RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Malaria is een door muggen overgebrachte infectieziekte die vele miljoenen mensen elk jaar treft. De World Health Organization (WHO) meldt dat in 2013 waren er ongeveer 584.000 sterfgevallen als gevolg van malaria, 78 procent die zich in kinderen onder de leeftijd van vijf jaar 1. De ziekteverwekkers die menselijke malaria veroorzaken apicomplexa parasieten van het geslacht Plasmodium en tussen hun menselijke gastheren worden overgedragen door vrouwelijke Anopheles muggen. Transmissie treedt op wanneer de mug neemt een bloedmaaltijd van een persoon die is geïnfecteerd, en dan deposito infectieuze parasieten in een niet-geïnfecteerde individu in een volgende bloedmaaltijd. Binnen het geslacht Anopheles, Anopheles gambiae is de soort met de grootste vectoriële capaciteit en is de meest prominente malaria vector in sub-Sahara Afrika 1-3.
Momenteel, mosquito vector controle door toepassing van insecticiden blijft be de belangrijkste toegepaste methode om de last van de menselijke malaria terug te dringen. Hoewel het gebruik van insecticiden sinds 1960 is gebleken zeer succesvol te zijn, heeft de opkomst van insecticide resistentie behoefte aan ontwikkeling van nieuwe insecticiden en alternatieve vectorcontrole strategieën 4-7 aangedreven. In 2010, in totaal 49 van de 63 landen rapporteren aan de WHO aangegeven het vóórkomen van resistentie tegen insecticiden in malariavectoren 1. Daarnaast is de IR Mapper tool, die peer-reviewed literatuur weerstand data in Afrotropische regio's te beoordelen gebruikt, meldt dat tussen 2001 en 2012 waren er 46% en 27% verhoging van de weerstand tegen pyrethroïden en dichloordifenyltrichloorethaan (DDT), respectievelijk 7.
RNA interferentie (RNAi) werd geïdentificeerd in de vroege jaren 1990 als een techniek die kan worden toegepast om genen in de planten Petunia 8,9 en in de schimmel Neurospora crassa 9,10 inactiveren. Kort daarna,in 1998, werd RNAi eerst gedocumenteerd in Caenorhabditis elegans als middel om genexpressie in een diermodel door het inbrengen van antisense of dubbelstrengs RNA (dsRNA) via injectie of voedingswijze 9,11. Sinds zijn ontdekking, is RNAi het streven naar functional genomics revolutie teweeggebracht doordat onderzoekers reverse genetics gebruiken om de functionele rol van genen van belang snel te onderzoeken via een zeer selectieve post-transcriptionele gene silencing mechanisme. In sommige organismen, zoals Drosophila melanogaster is het gebruik van transgene organismen die interfererende RNA constructen zeer succesvolle voor gentherapie knockdown (KD) geweest. Hoewel het gebruik van transgenen in An. gambiae voor RNAi is gebruikt en kunnen nuttig zijn voor grootschalige schermen tonen, het genereren van transgene muggen stammen is zowel arbeids- en tijdsintensief, algemeen vanuit twee tot drie maanden om van de identificatie van een gen van belang voor de Generatiop een geschikte transgene voorraad 12. Momenteel is de belangrijkste methode van gen KD An. gambiae via injectie in de hemolymfe gedurende het volwassen stadium van dsRNA specifiek voor een bepaald gen 12,13. Dit duurt gewoonlijk ongeveer een maand om van identificatie van een gen van belang voor de beoordeling van gen KD, blijkt veel sneller dan transgene werkwijzen 12 zijn. Methoden voor larvale stadium RNAi zijn onlangs opgericht in An. gambiae en Aedes aegypti via nanodeeltjes voeden 14-17 of door orale toediening van microalgen-gebaseerde dsRNA moleculen 18, het aanbieden van mogelijkheden om functionele genomische analyses uit te voeren tijdens de vroege stadia van ontwikkeling. In de directe injectie, het voeden, en nanodeeltjes levering methoden wordt dsRNA autonoom overgenomen door het doel cel en gesplitst door het enzym Dicer in 21-25 nucleotide-lange "short interfererende RNA" (siRNA's) 19,20. Deze siRNA's worden vervolgens incorporated in de RNA-geïnduceerd silencing complex (RISC), waarvan één streng worden genegeerd, zodat de RNA-gebonden RISC complex binden en splitsen het doel-mRNA en daardoor het niveau te reduceren en remmen de vertaling 19,20.
