RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
Malaria är en myggburen infektionssjukdom som påverkar många miljontals individer varje år. Världshälsoorganisationen (WHO) rapporterar att under 2013 fanns det cirka 584 tusen dödsfall på grund av malaria, 78 procent av som inträffat hos barn under fem års ålder 1. De patogener som orsakar mänsklig malaria är apicomplexa parasiter inom släktet Plasmodium och överförs mellan sina mänskliga värdar av kvinnliga Anopheles myggor. Överföring sker när mygga tar en blodmjöl från en individ som är infekterad, och sedan insättningar infektiösa parasiter i en oinfekterad individ i en efterföljande blodmjöl. Inom släktet Anopheles, är Anopheles gambiae de arter som har störst vektor kapacitet och är den mest framträdande malariavektor i Afrika söder om Sahara 1-3.
Närvarande, mygga vektorkontroll genom utplacering av insekticider fortsätter till be huvud metod som används för att minska bördan av mänsklig malaria. Även om användningen av insekticider sedan 1960-talet har visat sig vara mycket framgångsrik, har ökningen av insektsresistens kört ett behov av utveckling av nya insekticider och alternativa vektorkontrollstrategier 4-7. Under 2010, totalt 49 av 63 länder som rapporterar till WHO indikerade förekomsten av insektsresistens i malaria vektorer 1. Dessutom IR Mapper verktyg som utnyttjar granskad litteratur att bedöma resistensdata i Afrotropical regioner rapporterar att mellan 2001 och 2012 fanns det 46% och 27% ökning av resistens mot pyretroider och diklordifenyltrikloretan (DDT), respektive 7.
RNA-interferens (RNAi) identifierades i början av 1990-talet som en teknik som kan användas för att inaktivera gener i växten Petunia 8,9 och i svampen Neurospora crassa 9,10. Kort därefter,1998, var RNAi första dokumenterade i Caenorhabditis elegans som ett sätt att minska genuttrycket i en djurmodell genom införande av antisens- eller dubbelsträngat RNA (dsRNA) via injektion eller uppfödningsmetoder 9,11. Sedan dess upptäckt, har RNAi revolutionerat jakten på funktionell genomik genom att tillåta forskare att använda omvänd genetik för att snabbt undersöka funktionella roller gener av intresse via en mycket selektiv posttranskriptionell geners uttryck mekanism. I vissa organismer, såsom Drosophila melanogaster, har användningen av transgena organismer som uttrycker interfererande RNA-konstruktioner varit allmänt framgångsrika för gen knockdown (KD). Även om användningen av transgener i An. gambiae för RNAi har använts och kan vara användbar för storskaliga skärmar, är generering av transgena mygga stammar både arbets- och tidskrävande, i allmänhet tar två till tre månader att gå från att identifiera en gen av intresse för generatipå en lämplig transgen lager 12. För närvarande är den främsta metoden för gen KD i An. gambiae är genom injektion i hemolymfa, under sitt vuxna stadium, av dsRNA är specifikt för en given gen 12,13. Denna process tar normalt ungefär en månad att gå från identifiering av en gen av intresse för bedömningen av genen KD, visat sig vara mycket snabbare än transgena metoder 12. Metoder för larvstadiet RNAi har inrättats nyligen i An. gambiae och Aedes aegypti via nanopartiklar utfodring 14-17 eller genom oral tillförsel av mikroalger baserade dsRNA molekyler 18, erbjuder möjligheter att utföra funktionell genomisk analys under tidiga stadier av utveckling. I direktinsprutning, utfodring, och nanopartiklar leveransmetoder är dsRNA tas upp självständigt av målcellen och klyvs av enzymet Dicer i 21-25 nukleotider lång "kort interfererande RNA" (siRNA) 19,20. Dessa siRNA är då incorporated i RNA-inducerad tysta komplex (RISC), varifrån en del kommer att kasseras, vilket gör att RNA bundna RISC-komplexet att binda till och klyva mål-mRNA och därmed minska dess nivå och hämma dess översättning 19,20.
Många inneboende egenskaper hos grund mygga biologi modulera vectorial kapacitet, inklusive värd preferens (t.ex. olfaction, gustation), parning, reproduktion och immunitet. Med tanke på betydelsen av dessa biologiska processer, är det troligt att deras modulering på en genetisk eller farmakologisk nivå kommer att erbjuda nya möjligheter för vektorstyrning, inklusive kringgående av insektsresistens och ger nya verktyg för bredare integrerade strategier för vektorhantering. Användningen av funktionell genomik att bedöma rollerna av gener som ligger bakom dessa inneboende biologiska egenskaper gör det möjligt att identifiera nya mål och ge nya insikter i hur vi på ett effektivt sätt kan skapa nya, effektivare kontroll Strategtalet. Vi beskriver utvecklingen och användningen av en snabb injektion metod för att initiera RNAi under puppstadium av An. gambiae. Vi observerar att puppstadium injektion av en RNAi utlösare möjliggör observation av resulterande fenotyper i scen vuxna tidigt, det vill säga, förr efter uppkomst än vad som skulle observeras om gen knockdown inleddes hos vuxna efter uppkomst. Detta metoder möjliggör gen knockdown början under pupal utvecklings intervall och sträcker sig in i vuxenstadier, så att genen knockdown inleddes under PUPP utveckling kan kvarstå och påverka tidigt vuxna hemolymph åtkomliga celltyper, liksom celltyper som är mer hemolymph-tillgängliga under metamorfos än i den vuxna, såsom sensoriska neuroner som finns i vuxna bihang efter uppkomst.
Nuvarande metoder för att inducera icke-transgena RNAi i myggor innebär direkt injektion av dsRNA i vuxen hemocoel 12,13 eller larv utfodring av RNAi skjut belagda nanopartiklar 14-17 eller mikroalger baserade dsRNA molekyler 18. Inriktning vuxen mygga, medan extremt värdefull, kan utesluta ett stort antal gener som fungerar under tidigare utvecklingsperioder. Knockdown initierades av larver utfodring kan ge motsägande fenotyper under vuxenstadiet beror delvis på den potential som variabla protein uthållighet genom puppstadium. Därför införa ytterligare en metod som riktar sig specifikt till att inleda RNAi under PUPP utveckling kommer att ge en möjlighet att mer fullständigt bedöma genfunktioner under pre-vuxna utvecklingsstadier, liksom förbättrade förmåga att bedöma geners funktion under vuxenstadier. Som med gen knockdown strategi som bygger på dsRNA injektion eller uttryck, ihållande gen knockdownkan inte förutsägas. Därför bör transkript eller proteinnivåer bedömas för genen av intresse under utvecklingsperioder av intresse. Även om vi ser en fortsatt minskad proteinnivåer vid dag 5 efter injektion för SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injicerade djur, kan faktorer såsom proteinomsättningen och halveringstid skiljer sig för olika mål. Det är kritiskt för att säkerställa, liksom, att dsRNA som skall användas för injektion är väl koncentrerat och verkar intakt på en agarosgel. Vi rekommenderar experimentatorerna omvärdera dessa faktorer, om knockdown resultaten är inte tillräckliga, och respektive koncentrationer av dsRNA kan behöva testas empiriskt för specifika genmål.
Vi beskriver en metod för initiering av RNA-interferens under puppstadium av An. gambiae utveckling. Denna metod förlitar sig på att införa via mikroinjektion av dsRNA direkt i hemocoel tidiga puppor och möjliggör en bedömning av injektionskvalitet avanvändning av färgämnesmärkt dsRNA. Förmågan att visualisera injektion kvalitet utgör en kritisk förbättring för att säkerställa framgångsrik knockdown och utgör en del av injektionsbaserade gen knockdown som inte har beaktats i de flesta tidigare rapporterade dsRNA-baserade protokoll som fokuserar på den vuxna scenen. Genom att rikta puppan i början av denna utvecklingsperiod, gener som kan spela en roll under denna kritiska utvecklings intervall, eller under de tidiga stadierna av vuxenlivet kan utvärderas funktionellt. Dessutom kan denna metod gör det möjligt dsRNA leverans till celler, och etablering av RNA-interferens i celler som är tillgängliga under metamorfos, men mindre tillgängliga i fullt bildade vuxna myggor.
En ny microarray analys av Harker et al. (2012) identifierade 560 An. gambiae transkript som var upp-reglerade eller nedregleras av åtminstone fyra gånger under olika utvecklingsstadier, från embryot till en vuxen. Av de 560 transkript identifierats, en uppsättning av 309 var upp-regleras under PUPP utveckling 27. Dessa fynd tyder på att det finns många krav på differentiell genuttryck hela mygga utveckling, inklusive de som inträffar under puppstadium, ett intervall under vilket organismen genomgår metamorfos. I många insektsarter, inklusive An. gambiae, gener som är involverade i processer såsom utveckling (dvs pupal cuticular och kitin-bindande proteiner) 27-31 och immunsvar (dvs Toll receptorliknande proteiner) 27,32-34 är starkt uttryckt under puppstadium. När väl en helt formad vuxen har uppstått, finns en fortsatt genuttryck som svar på miljö- och fysiologiska förändringar 35. Noterbart är under tidig vuxen utveckling, det är en ökning i uttrycket av utvecklingsgener (dvs vuxna cuticular och sarkoplasmiska proteiner) 36, samt andra nyckelgener (dvs. </em>, Sperma specifikt protein och cytokrom P450 metabolism enzymer) 27,36.
Den positiva kontrollen används i utvecklingen av detta protokoll, SRPN2, är en An. gambiae serinproteasinhibitor (serpin). SRPN2 spelar en viktig roll vid den negativa regleringen av insektsmelanin, ett brett spektrum medfödda immunsvar hos insekter 21,22. Knockdown av SRPN2 hos vuxna myggor resulterar i pseudo-tumörbildning 21,22, en fenotyp som är lätt observeras med användning av ljusmikroskop. Med tanke på att denna distinkta fenotyp kan lätt görs i levande insekter, använde vi SRPN2 för första puppstadium RNAi injektioner. Dessutom är SRPN2 uttrycks under alla utvecklingsstadier 37, varigenom åstadkommes ett bra mål för puppstadium RNAi injektion och bedömning av funktion i tidig vuxen. Vi demonstrerar att metoden vi har utvecklat är i stånd att inducera liknande vuxen melanotiska pseud o-tumörbildning som en följd av dsRNA injektioner utförts under puppstadium i utvecklingen. Vid utvecklingen av detta protokoll, har vi observerat att injektion under tidig puppa utveckling (dvs de första 24 h efter larver-PUPP molt) är kritisk för att erhålla optimal vuxen uppkomst. I händelse av att dålig uppkomst erhålles efter injektion, rekommenderar vi staging larver med större noggrannhet, för att erhålla puppor med mindre omfattande nagelband härdning och försäkra tidig puppstadium injektion uppnås. Dessutom kan minimera skador på nagelbanden ger optimal uppkomst priser och ökande förstoring under injektion bidra till att endast den avsedda regionen djuret punkterad. Om nålen skall punktera igenom till den ventrala nagelband, kommer poolning av färgämnesmärkt vätskan vara uppenbart på det yttre av puppan eller kommer att mätta filterpapperet. Det rekommenderas att göra någon puppor som har mer än en nagelband punktering.
jove_content "> Med de omfattande erfarenheter av många laboratorier med utförandet av vuxna mygga injektioner, kan tidigare identifierade mikroinjektion metoder anpassas med enkla protokoll modifieringar för användning i PUPP RNAi-experiment. Totalt sett är målet med denna metod för att ge forskare möjlighet att expandera den tidsram under vilken omvända genetiska analyser kan utföras, ytterligare möjliggör forskning som kommer att stödja utvecklingen av nya strategier vektorkontroll. Intressant experiment i andra arter, såsom Rhodnius prolixus och Spodoptera frugiperda, visar att tysta gener effekter tenderar att vara mycket större när inleddes under pre-vuxen stegen 38,39. under alla stadier av utveckling, är föremål för överväganden när det gäller snabbhet och uthållighet av geners uttryck, och stabiliteten hos proteiner som kodas av riktade gener RNAi-medierad gen knockdown. den idealiska RNAi mål gener tenderar att vara de som kodar för en protein eller RNA som har en kort halveringstid och hög omsättningshastighet 11,40.Även transgena RNAi strategier också kan användas för att ta itu med överväganden om snabbhet och uthållighet av RNAi under pre-vuxenstadier, transgena tekniker har många nackdelar (t.ex. tid som krävs för generering av transgena linjer, experimentella tidsramar för mygga parningar att generera insekter med reglerad dsRNA uttryck och underhåll av transgena bestånd). Däremot ger våra protokoll en enklare och snabbare metod för att initiera gen knockdown under PUPP utveckling och celltyper som har sitt ursprung och är tillgängliga under metamorfos men är mindre tillgängliga hos vuxna. Användningen av färgämnesmärkta dsRNA suspensioner möjliggör enkel bedömning av injektions framgång och spridning av infört material inom puppor. Våra data om uppkomsten av tumörbildning i PUPP-injicerade vuxna, jämfört med djur som injicerats som vuxna, är förenlig med initiation av RNAi-medierad knockdown under puppstadium. Med vår G3 mygga linje och under våra insectary förhållanden, vi observera vuxna melanotiska pseudo-tumörbildning så tidigt som 10 dagar efter injektion av vuxna injiceras tre till fem dagar efter uppkomst. Genom att utföra tidig pupal stegs injektion, observerar vi synliga melanotiska pseudo-tumörbildning så tidigt som fem dagar efter injektion (dvs tre till fyra dagar efter uppkomst). Dessa data antyder att denna metod möjliggör initiering av genen knockdown under ett tidigare under studerade utvecklingsperiod (dvs pupal utveckling). Vår färgämnesmärkningsmetoden kan även visa sig vara användbar för utveckling av nya larvinjektionsprotokoll, på grund av den genomskinliga naturen av nagelband under alla larver instars. Medan kontrollen användes i denna studie kräver progression i vuxen skede för att visa en knockdown fenotyp, till framtida experiment bedöma puppstadium specifika fenotyper efter injektion av tidig puppor kommer att gevärdefulla insikter om utbyggnad av denna metod i ytterligare utvecklingsperioder som sen PUPP utveckling. Sammanfattningsvis ger denna metod en värdefull RNAi protokoll för puppstadium initiering av RNAi-medierad gen knockdown och expanderar de funktionella genomiska verktyg för användning i vektorn insekt forskarsamhället.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |