RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
マラリアは毎年、個人の何百万人に影響を与える蚊が媒介する感染症です。世界保健機関(WHO)は2013年に5年1歳未満の子供に発生した78パーセントそのうちのマラリアによる約584000人の死亡があったことを報告しています。人間のマラリアを引き起こす病原体は、属マラリア原虫内アピコンプレクサ寄生虫であり、メスのハマダラカによって、その人のホスト間で伝送されます。蚊が感染している個体からの血液食事をとり、その後、堆積物は、その後の血液の食事に感染していない個体に寄生虫を感染性ときに送信が発生します。属ハマダラカの中では、 ハマダラカは最大ベクトル容量を持つ種で、サハラ以南のアフリカ1-3で最も著名なマラリアベクトルです。
現在、殺虫剤の展開によって蚊のベクトル制御は、bに続け人間のマラリアの負担を軽減するために採用の主要な方法を電子。 1960年代からの殺虫剤の使用は、非常に成功することが証明されたが、殺虫剤抵抗性の上昇は、新規な殺虫剤及び代替ベクトル制御戦略4-7の開発の必要性が駆動しています。 2010年に、WHOへの報告49 63の国の合計は、マラリアベクトル1の殺虫剤抵抗性の発生を示しました。さらに、Afrotropical地域における抵抗データを評価するための査読論文を利用IRマッパー・ツールは、2001年と2012年の間に、それぞれ7ピレスロイドとジクロロジフェニルトリクロロエタン(DDT)のに抵抗が46%と27%増加するが、そこにあったことを報告しています。
RNA干渉(RNAi)はペチュニア植物8,9及び真菌アカパンカビ 9,10中の遺伝子を不活性化するために利用することができる技術として1990年代初期に同定されました。その後まもなく、1998年に、RNAiは、最初の注射または給紙方法9,11を介してアンチセンスまたは二本鎖RNA(dsRNAを)の導入によって動物モデルにおける遺伝子発現を減少させる手段として、 線虫(Caenorhabditis elegans)に記載されていました。その発見以来、RNAiは、研究者が急速に高度に選択的な転写後遺伝子サイレンシング機構を介して目的の遺伝子の機能的役割を調査するために、逆遺伝学を利用できるようにすることで、機能ゲノミクスの追求に革命をもたらしました。このようなキイロショウジョウバエなどのいくつかの生物では、干渉RNAコンストラクトを発現するトランスジェニック生物の使用は、遺伝子ノックダウン(KD)のために広く成功しています。 アンでの導入遺伝子の使用が。 RNAiのためのハマダラカが利用されてきた大規模なスクリーンのため有用であることが判明し得る、トランスジェニック蚊株の生成は、労力と時間がかかり、一般generatiに関心のある遺伝子の同定から行くために2〜3ヶ月を取ることもあります適切なトランスジェニック株12の上。現在、 アンにおける遺伝子KDの主要な方法。ハマダラカは、dsRNAの、大人の段階で、血リンパへの注射によって与えられた遺伝子12,13に特異的です。このプロセスは、典型的には、はるかに迅速なトランスジェニック法12よりであることを証明し、遺伝子KDの評価に関心のある遺伝子の同定から行くために1ヶ月程度かかります。幼虫期のRNAiのための方法は、 アンで最近確立されています。ナノ粒子供給14-17を経由して、または微細藻類ベースのdsRNAの経口送達によるハマダラカとネッタイシマカは、開発の初期段階で機能的ゲノム解析を実行するための機会を提供し、18を分子。直接給電注射、およびナノ粒子の送達方法において、dsRNAは、標的細胞によって自律的に取り、21-25ヌクレオチド長の「短い干渉RNA」(siRNAの)19,20に酵素ダイサーによって切断します。これらのsiRNAは、その後ですincorporated RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)、一方の鎖は、RNA結合RISC複合体が結合し、標的mRNAを切断し、それによって、そのレベルを低下させ、その翻訳19,20を阻害することができ、廃棄されるから。
基本的な蚊の生物学の多くの本質的な特徴は、ホストの嗜好( 例えば 、嗅覚、味覚)、交配、繁殖や免疫力を含め、ベクトルの容量を調節します。これらの生物学的プロセスの重要性を考えると、遺伝的または薬理学的なレベルで彼らの変調が殺虫剤抵抗性の回避を含む、ベクトル制御のための新たな機会を提供し、ベクトル管理に対するより広範に統合されたアプローチのための新しいツールを提供する可能性があります。これらの本質的な生物学的機能の根底にある遺伝子の役割を評価するための機能ゲノミクスの使用は、新しい標的の同定を可能にし、我々は効果的に新しい、より効果的な制御strategを作成することができますどのように新たな洞察を提供しますIES。我々はアンの蛹の段階でRNAiを開始するための迅速な注入方法の開発と使用を記載しています。ハマダラカ 。我々は、RNAiトリガーの蛹注入が早くノックダウン遺伝子が出芽後成人で開始された場合に観察されるよりも出芽後、 すなわち 、初期段階の成人で、得られた表現型の観察を可能にすることを確認します。この方法は蛹の発育期間中に始まると大人の段階に伸びる遺伝子ノックダウンを可能にし、蛹の開発中に開始ノックダウンなど、その遺伝子は、変態血リンパ-アクセス以上ある早期成人血リンパアクセス可能な細胞型、ならびに細胞型を持続し、影響を与えることができます出現を以下の成人付属で見つかったような感覚ニューロンのような大人、中より。
蚊に非トランスジェニックRNAiを誘導するための現在の方法は、成人の血体腔12,13またはRNAiトリガーコーティングされたナノ粒子14-17または微細藻類ベースのdsRNAが18を分子の幼虫の摂食へのdsRNAの直接注入を伴います。大人の蚊対象に、非常に貴重な一方で、以前の発育期間中に機能する多数の遺伝子を除外することができます。幼虫の摂食によって開始されたノックダウンは蛹を介して可変タンパク質の持続性の潜在的に、部分的に起因大人の段階で一貫性のない表現型をもたらすことができます。したがって、より完全に成人期の間の遺伝子機能を評価するために、遺伝子予め大人の発達段階の間の機能、ならびに強化された能力を評価するための手段を提供する蛹開発中のRNAiを開始する時に特異的に目的とする付加的な方法を導入します。 dsRNAを注入または発現に基づく遺伝子ノックダウンのアプローチと同様に、遺伝子の持続性はノックダウン予測することはできません。したがって、転写物またはタンパク質のレベルは、関心の発達期間中に目的の遺伝子のために評価されるべきです。我々はSRPN2 dsRNAを注入した動物にSRPN2のために5日目注射後にタンパク質レベルを減少させたの継続を観察しているが、このようなタンパク質の代謝回転および半減期などの要因が異なるターゲットで異なることができます。 dsRNAは、注射のために使用すること、ならびに、確保することが重要であるだけでなく濃縮し、アガロースゲル上でそのまま表示されます。私たちは、ノックダウンの結果が十分でない場合の実験者がこれらの要因を再評価をお勧めします、とdsRNAのそれぞれの濃度は、特定の遺伝子標的のために経験的にテストする必要があります。
我々はアンの蛹中にRNA干渉の開始のための方法を説明します。ハマダラカの開発。この方法は、直接、早期蛹の血体腔へのdsRNAのマイクロインジェクションを介して導入に依存しているとすることにより、注射品質の評価が可能色素標識dsRNAの使用。注射の質を視覚化する能力は、成功したノックダウンを確保するための重要な強化を構成し、成人期に焦点を当て、最も以前に報告されたdsRNAベースのプロトコルでは考慮されていない注入に基づく遺伝子ノックダウンの態様を構成します。この発達期間の開始時に蛹を標的とすることによって、この重要な発達期間中、または成人期の初期段階で役割を果たしている可能性がある遺伝子が機能的に評価することができます。さらに、この方法は、変態中にアクセスされている細胞内のdsRNAの細胞への送達、およびRNA干渉の確立を可能にするかもしれないが、完全に形成された大人の蚊でアクセスしにくいです。
ハーカーらによる最近のマイクロアレイ解析。(2012)560 アンを同定しました。アップレギュレートまたは胚から成人までの範囲の、異なる発生段階の間に少なくとも4倍ダウンレギュレートされたハマダラカ転写物。 56の0転写物が同定され、309のセットは、蛹の開発27の間にアップレギュレートされました。これらの知見は、蛹の段階で発生するもの、生物が変態を受け、その間に間隔を含む蚊の開発を通じてディファレンシャル遺伝子発現のための多くの要件が存在することを示唆しています。 アン含む多くの昆虫種、で。ハマダラカ 、このような開発( すなわち 、蛹クチクラとキチン結合タンパク質)27-31、免疫応答のようなプロセスに関与する遺伝子( すなわち 、トール受容体様タンパク質)27,32-34が非常に蛹の段階の間に発現されています。完全に形成された成体が出現したら、環境および生理学的に35の変化に応答して遺伝子発現が継続されます。特に、初期の大人の開発中に、発生遺伝子( すなわち 、大人のクチクラと筋タンパク質)36、の発現の増加だけでなく、他の重要な遺伝子が存在する( すなわち、 </em>、精子特異的タンパク質およびシトクロムP450代謝酵素)27,36。
このプロトコル、SRPN2の開発に使用される陽性対照は、 アンです。ハマダラカセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)。 SRPN2は昆虫メラニン、昆虫21,22における幅広いスペクトル先天性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしています。擬似腫瘍形成21,22、容易に光学顕微鏡を使用することによって観察される表現型の大人の蚊結果のSRPN2のノックダウン。この明確な表現型は簡単に生昆虫で得点することができることを考えると、我々は初期の蛹のRNAiの注射のためにSRPN2を使用していました。また、SRPN2により早期成人蛹のRNAi注入と機能の評価のための良好な標的を提供し、すべての発育段階37の間に発現されます。我々は、我々が開発した方法は、同様の成人黒色偽のを誘導することができることを実証します開発の蛹中に実行するdsRNA注射の結果としてのo-腫瘍形成。このプロトコルを開発する際に、我々は( すなわち 、幼虫、蛹の脱皮後の最初の24時間)は、最適な羽化を得るために重要である早期蛹の開発時に、その注射を観察しています。貧しい出現は、注射後に得られた場合には、我々はあまり大規模なキューティクルの強化で蛹を取得し、早期蛹注入が達成される保証するために、より高い精度で幼虫をステージングすることをお勧めします。さらに、最適な出現率のキューティクル結果へのダメージを最小限に抑え、注入中に倍率を大きくすると、動物の唯一の意図した領域がパンクしていることを確認することができます。針が腹キューティクルまで穿刺した場合は、色素で標識された液体のプールは蛹の外側には明らかであろうか、ろ紙を飽和さ。非常に複数のキューティクル穿刺を持つ任意の蛹を破棄することをお勧めします。
大人の蚊注射の性能に多くの研究室の豊富な経験とjove_content ">、以前に同定されたマイクロインジェクションのアプローチは蛹RNAi実験で使用するための単純なプロトコルの変更に適合させることができる。全体的に、この方法の目的は、研究者の能力を提供することです遺伝的分析は、さらに新たなベクトル制御戦略の開発を支援する研究を可能にする、実行することができ、逆その間の時間枠を展開します。興味深いことに、このようなRhodniusのprolixusおよびヨトウガのような他の種での実験は、サイレンシング効果はあまりになる傾向があり、その遺伝子を明らかに前成体は38,39段の間に大きいとき、開発のあらゆる段階で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、遺伝子サイレンシング、および標的遺伝子がコードするタンパク質の安定性の迅速性と持続性に関する考慮事項に従うものとします。開始。理想的なRNAi標的遺伝子はproteiをコードするものとなる傾向がありますnまたは短い半減期と高い離職率11,40を有しているRNA。トランスジェニックRNAiの戦略はまた、前成体期中速さとRNAiの持続性に関する考慮事項に対処するために使用することができるが、遺伝子組換え技術は、昆虫を生成するために、蚊の交配のための多くの欠点( 例えば 、トランスジェニック系統の生成に必要な時間、実験時間フレームを持っています規制dsRNA発現、およびトランスジェニック株のメンテナンス)で。これとは対照的に、我々のプロトコルは、蛹、開発中および発信や変態中にアクセス可能ですが、大人にはあまりアクセス可能な細胞型において遺伝子ノックダウンを開始するための簡単かつ迅速にする方法を提供します。色素標識のdsRNA懸濁液の使用は蛹内導入物質の注入の成功と分散の容易な評価が可能になります。大人のように注射した動物と比較して、蛹注入成人における腫瘍形成の発症に関する我々のデータは、初期化と一致しています蛹の段階でのRNAi媒介ノックダウンのiation。私たちのG3蚊ラインを使用して、私たちの昆虫館の条件下で、私たちは早くも10日のような大人の注射後の成人黒色擬似腫瘍形成を観察すると、3〜5日後に出現注入。早期蛹段噴射を行うことにより、我々は、早ければ5日後に注射( すなわち 、3〜4日が出現後)として目に見える黒色擬似腫瘍形成を観察します。これらのデータは、この方法は以前の下で研究された発育期間( すなわち 、蛹の開発)の間に遺伝子ノックダウンの開始を可能にすることを示唆しています。我々の色素標識法はまた、すべての幼虫齢時に表皮の半透明の性質に起因する新たな幼虫の注入プロトコルの開発に有用であろう。本研究で用いた制御は、ノックダウンの表現型を表示するには、成人期への進行を必要とするが、早期蛹の注射後の蛹特有の表現型を評価するための将来の実験が提供されますこのような後半蛹の開発など、追加の発育期間中に、この方法の拡張に関する貴重な洞察。要約すると、この方法は、RNAi媒介遺伝子ノックダウンの蛹開始のための貴重なRNAiのプロトコルを提供し、ベクトル昆虫研究コミュニティ内で使用可能な機能ゲノムツールを拡張します。
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |