RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Malaria er en mygg-borne smittsom sykdom som rammer mange millioner av mennesker hvert år. Verdens helseorganisasjon (WHO) rapporterer at i 2013 var det ca 584 000 dødsfall på grunn av malaria, 78 prosent av dem skjedde i barn under fem år 1. Patogener som forårsaker menneskelig malaria er apicomplexan parasitter i slekten Plasmodium og overføres mellom sine menneskelige verter av kvinnelige Anopheles mygg. Smitteoverføring skjer når myggen tar et blodmåltid fra en person som er infisert, og deretter innskudd smitte parasitter inn i en frisk person i en påfølgende blodmåltid. Innenfor slekten Anopheles, er Anopheles gambiae artene med størst vektor kapasitet og er den mest fremtredende malaria vektor i Afrika sør for Sahara 1-3.
Foreløpig fortsetter mygg vektor kontroll ved distribusjon av insektmidler for å be de store metode som anvendes for å redusere byrden av menneskelig malaria. Selv om bruken av insektmidler siden 1960-tallet har vist seg å være svært vellykket, har økningen av insektmiddel motstand drevet et behov for utvikling av nye insektmidler og alternative vektorkontrollstrategier 4-7. I løpet av 2010, totalt 49 av 63 land som rapporterer til WHO indikerte forekomsten av insektmiddel resistens hos malaria vektorer 1. I tillegg IR Mapper verktøy, som benytter peer-reviewed litteratur for å vurdere resistensdata i Afrotropical regioner, rapporterer at mellom 2001 og 2012 var det 46% og 27% økning i motstand mot pyretroider og dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), henholdsvis 7.
RNA interferens (RNAi) ble identifisert i begynnelsen av 1990 som en teknikk som kan brukes til å inaktivere gener i Petunia plante 8,9 og i soppen Neurospora crassa 9,10. Kort tid etteri 1998, ble RNAi først dokumentert i Caenorhabditis elegans som et middel for å redusere genuttrykk i en dyremodell ved innføring av antisense eller dobbel tråd RNA (dsRNA) via injeksjon eller fôring metoder 9,11. Siden den ble oppdaget, har RNAi revolusjonert jakten på funksjonell genomforskning ved å tillate forskere å utnytte revers genetikk å raskt undersøke de funksjonelle rollene gener av interesse via en svært selektiv post-transcriptional gene stillemekanisme. I visse organismer, slik som Drosophila melanogaster, har bruken av transgene organismer som uttrykker interfererende RNA-konstruksjoner vært vidt vellykket for genet knockdown (KD). Selv om bruken av transgener i An. gambiae for RNAi har blitt utnyttet og kan være nyttig for store skjermer, er den generasjonen av transgene mygg stammer både arbeids- og tidkrevende, vanligvis tar to til tre måneder å gå fra identifisering av et gen av interesse for generasjon avpå av en passende transgene lager 12. For tiden er den primære metoden for genet KD i An. gambiae er ved injeksjon i hemolymfe, i løpet av den voksne stadium, av dsRNA som er spesifikke for et gitt gen 12,13. Denne prosessen tar vanligvis omtrent en måned å gå fra identifisering av et gen av interesse for vurdering av genet KD, viser seg å være mye raskere enn transgene metoder 12. Metoder for larve-trinns RNAi er etablert nylig i An. gambiae og Aedes aegypti via nanopartikkel fôring 14-17 eller ved oral levering av mikroalger baserte dsRNA molekyler 18, med muligheter til å utføre funksjonell genomikk analyse i tidlige stadier av utviklingen. I direkte innsprøytning, fôring, og nanopartikkel leveringsmåte, er dsRNA tatt opp selvstendig av målcellen og spaltes av enzymet Dicer i 21-25 nucleotide lange "short inter RNA" (siRNAs) 19,20. Disse sirnas er så incorporrerte inn i RNA-induserte stanse kompleks (RISC), fra hvilken en tråd vil bli forkastet, slik at RNA-bundet RISC-komplekset for å binde seg til og spalte mål-mRNA og derved redusere dets nivå og hemme dens oversettelse 19,20.
Mange iboende trekk ved grunnleggende mygg biologi modulere vektor kapasitet, inkludert verts preferanse (f.eks luktesans, gustation), parring, reproduksjon og immunforsvar. Gitt betydningen av disse biologiske prosesser, er det sannsynlig at deres modulasjon på en genetisk eller farmakologisk nivået vil gi nye muligheter for vektorkontroll, inkludert omgåelse av insektmiddel motstand, og gi nye verktøy for mer bredt integrerte tilnærminger til vektor ledelse. Bruken av funksjonell genomforskning for å vurdere rollene til genene bak disse iboende biologiske funksjonene vil gjøre det mulig å identifisere nye mål og gi ny innsikt i hvordan vi effektivt kan skape nye, mer effektiv kontroll strategtallet. Vi beskriver utvikling og bruk av en rask injeksjon metode for å initiere RNAi under pupal fasen av An. gambiae. Vi observerer at pupal scenen injeksjon av en RNAi trigger muliggjør observasjon av resulterende fenotyper i tidlig stadium voksne, dvs. før etter fremveksten enn det som observeres hvis genet knockdown ble initiert av voksne etterveksten. Dette metoder gjør at genet knockdown begynner i løpet av pupal utviklings intervall og strekker seg inn adulte stadier, slik at genet knockdown startes under pupal utvikling kan vedvare og påvirke tidlig voksen hemolymph brukere celletyper, samt celletyper som er mer hemolymph brukere under metamorfose enn i den voksne, for eksempel sensoriske nevroner som finnes hos voksne vedheng etter fremveksten.
Aktuelle metoder for å fremkalle ikke-transgen RNAi i mygg involverer direkte injeksjon av dsRNA inn i voksen hemocoel 12,13 eller larve fôring av RNAi utløse belagt nanopartikler 14-17 eller mikroalger baserte dsRNA molekyler 18. Targeting den voksne mygg, mens svært verdifull, kan ekskludere et stort antall gener som fungerer under tidligere utviklingsperioder. Knockdown initiert av larvene kan gi inkonsistente fenotyper i løpet av voksenstadiet skyldes delvis, til potensialet av variabel protein persistens gjennom pupal trinnet. Derfor er innføring av en ytterligere metode som er rettet spesielt mot initiering av RNAi i løpet av pupal utvikling vil gi et middel for å vurdere mer fullstendig genfunksjoner i løpet av pre-voksen utviklingsstadier, så vel som forbedrede evner til å vurdere genfunksjon i løpet av adulte stadier. Som med genet knockdown tilnærming basert på dsRNA injeksjon eller uttrykk, utholdenhet av genet knockdownkan ikke forutsies. Derfor bør transkripsjons eller proteinnivå vurderes for genet av interesse under utviklings perioder av interesse. Selv om vi ser en fortsettelse av redusert proteinnivå på dag 5 etter injeksjon for SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injiserte dyr, kan faktorer som protein omsetning og halveringstid variere for ulike mål. Det er viktig å sikre, så vel som den dsRNA som skal brukes for injeksjon er godt konsentrert og vises intakt på en agarosegel. Vi anbefaler forskere revurdere disse faktorene hvis knockdown resultatene ikke er tilstrekkelige, og respektive konsentrasjoner av dsRNA kan trenge å bli testet empirisk for spesifikke genet mål.
Vi beskriver en fremgangsmåte for initiering av RNA-interferens under pupal fasen av An. gambiae utvikling. Denne metoden er avhengig av innføring via mikroinjeksjon av dsRNA direkte inn i hemocoel av tidlig puppe og gjør det mulig for vurdering av kvaliteten av injeksjonsbruk av dye-merket dsRNA. Evnen til å visualisere injeksjons kvalitet utgjør en viktig forbedring for å sikre vellykket knockdown og utgjør et aspekt av sprøytebasert genet knockdown som ikke har blitt vurdert i de tidligere rapporterte dsRNA-baserte protokoller som fokuserer på det voksne stadium. Ved å målrette puppe ved utbruddet av denne utviklingsperioden, gener som kan spille en rolle i denne kritiske utviklings intervall, eller i den tidlige fasen av voksenlivet kan evalueres funksjonelt. I tillegg kan denne metoden gi dsRNA levering til cellene, og etablering av RNA interferens i celler som er tilgjengelig under metamorfosen, men mindre tilgjengelig i fullt dannet voksne mygg.
En fersk microarray analyse av Harker et al. (2012) identifiserte 560 An. gambiae transkripsjoner som ble oppregulert eller nedregulert med minst fire ganger i løpet av forskjellige utviklingsstadier, alt fra embryo til voksen. Av de 560 transkripsjoner identifisert, et sett av 309 ble oppregulert i løpet pupal utvikling 27. Disse funnene tyder på at det er mange krav til differensial genuttrykk gjennom mygg utvikling, inkludert de som oppstår under pupal scenen, et intervall der organismen gjennomgår metamorfose. I mange insektarter, inkludert An. gambiae, gener som er involvert i prosesser såsom utvikling (dvs. pupal cuticular og chitin-bindende proteiner) 27-31 og immunrespons (dvs., Toll-reseptor-lignende proteiner) 27,32-34 er sterkt uttrykt i løpet av pupal trinnet. Når en fullt dannet voksen har dukket opp, er det fremsatte genekspresjon i respons på miljø- og fysiologiske endringer 35. Spesielt, under tidlig voksen utvikling, er det en økning i ekspresjonen av utviklings gener (dvs. voksen cuticular og sarkoplasmatiske proteiner) 36, så vel som andre nøkkelgener (dvs. </em>, Sperm spesifikt protein og cytokrom P450 metabolisme enzymer) 27,36.
Den positive kontrollen som brukes i utviklingen av denne protokollen, SRPN2, er en An. gambiae serin protease inhibitor (Serpin). SRPN2 spiller en viktig rolle i den negative regulering av insekt melanization, et bredspektret medfødte immunrespons hos insekter 21,22. Knockdown av SRPN2 hos voksne mygg resulterer i pseudo-tumordannelsen 21,22, en fenotype som er lett observeres ved anvendelse av lysmikroskopi. Gitt at dette distinkt fenotype kan enkelt scoret i levende insekter, brukte vi SRPN2 for første pupal scenen RNAi injeksjoner. I tillegg er SRPN2 uttrykkes i alle utviklingsstadier 37, for derved å tilveiebringe et godt mål for pupal scenen RNAi injeksjon og vurdering av funksjon i tidlig voksen. Vi viser at metoden vi har utviklet er i stand til å fremkalle lignende voksen melanotisk pseud o-svulstdannelse som en følge av dsrna injeksjoner utføres i løpet av pupal utviklingstrinn. I utviklingen av denne protokollen, har vi observert at injeksjon under tidlig pupal utvikling (dvs. de første 24 timer etter larve-pupal molt) er kritisk for å oppnå optimal voksen veksten. I tilfelle dårlig veksten oppnås etter injeksjon, anbefaler vi avholder larver med større nøyaktighet, for å få puppe med mindre omfattende cuticle herding og sikre tidlig pupal scenen injeksjon oppnås. Videre minimere skader på skjel resulterer i optimal veksten priser og økende forstørrelse under injeksjon kan bidra til å sikre at bare den tiltenkte område av dyret er punktert. Hvis nålen skulle punktere gjennom til ventral skjellaget, vil kontinuitets dye-merket væske være tydelig på utsiden av puppe eller vil mette filterpapiret. Det er sterkt anbefalt å forkaste ethvert puppe som har mer enn en cuticle punktering.
jove_content "> Med de omfattende erfaringer fra mange laboratorier med utførelsen av voksne mygg injeksjoner, kan tidligere identifiserte mikroinjeksjon tilnærminger tilpasses med enkle protokoll modifikasjoner for bruk i pupal RNAi eksperimenter. Samlet er målet med denne metoden er å gi forskerne muligheten til å utvide tidsrammen der reversere genetiske analyser kan utføres, videre slik at forskning som vil støtte utviklingen av nye vektor kontroll strategier. Interessant, eksperimenter i andre arter, som for eksempel Rhodnius prolixus og Spodopterafrugiperda, avslører at genet Slå effekter pleier å være mye større når initiert under pre-adulte stadier 38,39. i alle stadier av utviklingen, er underlagt hensynet til hurtighet og utholdenhet av genet stanse, og stabiliteten av proteiner kodet av målrettede gener RNAi-mediert genet knockdown. det ideelle RNAi mål gener som har en tendens til å være de som koder for et Proteinkonn eller RNA som har en kort halveringstid og høy omløpshastighet 11,40.Mens transgene RNAi strategier kan også anvendes for å ivareta hensynet vedrørende hurtighet og varighet av RNAi i løpet av pre-adulte stadier, transgene teknikker har mange ulemper (f.eks tid som er nødvendig for generering av transgene linjer, eksperimentelle tidsrammer for myggparringer for å generere insekter med regulert dsRNA uttrykk, og vedlikehold av transgene aksjer). Derimot, gir vår protokoll en enklere og raskere metode for å initiere genet knockdown under pupal utvikling og i celletyper som kommer og er tilgjengelig under metamorfosen, men er mindre tilgjengelig hos voksne. Bruken av fargemerkede dsrna suspensjoner gir enkel vurdering av injeksjon suksess og spredning av introduserte materialet innen puppe. Våre data om inntreden av tumordannelse i pupal-injisert voksne, sammenlignet med dyr injisert som voksne, er konsistent med initiation av RNAi-mediert knockdown under pupal scenen. Ved hjelp av vår G3 mygg linjen og under våre insectary forhold, vi observerer den voksne melanotisk pseudo-svulstdannelse så tidlig som 10 dager etter injeksjon av voksne injisert tre til fem dager etter fremveksten. Ved å utføre tidlig pupal-trinns, observerer vi synlig melanotisk pseudo-svulstdannelse så tidlig som fem dager etter injeksjon (dvs. tre til fire dager etter fremveksten). Disse data antyder at denne fremgangsmåte gjør det mulig for initiering av genet knockdown i løpet av en på forhånd under-studert utviklingsperioden (dvs. pupal utvikling). Vår fargestoff merking Fremgangsmåten kan også vise seg å være nyttige for utvikling av nye larve injeksjons protokoller, på grunn av den gjennomskinnelige karakter av hårstråene under alle larver instars. Mens kontrollgruppen brukt i denne studien krever progresjon inn i voksne stadiet for å vise en knockdown fenotype, for fremtidige eksperimenter vurdere pupal stadium-spesifikke fenotyper etter injeksjon av tidlig puppe vil giverdifull innsikt om utvidelse av denne metoden i flere utviklingsperioder som sen pupal utvikling. Oppsummert gir denne metoden en verdifull RNAi protokoll for pupal scenen initiering av RNAi-mediert genet knockdown og utvider funksjonell genomikk verktøyene som er tilgjengelige for bruk i vektor insekt forskningsmiljø.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |