RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Le paludisme est une maladie infectieuse transmise par les moustiques qui touche plusieurs millions de personnes chaque année. L'Organisation mondiale de la santé (OMS), en 2013 il y avait environ 584.000 décès dus au paludisme, dont 78 pour cent se sont produits chez les enfants de moins de cinq ans 1. Les agents pathogènes qui causent le paludisme humain sont des parasites apicomplexes du genre Plasmodium et sont transmis entre leurs hôtes humains par les moustiques anophèles femelles. La transmission se produit lorsque le moustique prend un repas de sang d'une personne qui est infectée, puis dépôts de parasites infectieux dans un individu non infecté dans un repas de sang ultérieur. Dans le genre Anopheles, Anopheles gambiae est l'espèce avec la plus grande capacité vectorielle et est vecteur du paludisme le plus important en Afrique sub-saharienne 1-3.
Actuellement, lutte contre les moustiques vecteur par le déploiement d'insecticides continue à be la principale méthode utilisée pour réduire le fardeau du paludisme humain. Bien que l'utilisation d'insecticides depuis les années 1960 a prouvé être un très grand succès, la montée de la résistance aux insecticides a entraîné un besoin pour le développement de nouveaux insecticides et des stratégies de lutte contre les vecteurs de remplacement 4-7. En 2010, un total de 49 de 63 pays qui relèvent de l'OMS a indiqué l'apparition de la résistance aux insecticides chez les vecteurs du paludisme 1. En outre, l'outil IR Mapper, qui utilise la littérature examinée par des pairs pour évaluer les données de résistance dans les régions afrotropicaux, rapporte qu'entre 2001 et 2012 il y avait 46% et 27% d' augmentation de la résistance aux pyréthrinoïdes et dichlorodiphényltrichloroéthane (DDT), respectivement 7.
L' interférence ARN (ARNi) a été identifié au début des années 1990, une technique qui pourrait être utilisée pour inactiver les gènes de la plante Pétunia 8,9 et dans le champignon Neurospora crassa 9,10. Peu de temps après,en 1998, l' ARNi a été documentée dans Caenorhabditis elegans comme un moyen de réduire l' expression des gènes dans un modèle animal par introduction d'ARN antisens ou double brin (ARNdb) par injection d' alimentation ou de méthodes 9,11. Depuis sa découverte, l'ARNi a révolutionné la poursuite de la génomique fonctionnelle en permettant aux chercheurs d'utiliser la génétique inverse pour étudier rapidement les rôles fonctionnels des gènes d'intérêt par l'intermédiaire d'un mécanisme de silençage génique post-transcriptionnelle très sélectif. Dans certains organismes, tels que Drosophila melanogaster, l'utilisation d'organismes transgéniques qui expriment des constructions d'ARN interférents a été largement efficace pour knock – down de gènes (KD). Bien que l'utilisation de transgènes dans An. gambiae pour l' ARNi a été utilisé et peut se révéler utile pour les écrans à grande échelle, la génération de souches de moustiques transgéniques est à la fois la main – d'œuvre et de temps, prenant généralement deux à trois mois pour aller de l'identification d'un gène d'intérêt pour les generatisur d'un stock transgénique approprié 12. Actuellement, la principale méthode de KD de gène dans An. gambiae est par injection dans l'hémolymphe, au cours du stade adulte, de l' ARN double brin spécifique pour un gène donné 12,13. Ce processus prend habituellement environ un mois pour aller de l' identification d'un gène d'intérêt à l' évaluation du KD génique, ce qui prouve à être beaucoup plus rapide que les méthodes transgéniques 12. Méthodes de larves au stade ARNi ont été établis récemment dans An. ARNdb à base de microalgues gambiae et Aedes aegypti via nanoparticule alimentation 14-17 ou par administration orale de molécules 18, offrant des possibilités d'effectuer une analyse génomique fonctionnelle au cours des premières étapes du développement. En injection directe, l' alimentation, et les méthodes de livraison de nanoparticules, ARNdb est repris de manière autonome par la cellule cible et clivé par l'enzyme Dicer en 21-25 nucléotides de long "interférent ARNs" (siRNA) 19,20. Ces siRNA sont alors IncorporATED dans le silence complexe (RISC) induite par l' ARN, à partir de laquelle un brin sera supprimé, ce qui permet le complexe RISC ARN lié à se lier à et cliver l'ARNm cible et ainsi réduire son niveau et inhiber sa traduction 19,20.
De nombreuses caractéristiques intrinsèques de la biologie des moustiques base modulent la capacité vectorielle, y compris la préférence de l' hôte (par exemple, olfaction, gustation), l' accouplement, la reproduction et l' immunité. Étant donné l'importance de ces processus biologiques, il est probable que leur modulation au niveau génétique ou pharmacologique offrira de nouvelles possibilités de lutte contre les vecteurs, y compris le contournement de la résistance aux insecticides, et de fournir de nouveaux outils pour des approches plus largement intégrées à la gestion des vecteurs. L'utilisation de la génomique fonctionnelle pour évaluer les rôles des gènes sous-jacents de ces caractéristiques biologiques intrinsèques permettra d'identifier de nouvelles cibles et de fournir de nouvelles perspectives sur la façon dont nous pouvons effectivement créer une nouvelle stratég de contrôle, plus efficaces. Nous décrivons le développement et l' utilisation d'une méthode d'injection rapide pour initier ARNi pendant la phase de chrysalide d'An. gambiae. On observe que l' injection de stade de chrysalide d'un déclencheur ARNi permet l' observation des phénotypes obtenus chez les adultes à un stade précoce, à savoir, plus tôt après la levée que ce qui serait observé si le gène knockdown ont été lancés chez les adultes en post-levée. Cette méthode permet gène knockdown commençant pendant l'intervalle de développement pupal et se prolongeant dans les stades adultes, tels que knockdown génétique initiée au cours du développement des pupes peut persister et affecter les types de cellules hémolymphe accessible début adultes, ainsi que les types de cellules qui sont plus hémolymphe accessibles pendant la métamorphose que chez l'adulte, comme les neurones sensoriels adultes présents dans phanères après l'émergence.
Les méthodes actuelles pour induire non transgénique ARNi dans les moustiques impliquent l' injection directe d'ARNdb dans le hémocèle adulte 12,13 ou l' alimentation des larves d'ARNi trigger revêtues de nanoparticules 14-17 ou molécules ARNdb à base de microalgues-18. Cibler le moustique adulte, tout en étant extrêmement précieux, peut exclure un grand nombre de gènes qui fonctionnent pendant les périodes de développement antérieures. Knockdown initié par l'alimentation des larves peut donner des phénotypes incohérentes pendant le stade adulte en raison, en partie, au potentiel de la protéine variable de persistance à travers le stade de pupe. Par conséquent, l'introduction d'une méthode supplémentaire qui vise spécifiquement à initier l'ARNi au cours du développement des pupes fournira un moyen d'évaluer plus en détail les fonctions des gènes au cours des stades de développement pré-adultes, ainsi que des capacités améliorées pour évaluer la fonction des gènes au cours des stades adultes. Comme approche gène knockdown basée sur l'injection ou l'expression ARNdb, la persistance d'un gène knockdownne peut pas être prédit. Par conséquent, les niveaux de transcription ou de protéines doivent être évalués pour le gène d'intérêt pendant les périodes de développement d'intérêt. Bien que nous observons une poursuite de la diminution des taux de protéines au jour 5 post-injection pour SRPN2 chez les animaux SRPN2 ARNdb injectés, des facteurs tels que le renouvellement des protéines et la demi-vie peut varier pour différentes cibles. Il est essentiel d'assurer, ainsi, que le ARNdb à utiliser pour l'injection est bien concentré et apparaît intact sur un gel d'agarose. Nous recommandons expérimentateurs réévaluer ces facteurs si les résultats knockdown ne sont pas suffisantes, et peut-être besoin d'être testés de façon empirique pour les cibles de gènes spécifiques des concentrations respectives de ARNdb.
Nous décrivons une méthode pour l'initiation de l' interférence ARN lors de l'étape de pupe d'An. développement gambiae. Cette méthode repose sur l'introduction par micro-injection d'ARN double brin directement dans le hémocèle de chrysalides précoce et permet l'évaluation de la qualité de l'injection par lautiliser du colorant marqué ARNdb. La capacité de visualiser la qualité de l'injection constitue une amélioration essentielle pour assurer knockdown succès et constitue un aspect de knockdown de gènes à base d'injection qui n'a pas été pris en compte dans les protocoles basés sur ARNdb les plus signalés précédemment, mettant l'accent sur le stade adulte. En ciblant la pupe au début de cette période de développement, les gènes qui pourraient jouer un rôle dans cet intervalle critique du développement, ou au cours des premiers stades de la vie adulte peut être évaluée de façon fonctionnelle. En outre, cette méthode peut permettre la livraison ARNdb aux cellules, et l'établissement de l'interférence ARN dans les cellules qui sont accessibles pendant la métamorphose, mais moins accessible chez les moustiques adultes complètement formés.
Une récente analyse des microréseaux par Harker et al. (2012) a identifié 560 An. transcriptions gambiae qui ont été régulés à la hausse ou à la baisse réglementés par au moins 4 fois au cours des stades de développement distincts, allant de l'embryon à l' adulte. Parmi les 560 transcrits identifiés, un ensemble de 309 a été régulée à la hausse au cours du développement des pupes 27. Ces résultats suggèrent qu'il existe de nombreuses exigences pour l'expression différentielle des gènes au cours du développement des moustiques, y compris celles qui se produisent pendant la phase de chrysalide, un intervalle pendant lequel l'organisme subit la métamorphose. Chez de nombreuses espèces d' insectes, y compris un. gambiae, les gènes impliqués dans les processus tels que le développement (ie, la cuticule nymphale et des protéines de liaison à la chitine) 27-31 et la réponse immunitaire ( par exemple, des protéines de type récepteur Toll) 27,32-34 sont fortement exprimés lors de la phase de chrysalide. Une fois qu'un adulte entièrement formé est apparue, on a poursuivi l' expression génique en réponse à des changements environnementaux et physiologiques 35. Notamment, au cours du développement précoce des adultes, il y a une augmentation de l'expression des gènes du développement ( par exemple, la cuticule des adultes et des protéines sarcoplasmiques) 36, ainsi que d' autres gènes clés (c. </em>, La protéine du sperme spécifique et cytochrome P450 enzymes du métabolisme) 27,36.
Le contrôle positif utilisé dans le développement de ce protocole, SRPN2, est un An. inhibiteur de sérine protéase gambiae (serpine). SRPN2 joue un rôle important dans la régulation négative de mélanisation insecte, une réponse immunitaire innée à large spectre chez les insectes 21,22. Knockdown de SRPN2 chez les moustiques adultes des résultats dans la formation de pseudo-tumeur 21,22, un phénotype qui est facilement observable par l' utilisation de la microscopie optique. Étant donné que ce phénotype distinct peut être facilement marqué chez les insectes vivants, nous avons utilisé pour les injections SRPN2 pupes initiales ARNi de scène. En outre, SRPN2 est exprimé à tous les stades de développement 37, fournissant ainsi une bonne cible pour l' injection et l' évaluation de la fonction ARNi stade de pupe au début des adultes. Nous démontrons que la méthode que nous avons développé est capable d'induire des adultes similaires pseud mélanique la formation o-tumorale à la suite d'injections effectuées ARNdb pendant la pupe de développement. Dans l' élaboration de ce protocole, nous avons observé que l' injection au cours du développement des pupes précoce (c. -à- les 24 premières heures après la mue des larves-pupe) est essentielle pour obtenir l' émergence optimale des adultes. Dans le cas où une mauvaise levée est obtenue après l'injection, nous vous recommandons de larves mise en scène avec une plus grande précision, pour obtenir des pupes avec moins vaste durcissement de la cuticule et d'assurer l'injection de stade de pupe précoce est atteint. De plus, en minimisant les dommages aux résultats de la cuticule des taux d'émergence optimaux et en augmentant le grossissement lors de l'injection peut aider à assurer que seule la zone prévue de l'animal est percé. Si l'aiguille doit percer à travers la cuticule ventrale, mise en commun de liquide marqué par un colorant sera évident à l'extérieur de la pupe ou va saturer le papier filtre. Il est fortement recommandé de jeter tout pupes qui ont plus d'une ponction cuticule.
jove_content "> Avec les expériences étendues de nombreux laboratoires avec la performance des injections de moustiques adultes, les approches de microinjection identifiées précédemment peut être adapté avec des modifications de protocole simples pour une utilisation dans des expériences de RNAi pupes. Dans l'ensemble, l'objectif de cette méthode est de fournir aux chercheurs la capacité de étendre la période durant laquelle inverse des analyses génétiques peuvent être réalisées, ce qui permet des recherches plus poussées qui appuiera l'élaboration de stratégies de contrôle des vecteurs nouveaux. Fait intéressant, des expériences dans d' autres espèces, telles que Rhodnius prolixus et Spodoptera frugiperda, révèlent que le gène des effets de silence ont tendance à être beaucoup plus lorsqu'ils sont lancés pendant la pré-adulte stades 38,39. au cours de toutes les étapes de développement, gène ARNi à médiation knockdown est soumise à des considérations relatives à la rapidité et la persistance de silençage génique, et la stabilité des protéines codées par des gènes ciblés. la cible idéale ARNi gènes ont tendance à être ceux qui codent un protein ou d' ARN qui a une demi-vie courte et taux de rotation élevé 11,40.Bien que les stratégies d' ARNi transgéniques peuvent également être utilisés pour répondre à des considérations relatives à la rapidité et à la persistance de l' ARNi au cours des stades pré-adultes, des techniques transgéniques présentent de nombreux inconvénients (par exemple, le temps nécessaire à la génération de lignées transgéniques, des délais expérimentaux pour des accouplements anti – moustiques pour générer des insectes avec l'expression ARNdb réglementé, et le maintien des stocks transgéniques). En revanche, notre protocole offre une méthode plus facile et plus rapide pour lancer knockdown de gènes au cours du développement des pupes et des types de cellules qui proviennent et sont accessibles durant la métamorphose, mais sont moins accessibles chez les adultes. L'utilisation de suspensions ARNdb marqués par un colorant permet d'évaluer facilement le succès de l'injection et la dispersion des matériaux introduits à l'intérieur de chrysalides. Nos données sur l'apparition de la formation de tumeurs chez l'adulte pupes injecté, par rapport aux animaux injectés à l'âge adulte, est compatible avec initiation de knockdown ARNi médiée pendant la phase de chrysalide. En utilisant notre ligne G3 de moustiques et dans nos conditions insectarium, on observe la formation mélanique pseudo-tumeur adulte dès 10 jours après l'injection des adultes injecté trois à cinq jours après la levée. En effectuant l' injection précoce pupe stade, nous observons la formation mélanique pseudo-tumeur visible dès cinq jours après l'injection ( par exemple, trois à quatre jours après la levée). Ces données impliquent que cette méthode permet l' initiation de knockdown de gènes au cours d' une période de développement précédemment sous-étudiés (ie, le développement des pupes). Notre procédé de marquage de colorant peut également se révéler utile pour le développement de nouveaux protocoles d'injection de larves, en raison de la nature translucide de la cuticule pendant tous les stades larvaires. Alors que le contrôle utilisé dans cette étude nécessite la progression vers le stade adulte pour afficher un phénotype knockdown, des expériences futures pour évaluer les phénotypes spécifiques au stade pupes après l'injection de pupes précoce fournirades informations précieuses concernant l'expansion de cette méthode dans les périodes de développement supplémentaires tels que le développement des pupes en retard. En résumé, cette méthode fournit un protocole de RNAi précieux pour l'initiation de stade de pupe de knockdown du gène ARNi médiée et développe les outils génomiques fonctionnels disponibles pour une utilisation au sein de la communauté de recherche insecte vecteur.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |