RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
मलेरिया एक मच्छर जनित संक्रामक रोग हर साल व्यक्तियों के कई लाखों लोगों को प्रभावित करता है। विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) की रिपोर्ट है कि 2013 में मलेरिया के कारण लगभग 584000 लोगों की मृत्यु, 78 प्रतिशत, जिनमें से पांच साल 1 से कम आयु के बच्चों में हुई थी। रोगज़नक़ों कि मानव में मलेरिया का कारण प्लाज्मोडियम जीनस के भीतर apicomplexan परजीवी हैं और महिला एनोफ़ेलीज़ मच्छरों द्वारा उनके मानव मेजबान के बीच प्रेषित कर रहे हैं। ट्रांसमिशन तब होता है जब मच्छर एक रक्त भोजन एक व्यक्ति जो संक्रमित है से जमा संक्रामक परजीवी एक असंक्रमित व्यक्ति में एक बाद रक्त भोजन में ले जाता है, और उसके बाद। जीनस एनोफ़ेलीज़ के भीतर, एनोफ़ेलीज़ gambiae सबसे बड़ी vectorial क्षमता के साथ प्रजाति है और उप-सहारा अफ्रीका 1-3 में सबसे प्रमुख मलेरिया वेक्टर है।
वर्तमान में, कीटनाशकों की तैनाती से मच्छर वेक्टर नियंत्रण ख के लिए जारी हैप्रमुख विधि मानव मलेरिया के बोझ को कम करने के लिए कार्यरत ई। हालांकि 1960 के दशक के बाद से कीटनाशकों का उपयोग अत्यंत सफल साबित हो गया है, कीटनाशक प्रतिरोध का उदय उपन्यास कीटनाशकों और वैकल्पिक वेक्टर नियंत्रण रणनीति 4-7 के विकास के लिए एक की जरूरत को प्रेरित किया है। 2010 के दौरान 63 में से 49 देशों के लिए रिपोर्टिंग की कुल मलेरिया वैक्टर 1 में कीटनाशक प्रतिरोध की घटना का संकेत दिया। इसके अतिरिक्त, आईआर मैपर उपकरण है, जो सहकर्मी की समीक्षा की साहित्य Afrotropical क्षेत्रों में प्रतिरोध डेटा का आकलन करने के लिए इस्तेमाल करता है, रिपोर्ट है कि 2001 और 2012 के बीच वहां pyrethroids और dichlorodiphenyltrichloroethane (डीडीटी) के विरोध में 46% और 27% बढ़ जाती है, क्रमश: 7 थे।
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक तकनीक है कि गहरे नीले रंग संयंत्र 8,9 में और कवक Neurospora घोर 9,10 में जीन को निष्क्रिय करने के लिए नियोजित किया जा सकता है के रूप में 1990 के दशक में पहचान की थी। उसके थोड़ी ही देर बाद,1998 में, आरएनएआई पहले इंजेक्शन या खिलाने के तरीकों के माध्यम से 9,11 antisense या डबल कतरा शाही सेना (dsRNA) के लागू होने से एक पशु मॉडल में जीन की अभिव्यक्ति को कम करने का एक साधन के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस में लिखा गया था। इसकी खोज के बाद से, आरएनएआई शोधकर्ताओं रिवर्स आनुवंशिकी का उपयोग करने के लिए तेजी से एक अत्यधिक चयनात्मक के बाद transcriptional जीन मुंह बंद तंत्र के माध्यम से ब्याज की जीन की कार्यात्मक भूमिका की जांच करने की अनुमति देकर कार्यात्मक जीनोमिक्स का पीछा क्रांति ला दी है। ऐसे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के रूप में कुछ जीवों में ट्रांसजेनिक जीवों कि आरएनए हस्तक्षेप निर्माणों को अभिव्यक्त के उपयोग के जीन पछाड़ना (केडी) के लिए व्यापक रूप से सफल रहा है। हालांकि एक में ट्रांसजीन का उपयोग करें। आरएनएआई के लिए gambiae उपयोग किया गया है और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है, ट्रांसजेनिक मच्छर उपभेदों की पीढ़ी दोनों श्रम और समय गहन, आम तौर पर दो से तीन महीनों लेने के Generati के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान से जाना हैएक उपयुक्त ट्रांसजेनिक शेयर 12 के पर। वर्तमान में एक जीन में केडी की प्राथमिक विधि। gambiae इंजेक्शन द्वारा hemolymph में, वयस्क अवस्था के दौरान, dsRNA के किसी जीन 12,13 के लिए विशिष्ट है। यह प्रक्रिया आम तौर पर जीन केडी का आकलन करने के लिए ब्याज की एक जीन की पहचान से जाने के बारे में एक महीने का समय लगता है, बहुत अधिक ट्रांसजेनिक तरीकों की तुलना में तेजी से 12 साबित हो। लार्वा चरण आरएनएआई के लिए हाल ही में एक तरीके में स्थापित किया गया है। gambiae और nanoparticle 14-17 खिला के माध्यम से या के मौखिक वितरण से एडीज एजिप्टी microalgae आधारित dsRNA 18 अणुओं के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण करने के लिए अवसर की पेशकश की। प्रत्यक्ष इंजेक्शन, भोजन, और nanoparticle प्रसव के तरीके में, dsRNA लक्ष्य सेल द्वारा स्वायत्त हाथ में लिया और cleaved एंजाइम पासा खेलनेवाला द्वारा में 21-25 न्यूक्लियोटाइड-लंबे "लघु आरएनए हस्तक्षेप" (siRNAs) 19,20 है। ये siRNAs तो कर रहे हैं incorporमें पैदा आरएनए प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC), जिसमें से एक कतरा खारिज कर दिया जाएगा, आरएनए बाध्य RISC जटिल करने के लिए बाध्य करने के लिए और लक्ष्य mRNA फोड़ना और इस तरह अपने स्तर को कम करने और इसके अनुवाद 19,20 बाधित की इजाजत दी।
बुनियादी मच्छर जीव विज्ञान के कई आंतरिक सुविधाओं मेजबान वरीयता (जैसे, गंध, स्वाद), संभोग, प्रजनन और प्रतिरक्षा सहित vectorial क्षमता, व्यवस्थित करना। इन जैविक प्रक्रियाओं के महत्व को देखते हुए यह जरूरी है कि एक आनुवंशिक या औषधीय स्तर पर उनके मॉडुलन वेक्टर नियंत्रण के लिए नए अवसरों, कीटनाशक प्रतिरोध की तरक़ीब सहित पेशकश करेगा, और वेक्टर प्रबंधन के लिए अधिक मोटे तौर पर एकीकृत दृष्टिकोण के लिए नए उपकरण उपलब्ध कराने की संभावना है। कार्यात्मक जीनोमिक्स के उपयोग इन आंतरिक जैविक सुविधाओं अंतर्निहित जीन की भूमिका का आकलन करने के लिए नए लक्ष्य की पहचान सकें और हम कैसे प्रभावी ढंग से नए, अधिक प्रभावी नियंत्रण रणनीति बना सकते में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करेगाएँ। हम एक से पोटा संबंधी चरण के दौरान आरएनएआई की शुरुआत के लिए विकास और एक तेजी से इंजेक्शन विधि के प्रयोग का वर्णन है। gambiae। हम पालन कि एक आरएनएआई ट्रिगर की पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन प्रारंभिक चरण वयस्कों में परिणामी phenotypes के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है, यानी, जल्दी से यदि पछाड़ना जीन वयस्कों में शुरू किए गए के बाद उद्भव मनाया जाएगा उद्भव के बाद। यह तरीकों जीन पछाड़ना पोटा संबंधी विकास के अंतराल के दौरान शुरुआत और वयस्क चरणों, कि इस तरह के जीन पछाड़ना पोटा संबंधी विकास के दौरान शुरू की जारी रहती है और प्रभावित कर सकते हैं जल्दी वयस्क hemolymph-सुलभ प्रकार की कोशिकाओं, साथ ही प्रकार की कोशिकाओं में विस्तार के लिए सक्षम बनाता है कि कायापलट के दौरान और अधिक hemolymph-सुलभ हैं इस तरह के उद्भव के बाद वयस्क उपांग में पाया संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में वयस्क, की तुलना में।
मच्छरों में गैर ट्रांसजेनिक आरएनएआई उत्प्रेरण के लिए मौजूदा तरीकों वयस्क hemocoel 12,13 या आरएनएआई ट्रिगर लेपित नैनोकणों 14-17 या microalgae आधारित अणुओं dsRNA 18 के लार्वा खिला में dsRNA के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है। वयस्क मच्छर लक्ष्य निर्धारण, जबकि अत्यंत मूल्यवान, जीन है कि पहले विकास की अवधि के दौरान कार्य की एक बड़ी संख्या को बाहर कर सकते हैं। लार्वा खिला द्वारा शुरू पछाड़ना असंगत phenotypes कारण वयस्क अवस्था के दौरान भाग में, चर प्रोटीन हठ की क्षमता के लिए पोटा संबंधी मंच के माध्यम से उपज हो सकती है। इसलिए, एक अतिरिक्त तरीका है कि पोटा संबंधी विकास के दौरान आरएनएआई की शुरुआत और पूरी तरह से पूर्व वयस्क विकास के चरणों के दौरान जीन काम करता है, साथ ही बढ़ाया क्षमताओं का आकलन करने के लिए वयस्क चरणों के दौरान जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक साधन प्रदान करेगा पर विशेष रूप से शुरू करने के उद्देश्य से है। जीन पछाड़ना dsRNA इंजेक्शन या अभिव्यक्ति, जीन के हठ पछाड़ना पर आधारित दृष्टिकोण के साथ के रूप मेंभविष्यवाणी नहीं की जा सकती है। इसलिए, प्रतिलिपि या प्रोटीन का स्तर हित के विकास की अवधि के दौरान ब्याज की जीन के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। हालांकि हम एक निरंतरता का निरीक्षण SRPN2 dsRNA इंजेक्शन पशुओं में SRPN2 के लिए 5 दिन के बाद इंजेक्शन में प्रोटीन का स्तर कम है, इस तरह के प्रोटीन कारोबार और आधा जीवन जैसे कारकों विभिन्न लक्ष्यों के लिए अलग कर सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित किया है कि dsRNA इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और एक agarose जेल पर बरकरार प्रकट होता है। हम अनुशंसा करते हैं प्रयोगकर्ताओं इन कारकों पुनर्मूल्यांकन यदि पछाड़ना परिणामों के लिए पर्याप्त नहीं हैं, और dsRNA के संबंधित सांद्रता विशिष्ट जीन लक्ष्य के लिए अनुभव से परीक्षण किया जाना पड़ सकता है।
हम एक से पोटा संबंधी चरण के दौरान शाही सेना के हस्तक्षेप की दीक्षा के लिए एक विधि का वर्णन है। gambiae विकास। इस विधि dsRNA के microinjection के माध्यम से परिचय सीधे जल्दी pupae के hemocoel में पर निर्भर करता है और इंजेक्शन द्वारा गुणवत्ता के आकलन के लिए अनुमति देता हैडाई लेबल dsRNA का उपयोग करें। इंजेक्शन गुणवत्ता कल्पना करने की क्षमता सफल पछाड़ना सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण वृद्धि का गठन किया और इंजेक्शन आधारित जीन पछाड़ना है कि सबसे पहले की रिपोर्ट dsRNA आधारित प्रोटोकॉल वयस्क अवस्था पर ध्यान केंद्रित में विचार नहीं किया गया है का एक पहलू का गठन किया। इस विकास की अवधि, जीन है कि इस महत्वपूर्ण विकास अंतराल के दौरान एक भूमिका निभा सकता है की शुरुआत में प्यूपा को लक्षित करके, या वयस्कता के प्रारंभिक दौर में कार्यात्मक रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। साथ ही, इस विधि कोशिकाओं है कि कायापलट के दौरान पहुंच रहे हैं में कोशिकाओं को dsRNA वितरण, और शाही सेना के हस्तक्षेप की स्थापना के लिए सक्षम हो सकता है, लेकिन पूरी तरह से बनाई वयस्क मच्छरों में कम से सुलभ है।
हार्कर एट अल द्वारा हाल ही में माइक्रोएरे विश्लेषण। (2012) 560 एक की पहचान की। gambiae टेप कि विनियमित रहे थे या अलग विकास के चरणों के दौरान कम से कम 4 गुना से नीचे विनियमित, भ्रूण से वयस्क को लेकर। 56 की0 टेप पहचान, 309 का एक सेट पोटा संबंधी विकास के दौरान 27 विनियमित किया गया था। इन निष्कर्षों को सुझाव है कि उन लोगों पोटा संबंधी चरण के दौरान पाए जाते हैं, एक अंतराल के दौरान जो जीव कायापलट की प्रक्रिया से गुजरते सहित मच्छर विकास में अंतर जीन अभिव्यक्ति के लिए कई आवश्यकताओं, देखते हैं कि। एक सहित कई कीट प्रजातियों में। gambiae, इस तरह के विकास (यानी, पोटा संबंधी चर्म संबंधी और काइटिन बाध्यकारी प्रोटीन) के रूप में की प्रक्रिया में शामिल जीन 27-31 और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (यानी, टोल रिसेप्टर की तरह प्रोटीन) 27,32-34 अत्यधिक पोटा संबंधी चरण के दौरान व्यक्त कर रहे हैं। एक बार एक पूरी तरह से बनाई वयस्क उभरा है, वहाँ पर्यावरण और शारीरिक परिवर्तनों से 35 के जवाब में जीन अभिव्यक्ति जारी रखा है। विशेष रूप से, जल्दी वयस्क विकास के दौरान, वहां विकास जीन (यानी, वयस्क चर्म संबंधी और sarcoplasmic प्रोटीन) 36, की अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ-साथ अन्य प्रमुख जीन है (यानी </em>, शुक्राणु विशिष्ट प्रोटीन और साइटोक्रोम P450 चयापचय एंजाइमों) 27,36।
सकारात्मक इस प्रोटोकॉल, SRPN2 के विकास में इस्तेमाल नियंत्रण, एक एक है। gambiae सेरीन protease अवरोध (serpin)। SRPN2 कीट melanization, कीड़े 21,22 में एक व्यापक स्पेक्ट्रम सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नकारात्मक नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। छद्म ट्यूमर गठन 21,22, एक phenotype है कि आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी के प्रयोग के द्वारा मनाया जाता है में वयस्क मच्छरों परिणामों में SRPN2 की पछाड़ना। यह देखते हुए कि यह अलग phenotype आसानी से लाइव कीड़ों में रन बनाए जा सकते हैं, हम प्रारंभिक पोटा संबंधी चरण आरएनएआई इंजेक्शन के लिए SRPN2 इस्तेमाल किया। इसके अलावा, सभी SRPN2 विकास के चरणों 37 के दौरान व्यक्त किया जाता है, जिससे जल्दी वयस्क में पोटा संबंधी चरण आरएनएआई इंजेक्शन और समारोह के आकलन के लिए एक अच्छा लक्ष्य प्रदान करते हैं। हम जानते हैं कि विधि हम विकसित किया है उत्प्रेरण समान वयस्क melanotic pseud में सक्षम है का प्रदर्शन विकास की पोटा संबंधी चरण के दौरान प्रदर्शन किया dsRNA इंजेक्शन का एक परिणाम के रूप में ओ-ट्यूमर गठन। इस प्रोटोकॉल के विकास में, हम जल्दी पोटा संबंधी विकास के दौरान कहा कि इंजेक्शन मनाया है (यानी, लार्वा-पोटा संबंधी गिरना के बाद पहली बार 24 घंटे) इष्टतम वयस्क उद्भव प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। घटना है कि गरीब उद्भव के बाद इंजेक्शन प्राप्त की है में, हम अधिक से अधिक सटीकता के साथ लार्वा मंचन सलाह देते हैं, कम व्यापक छल्ली सख्त से pupae प्राप्त करने और विश्वास दिलाता हूं जल्दी पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन करने के लिए हासिल की है। इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान इष्टतम उद्भव दरों में छल्ली परिणामों को होने वाले नुकसान को कम करने और बढ़ती बढ़ाई सुनिश्चित करना है कि पशु का केवल इरादा क्षेत्र की हवा निकाल दी है कर सकते हैं। यदि सुई उदर छल्ली के माध्यम से पंचर चाहिए, डाई लेबल तरल की पूलिंग प्यूपा के बाहरी पर स्पष्ट हो जाएगा या फिल्टर पेपर तर जाएगा। यह अत्यधिक किसी भी pupae एक से अधिक छल्ली पंचर है कि त्यागने के लिए सिफारिश की है।
jove_content "> वयस्क मच्छर इंजेक्शन के प्रदर्शन के साथ कई प्रयोगशालाओं का व्यापक अनुभव के साथ, पहले से पहचान microinjection दृष्टिकोण पोटा संबंधी आरएनएआई प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए सरल प्रोटोकॉल संशोधनों के साथ अनुकूलित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस विधि के लक्ष्य के शोधकर्ताओं की क्षमता प्रदान करने के लिए है समय सीमा के दौरान जो रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण करती है, किया जा सकता है और अधिक अनुसंधान कि उपन्यास वेक्टर नियंत्रण रणनीति के विकास का समर्थन करेंगे सक्षम करने के लिए विस्तार। दिलचस्प है, इस तरह के Rhodnius prolixus और स्पोडोप्टेरा frugiperda के रूप में अन्य प्रजातियों में प्रयोगों, कि जीन मुंह बंद प्रभाव ज्यादा हो जाते हैं पता चलता है अधिक से अधिक जब पूर्व वयस्क के दौरान शुरू 38,39 चरणों। विकास के सभी चरणों के दौरान, आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना जीन तेज़ी और जीन मुंह बंद करने के हठ, और लक्षित जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन की स्थिरता के बारे में विचार करने का विषय है। आदर्श आरएनएआई लक्ष्य जीन उन है कि एक protei सांकेतिक शब्दों में बदलना हो जाते हैंn या आरएनए एक कम आधा जीवन और उच्च कारोबार दर 11,40 है।ट्रांसजेनिक आरएनएआई रणनीतियों भी पूर्व वयस्क चरणों के दौरान तेज़ी और आरएनएआई के हठ के बारे में विचार कर समाधान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, ट्रांसजेनिक तकनीक में कई कमियां (जैसे, ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए आवश्यक समय, प्रयोगात्मक मच्छर matings कीड़े उत्पन्न करने के लिए समय-फ्रेम है विनियमित dsRNA अभिव्यक्ति, और ट्रांसजेनिक शेयरों के रखरखाव) के साथ। इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल पोटा संबंधी विकास के दौरान और सेल प्रकार है कि आरंभ और कायापलट दौरान सुलभ हैं, लेकिन वयस्कों में कम पहुंच रहे हैं में जीन पछाड़ना शुरू करने के लिए एक आसान और तेजी से विधि देता है। डाई लेबल dsRNA निलंबन के उपयोग के इंजेक्शन की सफलता का आकलन आसान और pupae के भीतर शुरू की सामग्री के प्रसार के लिए अनुमति देता है। पोटा संबंधी इंजेक्शन वयस्कों में ट्यूमर गठन की शुरुआत पर हमारे डेटा, वयस्कों के रूप में इंजेक्शन पशुओं, की तुलना में init के अनुरूप हैपोटा संबंधी चरण के दौरान की iation आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना। हमारे जी 3 मच्छर लाइन का उपयोग करना है और हमारे insectary परिस्थितियों में, हम वयस्क melanotic छद्म ट्यूमर गठन के रूप में जल्दी के रूप में 10 दिनों वयस्कों के बाद इंजेक्शन तीन से पाँच दिनों इंजेक्शन के बाद उद्भव निरीक्षण करते हैं। जल्दी पोटा संबंधी चरण इंजेक्शन प्रदर्शन करके, हम के रूप में जल्दी से पांच दिनों के बाद इंजेक्शन (यानी, तीन से चार दिनों के बाद उद्भव) के रूप में दिखाई दे melanotic छद्म ट्यूमर गठन निरीक्षण करते हैं। इन आंकड़ों का मतलब यह है कि इस विधि के तहत एक पहले से अध्ययन विकासात्मक अवधि (यानी, पोटा संबंधी विकास) के दौरान जीन पछाड़ना की दीक्षा सक्षम बनाता है। हमारे डाई लेबलिंग विधि भी सभी लार्वा instars दौरान छल्ली की पारदर्शी प्रकृति के कारण, नए लार्वा इंजेक्शन प्रोटोकॉल के विकास के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल नियंत्रण एक पछाड़ना phenotype प्रदर्शित करने के लिए वयस्क अवस्था में प्रगति की आवश्यकता है, वहीं भविष्य प्रयोगों जल्दी pupae के इंजेक्शन प्रदान करेगा निम्नलिखित पोटा संबंधी चरण-विशिष्ट phenotypes आकलन करने के लिएअतिरिक्त विकासात्मक अवधियों में इस विधि के विस्तार के बारे में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि इस तरह देर से पोटा संबंधी विकास के रूप में। सारांश में, इस विधि आरएनएआई की मध्यस्थता जीन पछाड़ना की पोटा संबंधी चरण दीक्षा के लिए एक मूल्यवान आरएनएआई प्रोटोकॉल प्रदान करता है और कार्यात्मक जीनोमिक उपकरण वेक्टर कीट अनुसंधान समुदाय के भीतर उपयोग के लिए उपलब्ध फैलता है।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |