبروتينات ملزم كيتين) 27-31 والمناعي استجابة (أي تول البروتينات مثل مستقبلات) 27،32-34 وأعربت غاية أثناء مرحلة العذراء. مرة واحدة ظهرت الكبار تشكيلها بالكامل، وهناك واصل التعبير الجيني في استجابة لالبيئية والفسيولوجية تغيير 35. والجدير بالذكر أن خلال تطوير الكبار في وقت مبكر، أن هناك زيادة في التعبير عن الجينات التنموية (أي جليدية الكبار والبروتينات العضلية) 36، وكذلك الجينات الرئيسية الأخرى (أي </em>، الحيوانات المنوية بروتين معين والسيتوكروم P450 الانزيمات الأيض) 27،36.
السيطرة الإيجابية المستخدمة في تطوير هذا البروتوكول، SRPN2، هو آن. الغامبية مثبط البروتياز سيرين (السربين). يلعب SRPN2 دورا هاما في تنظيم السلبي للالتصبغ الحشرات، مجموعة واسعة الاستجابة المناعية الفطرية في الحشرات 21،22. ضربة قاضية من SRPN2 في البعوض النتائج الكبار في تشكيل شبه ورم 21،22، النمط الظاهري الذي لوحظ بسهولة عن طريق استخدام المجهر الضوئي. وبالنظر إلى أن هذا النمط الظاهري واضح يمكن سجل بسهولة في الحشرات الحية، كنا SRPN2 لحقن مرحلة رني العذراء الأولية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير عن SRPN2 خلال جميع مراحل التطوير 37، وبالتالي توفير هدفا جيدا للمرحلة العذراء حقن رني وتقييم وظيفة في الكبار في وقت مبكر. علينا أن نبرهن على طريقة وضعنا غير قادرة على إحداث الكبار مماثل pseud الميلاني تشكيل س الورم نتيجة لحقن الرنا المزدوج الجديلة المنجزة خلال مرحلة العذراء للتنمية. في تطوير هذا البروتوكول، لاحظنا أن حقن خلال تطوير العذراء في وقت مبكر (أي أول 24 ساعة بعد تساقط اليرقات، العذراء) أمر بالغ الأهمية للحصول على أفضل ظهور الكبار. في حال الفقراء ظهور يتم الحصول بعد الحقن، ونحن نوصي تنظيم اليرقات بدقة أكبر، للحصول على الشرانق مع تصلب بشرة أقل اتساعا، وأؤكد أن يتحقق في وقت مبكر حقن مرحلة العذراء. وعلاوة على ذلك، والتقليل من الأضرار التي لحقت النتائج بشرة في معدلات ظهور الأمثل وزيادة التكبير أثناء الحقن يمكن أن تساعد في ضمان أن يتم ثقب فقط المنطقة المقصودة من هذا الحيوان. إذا كانت الإبرة يجب أن ثقب من خلال لبشرة بطني، وتجميع السائل المسمى صبغ يكون واضحا على السطح الخارجي للخادرة أو سوف تشبع ورقة الترشيح. فإنه ينصح بشدة لتجاهل أي الشرانق التي لديها أكثر من ثقب بشرة.
jove_content "> مع تجارب واسعة من العديد من المختبرات مع أداء حقن البعوض الكبار، والنهج حقن مكروي التي سبق تحديدها يمكن تكييفها مع تعديلات بروتوكول بسيط للاستخدام في التجارب رني العذراء. وعموما، فإن الهدف من هذه الطريقة هو توفير الباحثين القدرة على توسيع الإطار الزمني خلالها عكس لا يمكن أن يؤديها تحاليل وراثية، مما يتيح البحوث التي من شأنها دعم تطوير استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في الأنواع الأخرى، مثل الرادنة prolixus وورق القطن frugiperda، تكشف عن أن الجينات آثار إسكات تميل إلى أن تكون من ذلك بكثير أكبر عندما بدأ أثناء مرحلة ما قبل الكبار مراحل 38،39. وخلال جميع مراحل التنمية، الجينات بوساطة رني ضربة قاضية يخضع لاعتبارات تتعلق سرعة واستمرار إسكات الجينات، واستقرار البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المستهدفة. الهدف رني المثالي جينات تميل إلى أن تكون تلك التي ترميز proteiن أو الحمض النووي الريبي التي لديها قصيرة نصف الحياة ومعدل دوران عال 11،40.بينما الاستراتيجيات رني المعدلة وراثيا يمكن أيضا أن تستخدم لمعالجة اعتبارات تتعلق سرعة واستمرار رني خلال مراحل ما قبل الكبار، وتقنيات المعدلة وراثيا لديها العديد من نقاط الضعف (على سبيل المثال، الوقت اللازم لتوليد خطوط المعدلة وراثيا، التجريبية الأطر الزمنية لالتزاوج البعوض لتوليد الحشرات مع التعبير الرنا المزدوج الجديلة منظم، والحفاظ على مخزونات المعدلة وراثيا). على النقيض من ذلك، لدينا بروتوكول يتيح وسيلة أسهل وأسرع للبدء في إسقاط الموروثة خلال تطوير العذراء وفي أنواع الخلايا التي تنشأ ويمكن الوصول إليها خلال مسخ ولكن أقل الوصول إليها في البالغين. استخدام تعليق الرنا المزدوج الجديلة المسمى صبغ يسمح لتقييم سهلة للنجاح الحقن وتشتت المواد أدخلت داخل الشرانق. لدينا بيانات عن بداية تشكيل الورم في البالغين العذراء حقن، بالمقارنة مع الحيوانات المحقونة مثل البالغين، ويتسق مع الحرف الأولينتقم من ضربة قاضية رني بوساطة أثناء طور العذراء. باستخدام خط G3 البعوض لدينا وتحت ظروف insectary لدينا، فإننا نلاحظ الميلاني تشكيل شبه ورم الكبار في وقت مبكر من 10 أيام بعد الحقن من البالغين حقن 3-5 أيام بعد ظهور. عن طريق أداء أوائل حقن العذراء المرحلة، نلاحظ مرئية تشكيل الميلاني شبه الورم في وقت مبكر من خمسة أيام بعد الحقن (أي 03:57 آخر أيام ظهور). وتعني هذه البيانات أن هذه الطريقة يمكن الشروع في ضربة قاضية الجينات خلال فترة التنموية سابقا تحت درس (أي تنمية العذراء). قد تكون لدينا طريقة صبغ العلامات مفيدة أيضا لوضع بروتوكولات حقن اليرقات الجديدة، نظرا لطبيعة شفافة للبشرة خلال جميع الأعمار اليرقية. في حين أن التحكم المستخدمة في هذه الدراسة تتطلب التقدم إلى مرحلة البلوغ لعرض النمط الظاهري ضربة قاضية، والتجارب المستقبلية لتقييم الظواهر مرحلة معينة العذراء بعد الحقن من الشرانق في وقت مبكر سيوفرمعلومات قيمة فيما يتعلق بتوسيع هذه الطريقة في فترات التنموية إضافية مثل التنمية العذراء في وقت متأخر. وباختصار، فإن هذا الأسلوب بروتوكول رني قيما لمرحلة بدء العذراء من ضربة قاضية الجينات بوساطة رني ويوسع أدوات الجينومية الوظيفية المتاحة للاستخدام ضمن الأوساط البحثية ناقلات الامراض والحشرات.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |