यहाँ हम HepG2 सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक सिंथेटिक लाइन -1 व्यक्त करने का गुणसूत्र फैलता में एकल नाभिक स्तर पर लाइन -1 retrotransposition ट्रैक करने के लिए मछली कार्यप्रणाली को रोजगार।
Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5′ truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.
मानव लांग बीच-बीच परमाणु तत्व-1 (लाइन -1 या एल 1) एक स्वायत्त मोबाइल तत्व है कि एक के माध्यम से जीनोम के भीतर प्रसारित "कॉपी और पेस्ट" retrotransposition तंत्र है। एक ठेठ मानव एल 1 ~ 6 KB लंबा है और एक 5'UTR (untranslated क्षेत्र) है कि एक प्रवर्तक के रूप में कार्य करता है के होते हैं, दो खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs): एल 1 और एल 1 -ORF1 -ORF2, और एक Pólya के साथ एक 3'UTR । एक तार-तार डोमेन, आरएनए मान्यता आकृति और सी टर्मिनल डोमेन, जबकि एल 1 -ORF2 प्रोटीन endonuclease है, ट्रांसक्रिप्टेज और सिस्टीन अमीर डोमेन 1,2,3,4,5 रिवर्स: एल 1 पूंछ -ORF1 प्रोटीन तीन अलग डोमेन है। एल 1 -ORF1 न्यूक्लिक एसिड निगरानी गतिविधियों को दर्शाती है, जबकि एल 1 -ORF2, enzymatic गतिविधियों प्रदान करता है retrotransposition 1,2,6 के लिए आवश्यक दोनों प्रोटीन के साथ।
एल 1 retrotransposition का एक चक्र एल 1 के 5'UTR से प्रतिलेखन के साथ शुरू होता है </उन्हें> शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, translocation कोशिका द्रव्य में, और अनुवाद के द्वारा bicistronic mRNA। कोशिका द्रव्य में, एल 1 -ORF1 दर्शाती है या तो सीआईएस -binding जहां यह अपने आप ही आरएनए संकुल या ट्रांस -binding जहां यह अन्य RNAs पैकेज (यानी, साइन / SVAs / pseudogenes) एल 1 -ORF2p 7 के साथ एक ribonucleoprotein कण (RNP) के रूप में, 8। RNPs नाभिक जहां एल 1 -ORF2p Nicks जीनोमिक डीएनए (gDNA) के endonuclease गतिविधि एक ओह को बेनकाब करने में सरकाना – समूह 9, कि प्रधानमंत्री को रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा इस्तेमाल के बदले में है और 3 'के अंत से डीएनए को synthesize आरएनए रिवर्स। रिवर्स संश्लेषण के दौरान, डीएनए का दूसरा किनारा कंपित टूट जाता है जो हस्ताक्षर एल 1 प्रविष्टि दृश्यों (जैसे, TTTTAA) नामक लक्ष्य साइट दोहराव (टीएसडी) 9,10 के लिए फार्म भर रहे हैं बनाने के लिए मूल निक साइट से 7-20 बीपी nicked है। इस प्रक्रिया के रूप में लक्ष्य प्रधानमंत्री रिवर्स प्रतिलेखन (TPRT) में जाना जाता है और inserti की ओर जाता हैTPRT-तरह गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के कुछ कोशिकाओं प्रकार 11 में डाला अनुक्रम के दोनों सिरों पर TSDs साथ एल 1 / अन्य DNAs का पूरा या छोटा प्रतियों की पर। एल 1 retrotransposition भी माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है।
एल 1 retrotransposition हमारे अध्ययन में कार्यरत वेक्टर गैर episomal है और टैग एल 1 -ORF1 और 2p संयुक्त सीएमवी L1-5'UTR प्रमोटरों द्वारा संचालित (चित्रा 1) 12 के होते हैं। इस निर्माण के पहले के संस्करणों खमीर और मानव सेल संस्कृतियों 13,14,15 का उपयोग अध्ययन में वर्णित किया गया है। दो अलग सीएमवी 5 'और 3' में स्थित प्रमोटरों, वेक्टर के समाप्त हो जाती है 3 'के अंत के साथ रिवर्स उन्मुखीकरण में रखा splicing और एकीकरण के बाद neomycin की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए। 3 'अंत में retrotransposition सूचक कैसेट एल 1 -ORFs करने के लिए एक neomycin जीन डाला antisense के होते हैं और एक ग्लोब द्वारा दो हिस्सों में जुदाई से निष्क्रिय प्रदान की गई हैspliced दाता (एसडी) और spliced स्वीकर्ता (एसए) साइटों (चित्रा 1) के साथ intron में। एक गुणसूत्र में एकीकरण पर, एल 1 आम प्रमोटर से लिखित है एक mRNA कि एक bicistronic mRNA और निष्क्रिय neomycin mRNA के होते हैं उपज है। आरएनए प्रसंस्करण के दौरान, ग्लोबिन Intron neomycin जीन से बाहर spliced है एक पूरी तरह कार्यात्मक neomycin जीन बहाल करने के लिए। संकर mRNA सीआईएस में एक RNP में पैक और नाभिक जहां यह TPRT का उपयोग कर सकते हैं या तो पूरी लंबाई या छोटा सम्मिलन के रूप में जीनोम में एकीकृत है में translocated है।
यहाँ हम एक पद्धति स्वस्थानी संकरण (मछली) जांच विशेष रूप से spliced neomycin जीन (SNeo) के निर्देश पर साथ में प्रतिदीप्ति का उपयोग करता है कि एक नाभिक स्तर पर एल 1 -retrotransposiition पैटर्न और सम्मिलन दरों को ट्रैक करने का वर्णन है। दक्षता और पता लगाने की विशिष्टता det को retrotransposition सक्षम और अक्षम निर्माणों और जांच का उपयोग कर पुष्टि की गईect SNeo या neomycin और Intron जंक्शन 16 ग्लोबिन। इस पद्धति में इस तरह के कई सम्मिलन, कॉलोनी प्रतिरोध और अनुकूल क्लोन विस्तार के रूप में सेल संस्कृति आधारित retrotransposition assays, की कमियों का एक कारण है।
इस तरह पूरे जीनोम अनुक्रमण, उलटा पीसीआर और दक्षिणी सोख्ता के रूप में के तरीके में एल 1 retrotransposition अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि इन तरीकों का पता लगाने के लिए जहां एल 1 सम्मिलन जीनोम क?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by grants from the National Institute of Environmental Health Sciences (ES014443 and ES017274) and AstraZeneca to KSR.
Labeling Probes | |||
Go Tag DNA polymerase | Promega | M3178 | |
GO Tag 10X colorless buffer | Promega | M3178 | |
Individual dNTP | Sigma | DNTP10 | Adjust the concentration of dATP, dGTP, dCTP to 2mM and dTTP to 1.5mM in nuclease free water. |
dUTP-16-Biotin (0.5mM) | Roche | 11093070910 | |
dUTP-FITC (0.5mM) | Thermo Scientific | R0101 | |
dUTP-CY3 (0.5mM) | Sigma | GEPA53022 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3625 | |
MIRUS FISH Labeling Kit | MIRUS | MIR3225 | |
NucleoSpin PCR Clean-Up kit | Qiagen | 1410/0030 | Any PCR clean reagent can be used in place of NucleoSpin PCR Clean Up Kit |
PCR Machine | Any Thermocycler machine can be used to amplify the label product. | ||
Agarose | Sigma | A9539 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Preparing chromosome Spreads. | |||
Colcemid | Life Technologies | 15212-012 | Add Colcemid directly to growth media to a final concentration of 0.4 µg/mL |
1M KCl | Sigma | P9541 | Dilute 1M KCl solution to 75 mM solution to make Hypotonic Solution |
Carnoy Fixative Solution | Mix 3 volumes of methanol and 1 volume of acetic acid to make Carnoy Fixative Solution. Make Fresh everytime. | ||
Methanol | Sigma | 322415 | |
Acetic acid | Sigma | 320099 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Diamond Point Marker | Thermo Scientific | 750 | |
Frosted Slides | Thermo Scientific | 2951-001 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | R001100 | To detech cells, incubate cell in Trypsin for 5 mins and inactive with equal volume of complete media |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Heat Block | Any heat block can be used for this purpose, though blocks fitted for heating slides are recommended. | ||
Beaker (600ml) | Sigma | CLS1003600 | Fill the beaker with water, heat to boil, use the hot steam to burst chromosomes. |
Nikon Microscope | Nikon | 125690 | Any microscope can be used to look at spread quality. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents and Materials for FISH | |||
Trisodium citrate | Sigma | S1804 | |
Sodium Chroride | Sigma | S3014 | |
Formamide | Sigma | F9037 | |
Tween-20 | Sigma | F1379 | |
Detran Sulfate | Sigma | D8906 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Salmon Sperm DNA | Life Technologies | 15632-011 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A8531 | |
HCl (N) | Sigma | 38283 | |
Ethyl Alcohol | Sigma | 459844 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | |
NaOH | Sigma | S8045 | |
Rnase A | Sigma | R4642 | |
Pepsin | Sigma | P6887 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
Hoechst-33342 | Thermo Scientific | 62249 | Dissolve Hoechst-33342 in PBS to final concentration of 1 mg/mL. |
Rubber Cement/Cytobond Sealant | 2020-00-1 | ||
Seven Coplin Jars | Thermo Scientific | 107 | |
Dark Humidified chamber | Sigma | CLS2551 | |
Cover slides | VWR | 48366067 | |
Dry Digital Heat Block | VWR | 13259 | |
Fluorescence Microscope | |||
20X Saline-Sodium Citrate (20X SSC) | Combine 175 g of NaCl, and 88.2 g of trisodium citrate with 800 mL of molecular grade H2O. Stir while adjusting to pH 7. Once the all salts dissolve, adjust the volume to 1 L and filter through 0.22 µm Filter paper. Store at 4 °C. | ||
1mg/mL of Rnase A | Dilute 20X SSC buffer to 2X SSC buffer. Dissolve RNase A in 2X SSC buffer to a final concentration of 1 mg/mL. Make fresh solution every time. | ||
1% Pepsin | Dissolve pepsin (W/V) in 10 mM HCl to a final concentration of 1 % solution. Make fresh every time. | ||
4% Paraformaldehyde (4% PFA) | Weigh 4.0 g of PFA in fume hood, add 50 mL of 1xPBS, heat to 60 °C while stirring and adjust the pH with drops of NaOH until all PFA dissolves and the solution becomes clear. Adjust the volume to 100 mL, filter through 0.22 µm Filter paper and store 5 mL aliquots at -20 °C. Thaw aliquot of PFA at 37 °C for 10-15 min for subsequent uses. Adjust filter size depending on amount of paraformaldehyde. | ||
Wash Buffer | Combine 100 mL of Formamide (20%) with 2.5 mL of 20X SSC, adjust to pH 7 with 1.0 M HCl and bring the volume to 500 mL with molecular grade H2O. | ||
Hybridization Buffer | Combine 50% formamide, 10% dextran sulfate, 0.1% SDS, and 300 ng/mL Salmon Sperm DNA in 2X SSC buffer. Amount of Formamide determine how focused chromatids are, titrate the amount | ||
Detection Buffer | Dilute 20X SSC buffer to 4X and add 0.2% Tween-20 to make detection buffer. | ||
Blocking Buffer | Combine 5% bovine serum albumin (BSA) with 0.2% Tween-20 in 4X SSC buffer. | ||
Dehydrating Solution | Make 70%, 80%, and 95% ethanol solutions. |