Veel intrinsieke eigenschappen van elementaire mosquito biologie moduleren vectoriële capaciteit, met inbegrip van gastheer voorkeur (bijvoorbeeld reukzin, gustation), paring, voortplanting en immuniteit. Gezien het belang van deze biologische processen, is het waarschijnlijk dat hun differentiatie op genetische of farmacologische niveau van nieuwe mogelijkheden voor vectorcontrole, waaronder omzeiling van insecticide weerstand bieden, en nieuwe instrumenten voor breder geïntegreerde benaderingen vectormanagement. Het gebruik van functionele genomica om de rol van genen die ten grondslag liggen aan deze intrinsieke biologische functies te beoordelen zal de identificatie van nieuwe doelstellingen mogelijk te maken en bieden nieuwe inzichten in hoe we effectief kunnen nieuwe, efficiëntere controle strategies. We beschrijven de ontwikkeling en het gebruik van een snelle injectie methode voor het initiëren van RNAi in het popstadium van An. gambiae. We constateren dat popstadium injectie van een RNAi trekker maakt observatie van de resulterende fenotypes in een vroeg stadium volwassenen, dat wil zeggen, vroeg na het opkomen dan zou worden waargenomen als gen knockdown bij volwassenen werden gestart na opkomst. Deze methode maakt gen knockdown aanvangt het popstadium ontwikkeling interval en verlenging in volwassen stadia, zodanig dat gen knockdown gang gebracht popstadium ontwikkeling kunnen aanhouden en invloed jongvolwassen hemolymfe toegankelijke celtypen, alsook celtypen die meer hemolymfe-toegankelijk tijdens metamorfose dan bij volwassenen, zoals sensorische neuronen in volwassen aanhangsels na opkomst.
De huidige methoden voor het induceren van niet-transgene RNAi in muggen te betrekken directe injectie van dsRNA in de volwassen hemocoel 12,13 of larven voeden van RNAi-trigger-gecoate nanodeeltjes 14-17 of-microalgen gebaseerde dsRNA moleculen 18. Gericht op de volwassen mug, terwijl grote waarde, kan een groot aantal genen die functioneren in eerdere ontwikkelingsperiodes sluiten. Knockdown geïnitieerd door larven inconsistent fenotypen opleveren tijdens het volwassen stadium ten dele, om het potentieel van variabele eiwit persistentie door het popstadium. Derhalve instelling van een aanvullende methode die specifiek is gericht op het initiëren van RNAi in popstadium ontwikkeling een middel om genfuncties bij pre volwassen ontwikkelingsstadia, alsmede verbeterde capaciteiten vollediger beoordeling van genfunctie beoordelen op volwassen stadia verschaffen. Zoals met gen knockdown aanpak op basis van dsRNA injectie of uitdrukking, het voortbestaan van gen knockdownkan niet worden voorspeld. Daarom moet transcript of eiwit niveaus worden beoordeeld op gen van belang tijdens de ontwikkelings periodes van belang. Hoewel we een voortzetting waar van verlaagde eiwitniveaus op dag 5 na injectie van SRPN2 in SRPN2 dsRNA-geïnjecteerde dieren kunnen factoren zoals eiwitten omzet en halfwaardetijd verschillen voor verschillende doelen. Is het essentieel om te garanderen en die de dsRNA te gebruiken voor injectie goed geconcentreerd en wordt intact op een agarosegel. Wij adviseren onderzoekers herwaarderen deze factoren als knock-down resultaten zijn niet voldoende, en de respectieve concentraties van dsRNA kan nodig zijn om empirisch worden getest voor specifieke gen-targets.
We beschrijven een werkwijze voor de initiatie van RNA interferentie in het popstadium van An. gambiae ontwikkeling. Deze werkwijze berust op de invoering via micro-injectie van dsRNA direct in de hemocoel vroege poppen en maakt de beoordeling van de kwaliteit van de injectiegebruik van kleurstof gemerkte dsRNA. De mogelijkheid om injectie kwaliteit visualiseren vormt een belangrijke verbetering voor een geslaagde knockdown en vormt een aspect van injectie genexpressie knockdown dat niet is overwogen meeste eerder gerapporteerd dsRNA-gebaseerde protocollen gericht op het volwassen stadium. Door zich te richten de pop aan het begin van deze ontwikkelingsperiode, genen die een rol spelen in deze kritieke ontwikkeling interval of tijdens het begin van de volwassenheid kan functioneel worden geëvalueerd. Bovendien kan deze werkwijze dsRNA levering aan cellen en vaststelling van RNA interferentie in cellen die toegankelijk tijdens metamorfose zijn mogelijk, maar minder toegankelijk in volledig gevormde volwassen muskieten.
Een recent microarray analyse door Harker et al. (2012) geïdentificeerd 560 An. gambiae transcripten die werden opgereguleerd of down-gereguleerd door ten minste 4-voudig tijdens verschillende ontwikkelingsstadia, van het embryo tot volwassene. De 560 transcripten geïdentificeerd, een set van 309 werd up-gereguleerd tijdens pupal ontwikkeling 27. Deze bevindingen suggereren dat er veel eisen differentiële genexpressie gedurende mug ontwikkeling, waaronder die welke optreden tijdens het popstadium, een interval waarin het organisme ondergaat metamorfose. In veel insectensoorten, waaronder An. gambiae, genen betrokken bij processen zoals ontwikkeling (dat wil zeggen, pupal cuticulaire en chitine-bindende eiwitten) 27-31 en immuunrespons (dwz Toll receptor-achtige eiwitten) 27,32-34 zijn sterk uitgedrukt tijdens de popstadium. Zodra een volledig gevormd volwassene is ontstaan, wordt voortgezet genexpressie als reactie op milieu- en fysiologische veranderingen 35. Met name tijdens de vroege ontwikkeling van volwassenen, is er een toename in de expressie van genen ontwikkelingsstoornissen (dwz volwassen cuticulaire en sarcoplasmische eiwitten) 36, alsook andere belangrijke genen (dwz </em>, Sperma specifiek eiwit en cytochroom P450 metabolisme enzymen) 27,36.
De positieve controle gebruikt bij de ontwikkeling van dit protocol, SRPN2, is An. gambiae serineproteaseremmer (serpine). SRPN2 speelt een belangrijke rol bij de negatieve regulatie van insecten melanisatie een breed spectrum aangeboren immuunrespons bij insecten 21,22. Knockdown van SRPN2 bij volwassen muggen leidt tot pseudo-tumorvorming 21,22, een fenotype dat gemakkelijk wordt waargenomen door het gebruik van licht microscopie. Gezien het feit dat deze verschillende fenotype eenvoudig kan worden gescoord in levende insecten, gebruikten we SRPN2 voor de initiële popstadium RNAi injecties. Bovendien wordt SRPN2 die tijdens alle ontwikkelingsstadia 37, waardoor een goed doelwit voor popstadium RNAi injectie en evaluatie van de functie in de jonge volwassene. We laten zien dat de methode die wij ontwikkeld hebben is kan induceren vergelijkbare volwassen melanotisch pseud vorming o-tumor ten gevolge van dsRNA injecties uitgevoerd tijdens het popstadium ontwikkelingsstadium. Bij de ontwikkeling van dit protocol, hebben we dat de injectie waargenomen tijdens de vroege pupal ontwikkeling (dat wil zeggen, de eerste 24 uur na de larvale-popstadium molt) is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een optimale volwassen opkomst. In het geval dat de slechte opkomst is verkregen na de injectie, raden we enscenering larven met grotere nauwkeurigheid, om poppen te verkrijgen met minder uitgebreid cuticula verharding en verzeker vroege popstadium injectie wordt bereikt. Bovendien, het minimaliseren van schade aan de cuticula resulteert in een optimale opkomst en de toenemende vergroting tijdens de injectie kan ervoor zorgen dat alleen de beoogde regio van het dier wordt aangeprikt. Als de naald door moet prikken aan de ventrale cuticula, bundeling van kleurstof gemerkte vloeistof zichtbaar aan de buitenzijde van de pop worden of zal filtreerpapier verzadigen. Het is ten zeerste aanbevolen om alle poppen die meer dan één cuticula lekke band hebben weggooien.
jove_content "> Met de uitgebreide ervaring van veel laboratoria over de prestaties van volwassen muskieten injecties, kunnen eerder geïdentificeerde micro-injectie benaderingen worden aangepast met eenvoudig protocol aanpassingen voor gebruik in pupal RNAi experimenten. Kortom, het doel van deze methode is onderzoekers de mogelijkheid bieden uitbreiden van de periode gedurende welke reverse genetische analyses kunnen worden uitgevoerd, hierdoor is verdere onderzoek dat de ontwikkeling van nieuwe vector regelstrategieën ondersteunt. Interessant experimenten in andere soorten, zoals Rhodnius prolixus en Spodoptera frugiperda, blijkt dat gen silencing effecten de neiging om veel te groter wanneer gestart tijdens de pre-volwassen stadia 38,39. bij alle ontwikkelingsstadia, RNAi-gemedieerde gen knockdown afhankelijk is van overwegingen met betrekking tot de snelheid en persistentie van genuitschakeling, en de stabiliteit van eiwitten waarvoor gerichte genen. het ideale doel RNAi genen vaak die een Protei coderen zijnn of RNA dat een korte halfwaardetijd en een hoge omloopsnelheid 11,40 heeft.Terwijl transgene RNAi strategieën eveneens kunnen worden toegepast om overwegingen betreffende snelheid en persistentie van RNAi in pre-volwassen stadia pakken, transgene technieken veel nadelen (bijvoorbeeld tijd nodig voor het genereren van transgene lijnen, experimenteel tijdsbestekken voor muggen paringen insecten genereren met gereguleerde dsRNA meningsuiting, en het onderhoud van transgene aandelen). Daarentegen ons protocol biedt een eenvoudigere en snellere methode voor het initiëren gen knockdown tijdens popstadium ontwikkeling en celtypen die afkomstig zijn toegankelijk tijdens metamorfose maar minder toegankelijk bij volwassenen. Het gebruik van kleurstof gemerkte dsRNA suspensies maakt een eenvoudige evaluatie van injectie succes en verspreiding van geïntroduceerde materiaal in poppen. Onze gegevens betreffende het optreden van tumorvorming in pupal geïnjecteerde volwassenen, vergeleken met dieren geïnjecteerd als volwassenen, is met initiation van RNAi-gemedieerde knockdown tijdens het popstadium. Met behulp van onze G3 mosquito lijn en onder onze insectary voorwaarden, we zien de melanotisch formatie volwassen pseudo-tumor zo vroeg als 10 dagen na de injectie van de volwassenen geïnjecteerd drie tot vijf dagen na opkomst. Door het uitvoeren pupal vroeg stadium injectie, zien we zichtbare melanotische pseudo-tumorvorming al vijf dagen na injectie (dwz 03:57 dagen na opkomst). Deze gegevens impliceren dat deze methode maakt het mogelijk de start van gen knock-down tijdens een eerder onder-bestudeerde ontwikkelingsperiode (dwz pupal ontwikkeling). Onze dye labeling werkwijze kan ook nuttig zijn voor de ontwikkeling van nieuwe larvale injectie protocollen blijken, vanwege de doorschijnende aard van de cuticula gedurende alle larvale stadia. Terwijl de controlegroep in deze studie progressie nodig in volwassen stadium een knockdown fenotype, toekomstige experimenten om popstadium-specifieke fenotype te na injectie van vroege poppen voorzietwaardevol inzicht met betrekking tot de uitbreiding van deze methode in extra ontwikkelings periodes, zoals late pupal ontwikkeling. Kortom, deze methode levert een waardevolle RNAi-protocol voor het popstadium initiatie van RNAi-gemedieerde gen knockdown en breidt de functionele genomische hulpmiddelen beschikbaar voor gebruik binnen de vector insect onderzoeksgemeenschap.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |