RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Sıtma her yıl bireylerin milyonlarca etkileyen bir sivrisinek yoluyla bulaşan bulaşıcı bir hastalıktır. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 2013 yılında beş yıllık 1 yaşın altındaki çocuklarda meydana gelen yüzde 78 olan sıtma nedeniyle yaklaşık 584.000 ölüm, olduğunu bildiriyor. Insan sıtma neden olan patojenleri cins Plasmodium içinde sporlular parazitlerdir ve dişi Anopheles sivrisinekler tarafından insan bilgisayarlar arasında iletilir. Sivrisinek bir sonraki kan yemek bulaşmamış birey sonra içine mevduat enfektif parazitler bulaşmış bir kişiden bir kan yemek alır ve ne zaman İletim oluşur. Cins Anopheles içinde Anopheles gambiae büyük vektörel kapasiteye sahip türdür ve Sahra-altı Afrika'da 1-3 en önemli sıtma vektörü.
Şu anda, böcek dağıtım ile sivrisinek vektör kontrol b devamİnsan sıtma yükünü azaltmak için kullanılan en önemli yöntem e. 1960'lardan bu yana insektisit kullanımı çok başarılı olduğu kanıtlanmıştır, ancak böcek direnci artış, yeni insektisidler ve alternatif vektör kontrol stratejilerinin 4-7 geliştirilmesi için bir ihtiyaç sürdü. 2010 yılında, Dünya Sağlık Örgütü rapor 49 63 ülkelerinin toplam sıtma vektörleri 1 insektisit direncinin oluşumu göstermiştir. Ayrıca, Afrotropikal bölgelerde direnç verilerini değerlendirmek için hakemli literatür kullanır IR Mapper aracı, 2001 ve 2012 yılları arasında sırasıyla 7 piretroidler ve Diklorodifeniltrikloroetan (DDT) direnç% 46 ve% 27 artış, olduğunu bildiriyor.
RNA enterferans (RNAi) Petunya fabrikasında 8,9 ve mantar Neurospora crassa 9,10 genleri etkisiz hale getirmek istihdam edilebilir bir teknik olarak 1990'ların başında tespit edilmiştir. Kısa bir süre sonra,1998 yılında, RNAi ilk enjeksiyon veya besleme yöntemleri 9,11 ile antisens ya da çift iplikli RNA (dsRNA) katılmasıyla, bir hayvan modelinde, gen ekspresyonunu azaltmak için bir araç olarak Caenorhabditis elegans belgelenmiştir. keşfedilmesinden bu yana, RNAi araştırmacılar hızla oldukça seçici transkripsiyon sonrası gen susturma mekanizması ile ilgi genlerin fonksiyonel rolleri araştırmak için ters genetik kullanmasına izin vererek fonksiyonel genomik peşinde devrim yarattı. Drosophila melanogaster gibi organizmalarda, müdahale edici RNA yapılarını eksprese transgenik organizmaların kullanımı gen demonte (KD) için yaygın olarak başarılı olmuştur. An transgenlerin kullanımı rağmen. RNAi için gambiae kullanılmıştır ve büyük ölçekli ekranlar için yararlı olabilir, transgenik sivrisinek suşlarının nesil emek ve zaman yoğun, genellikle Generati ilgilendiren bir genin tanımlanması gitmek için iki ya da üç ayda bir alıyor hemUygun bir transgenik stokunun 12 üzerinde. Şu anda, An gen KD birincil yöntem. gambiae dsRNA'nın yetişkin aşamasında, hemolimf içine enjeksiyon ile verilen bir genin 12,13 özeldir. Bu işlem genellikle çok daha hızlı transgenik yöntemler 12 daha olduğunu kanıtlamaktadır, gen KD değerlendirilmesine ilgi bir genin tanımlanması gitmek için yaklaşık bir ay sürer. Larva evre RNAi Yöntemleri An son zamanlarda kurulmuştur. 14-17 beslenme nanoparçacık yoluyla veya ağızdan teslimat gambiae ve Aedes aegypti Mikroalglerin tabanlı dsRNA gelişimin erken evrelerinde fonksiyonel genomik analiz gerçekleştirmek için fırsatlar sunan, 18 molekülleri. Direkt enjeksiyon, beslenme ve nanoparçacık dağıtım yöntemleri olarak, dsRNA "kısa RNA'lar müdahale" 21-25 nükleotid uzunluğunda (siRNA) 19,20 içine enzim Dicer hedef hücre tarafından özerk alınır ve ayrılır. Bu siRNA'lar daha sonra incorporiçine ated RNA kaynaklı kompleks (RISC) susturulması, tek iplikli RNA bağlı RISC kompleksi bağlamak ve hedef mRNA tutunmaya ve böylece onun düzeyini azaltmak ve çevirisini 19,20 inhibe izin atılır hangi.
Temel sivrisinek biyoloji birçok içsel özellikleri konak tercihi (örneğin, olfaction, tadına bakma), çiftleşme, üreme ve bağışıklık olmak üzere vektörel kapasitesini modüle. Bu biyolojik süreçlerin önemi göz önüne alındığında, bir genetik ya da farmakolojik düzeyde kendi modülasyon insektisit direnci atlatma dahil olmak üzere vektör kontrolü için yeni fırsatlar sunar ve vektör yönetimine daha geniş entegre yaklaşımlar için yepyeni araçlar sağlayan olasıdır. Bu içsel biyolojik özelliklerini altında yatan genlerin rollerini değerlendirmek için fonksiyonel genomik kullanımı yeni hedeflerin belirlenmesini sağlayacak ve etkili yeni, daha etkin kontrol strateg oluşturabilirsiniz nasıl yeni bakış açıları sağlayacakler. Biz An pupa aşamasında RNAi başlatmak için hızlı bir enjeksiyon yönteminin geliştirilmesini ve kullanımını tanımlamak. gambiae. Biz RNAi tetik pupa aşaması enjeksiyonu er demonte gen sonrası ortaya yetişkinlerde başlatılan olsaydı gözlenen olandan çıkmasından sonra, yani erken evre erişkinlerde bileşke fenotipleri gözlem sağladığını görüyoruz. Bu yöntemler, gen pupa gelişim aralığında başlangıç ve erginleri, örneğin pupa gelişimi sırasında başlatılan gen yok etme sürmesi ve etkileyebilir erken yetişkin hemolimf erişilebilir hücre tipleri, hem de hücre tipleri içine uzanan demonte sağlayan başkalaşım boyunca daha hemolimf-erişilebilir böyle çıkması aşağıdaki yetişkin uzantıları bulunan duyusal nöronlar olarak yetişkin, daha.
Sivrisinekler transgenik olmayan RNAi uyaran için mevcut yöntemler yetişkin hemocoel 12,13 veya RNAi tetik kaplı nanopartiküller 14-17 veya mikroalg tabanlı dsRNA 18 molekülleri larva beslenmesi içine dsRNA direkt enjeksiyon içerir. yetişkin sivrisinek Hedefleme, son derece değerli iken, erken gelişim dönemlerinde işlev genlerin çok sayıda hariç tutabilirsiniz. larvaların başlatılan demonte pupa aşamasında değişkeni proteininin kalıcılık potansiyeli, kısmen, yetişkin safhasında tutarsız fenotipleri verebilir. Bu nedenle, daha tam yetişkin aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için gen öncesi yetişkin gelişim evreleri sırasında fonksiyonları, yanı sıra gelişmiş yeteneklerini değerlendirmek için bir araç sağlayacaktır pupa gelişimi sırasında RNAi başlatarak standartlarını hedefleyen ek bir yöntem tanıtan. dsRNA enjeksiyon veya ifade, demonte genin sebat dayalı gen demonte bir yaklaşım olduğu gibitahmin edilemez. Bu nedenle, transkript veya protein düzeyleri ilgi gelişim dönemlerinde ilgi gen için değerlendirilmelidir. SRPN2 dsRNA enjekte hayvanlarda SRPN2 için gün 5 post-enjeksiyon protein seviyelerini düşürmüştür biz bir devamı gözlemlemek rağmen, bu tür protein ciro ve yarılanma ömrü gibi faktörler farklı hedefler için farklı olabilir. İyi konsantre edilir dsRNA enjeksiyon için kullanılacak olan, hem de, elde etmek için önemlidir ve bir agaroz jeli üzerinde sağlam görünür. Biz demonte sonuçlar yeterli değilse deneyci bu faktörler yeniden değerlendirmek tavsiye ve dsRNA ilgili konsantrasyonları spesifik gen hedefleri için ampirik test edilmesi gerekebilir.
Biz An pupa evresinde RNA girişim başlatılması için bir yöntem açıklanmaktadır. gambiae gelişme. Bu yöntem, doğrudan erken pupa hemocoel içine dsRNA mikroenjeksiyon yoluyla tanıtılması dayanır ve enjeksiyon kalitesinin değerlendirilmesi için izin verirboya etiketli dsRNA'nın kullanımı. Enjeksiyon kalitesini görselleştirmek için yeteneği başarılı demonte sağlamak için kritik donanım oluşturur ve yetişkin sahnede odaklanarak en önce bildirilen dsRNA tabanlı protokoller kabul edilmemiştir enjeksiyon tabanlı gen demonte bir yönünü oluşturmaktadır. Bu gelişim döneminde, bu kritik gelişimsel aralık sırasında bir rol oynayabileceğini genlerin başlangıcında pupa hedefleyerek, ya da yetişkinlik erken aşamalarında fonksiyonel değerlendirilebilir. Ayrıca, bu yöntem metamorfoz sırasında erişilebilir hücrelerde dsRNA hücrelerine teslim ve RNA girişim kurulması mümkün kılabilir, ancak tam oluşmuş yetişkin sivrisinek az erişilebilir.
Harker ve ark tarafından yapılan yeni bir mikrodizi analizi. (2012) bir 560 belirledi. yukarı regüle veya embriyo yetişkin arasında değişen, farklı gelişim evreleri sırasında en az 4 kat aşağı-regüle edildi gambiae transkript. 560 transkript tespit 309 bir dizi pupa gelişme 27 sırasında up-regüle edildi. Bu bulgular pupa aşamasında meydana olanlar, organizma başkalaşım uğrar sırasında bir aralık da dahil olmak üzere sivrisinek gelişimi boyunca farklı gen ifadesi için birçok gereksinimleri vardır düşündürmektedir. An dahil olmak üzere birçok böcek türünün, içinde. gambiae, bu tür gelişme (yani, pupa cuticular ve kitin-bağlayıcı proteinlerin) olarak süreçlerine dahil genler 27-31 ve bağışıklık tepkisi (yani, Toll-benzeri reseptör proteinler) 27,32-34 yüksek pupa evresinde ifade edilir. Bir tam olarak oluşmuş yetişkin ortaya sonra, çevresel ve fizyolojik 35 değişikliklere yanıt olarak gen ifadesini yok devam edilir. Özellikle, yetişkinliğin ilk gelişimi sırasında, bir gelişim genlerin (örneğin, yetişkin kütiküler ve Sarkoplazmik protein) 36, ekspresyonunda artışın yanı sıra diğer önemli genler (yani </em> Sperm spesifik protein ve sitokrom P450 metabolizması enzimleri) 27,36.
Bu protokol, SRPN2 geliştirilmesinde kullanılan pozitif kontrol, bir IS. gambiae, serin proteaz inhibitörü (serpin). SRPN2 böcek melanization, böcek 21,22 bir geniş spektrumlu doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin negatif regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Sözde-tümör oluşumu 21,22 kolayca ışık mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir bir fenotip ile, yetişkin sivrisinekler sonuçlarında SRPN2 demonte. Bu farklı fenotip kolaylıkla canlı böcekler gol olabilir göz önüne alındığında, biz ilk pupa aşaması RNAi enjeksiyonlar için SRPN2 kullanılır. Buna ek olarak, SRPN2 böylece erken yetişkin pupa aşaması RNAi enjeksiyonu ve fonksiyonunun değerlendirilmesi için iyi bir hedef temin edilir, tüm gelişim aşamalarında 37 sırasında ifade edilebilir. Biz geliştirdik yöntem uyaran benzer yetişkin melanotik pseud yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir gelişme pupa aşamasında yapılan dsRNA enjeksiyonu bir sonucu olarak o-tümör oluşumu. Bu protokolü geliştirirken, biz (yani, larva-pupa tüy dökme sonra ilk 24 saat) optimum yetişkin çıkmasını elde etmek için kritik öneme sahiptir erken pupa gelişme sırasında enjeksiyon gözlemledim. kötü çıkması sonrası enjeksiyon elde edilmesi halinde, biz daha az kapsamlı manikür sertleştirme ile pupa elde etmek ve erken pupa aşamalı enjeksiyon elde edilir sağlamak için, daha doğru larva evreleme öneririz. Ayrıca, enjeksiyon sırasında optimum çıkması oranlarındaki manikür sonuçlarına hasar ve artan büyütme minimize hayvanın sadece amaçlanan bölge delinmiş emin yardımcı olabilir. İğne ventral manikür yoluyla delinme olursa, boya etiketli sıvının havuzu pupa dış yüzeyinde belirgin olacak ya da filtre kağıdı doyurmak olacak. Oldukça fazla kütikül patlağı olan herhangi bir pupa atmak için tavsiye edilir.
Yetişkin sivrisinek enjeksiyonları bir performansla laboratuarların geniş deneyimleri ile jove_content ">, daha önce tanımlanmış olan mikroenjeksiyon yaklaşımlar pupa RNAi deneylerinde kullanılmak üzere basit bir protokol modifikasyonlar ile uyarlanabilir. Genel olarak, bu yöntemin amacı, araştırmacılar yeteneği sağlamak için genetik analizler ayrıca yeni vektör kontrol stratejilerinin geliştirilmesini destekleyecek araştırma sağlayarak, yapılabilir ters sırasında zaman çerçevesini genişletmek. İlginçtir, bu tür Rhodnius prolixus ve Spodoptera frugiperda gibi diğer türler, deneyler, susturulması etkileri çok olma eğilimi geni ortaya ön yetişkin sırasında başlatılan zaman büyük gelişme tüm aşamalarında. 38,39 aşamaları, demonte RNAi-aracılı gen hız ve gen susturma kalıcılığı ve hedeflenen genler tarafından kodlanan proteinlerin stabilitesi ile ilgili hususlar geçerlidir. İdeal RNAi hedef genlerin protein, şifreleyenlere olma eğilimindedirn veya RNA kısa bir yarılanma ömrüne ve yüksek devir hızı 11,40 vardır.Transgenik RNAi stratejiler yetişkin öncesi aşamalarında ve hızını RNAi kalıcılığı ile ilgili dikkat edilmesi gereken adres için kullanılabilir olsa da, transjenik teknikler pek çok sakıncaları (sivrisinek çiftleşmelerin böcekleri oluşturmak için örneğin, transjenik çizgileri üretimi için gerekli olan süre, deney zaman çerçeveleri düzenlenmiş dsRNA ifadesi ve transgenik stokların bakım) ile. Buna karşılık, bizim protokol pupa gelişimi sırasında ve köken ve metamorfoz sırasında erişilebilir ancak erişkinlerde daha az erişilebilir hücre tiplerinde gen demonte başlatmak için daha kolay ve hızlı bir yöntem tanıyor. boya etiketli dsRNA süspansiyonlar kullanımı kolay enjeksiyon başarı değerlendirilmesi ve pupa içinde tanıtılan malzemenin dağıtılması için izin verir. yetişkin olarak enjekte edilmiş hayvanların, karşılaştırıldığında pupa enjekte yetişkinlerde tümör oluşumu başlangıcı ile ilgili verilerimiz, init ile tutarlıdırve iation pupa aşamasında demonte RNAi aracılı. Bizim G3 sivrisinek hattı kullanılarak ve insectary koşullar altında, biz yetişkinlerin enjeksiyon sonrası üç ila beş gün sonrası ortaya çıkması enjekte kadar erken 10 gün gibi yetişkin melanotik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Erken pupa evre enjeksiyon yaparak, biz erken beş gün enjeksiyon sonrası (yani, üç dört gün ortaya çıkması sonrası) olarak görünür melatonik sözde tümör oluşumunu gözlemlemek. Bu veriler, bu yöntem daha önce altında çalışılmış gelişim döneminde (yani, pupa gelişme) döneminde gen demonte başlatılmasını sağlayan ima. Bizim boya etiketleme yöntemi nedeniyle de tüm larva instars sırasında manikür saydam doğası gereği, yeni larva enjeksiyon protokollerinin geliştirilmesi için yararlı olabilir. Bu çalışmada kullanılan kontrolü yok etme fenotipi görüntülemek için yetişkin aşamaya ilerlemesini gerektirirken, gelecekteki deneyler sağlayacak erken pupa enjeksiyonundan sonra pupa safha spesifik fenotipleri değerlendirmekBöyle geç pupa gelişme gibi ek gelişim dönemleri içine bu yöntemin genişleme ile ilgili değerli bir fikir. Özet olarak, bu yöntem, RNAi aracılı gen demonte pupa aşaması başlatılması için değerli bir RNAi protokolü sağlar vektör böcek araştırma grupları içinde kullanılmak için uygun fonksiyonel genomik araçları genişler.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |