Abstract
La disfunción mitocondrial desempeña un papel significativo en el proceso de envejecimiento y en las enfermedades neurodegenerativas incluyendo varios degeneración espinocerebelosa hereditarios y otros trastornos del movimiento marcados por la degeneración progresiva del cerebelo. El objetivo de este protocolo es evaluar la disfunción mitocondrial en la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) y evaluar la eficacia de la orientación farmacológica de la respiración metabólica a través del ácido succínico compuesto soluble en agua para retardar la progresión de la enfermedad. Este enfoque es aplicable a otras enfermedades cerebelares y se puede adaptar a una serie de terapias solubles en agua.
Análisis ex vivo de la respiración mitocondrial se utiliza para detectar y cuantificar los cambios relacionados con la enfermedad en la función mitocondrial. Con la evidencia genética (datos no publicados) y la evidencia de proteómica de la disfunción mitocondrial en el modelo de ratón de SCA1, evaluamos la eficacia del tratamiento con la dosis de refuerzo metabólico s soluble en aguaácido uccinic disolviendo este compuesto directamente en el agua potable jaula. La capacidad del fármaco para pasar la barrera hematoencefálica puede deducirse usando la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La eficacia de estos compuestos puede ensayarse utilizando varios paradigmas de comportamiento entre ellos el rotarod de aceleración, prueba de barra de equilibrio y análisis de la huella. integridad cytoarchitectural del cerebelo se puede evaluar usando ensayos de inmunofluorescencia que detectan núcleos de las células de Purkinje y las dendritas de células de Purkinje y soma. Estos métodos son técnicas robustas para la determinación de la disfunción mitocondrial y la eficacia del tratamiento con los compuestos solubles en agua en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa.
Introduction
Las mitocondrias son los productores principales de trifosfato de adenosina (ATP), una coenzima esencial para la energía celular, con la mayoría de ATP mitocondrial producido a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) usando la cadena de transporte de electrones. El cerebro, dada su alta demanda metabólica y su dependencia de la fosforilación oxidativa para la alimentación de la actividad neuronal, es altamente susceptible a la disfunción mitocondrial. Como resultado, la disfunción mitocondrial se activa durante el proceso de envejecimiento 1 y está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas 2, 3, 4. Por lo tanto, se deduce que las mitocondrias son dianas terapéuticas atractivas para la neurodegeneración.
En este protocolo, hemos adoptado el uso de la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) como una enfermedad neurodegenerativa modelo para el estudio de las mitocondriasl disfunción y el desarrollo de terapias mitocondriales de orientación. SCA1 es causada por una mutación de poliglutamina (polyQ) expansión de repetición en el producto del gen ataxina-1 que desencadena la degeneración progresiva de las neuronas de Purkinje del cerebelo y neuronas de otras regiones del cerebro. La línea de ratón transgénico utilizado aquí (designado como el ratón SCA1), que expresa un polyQ-mutante ataxina-1 transgén bajo el control de un promotor específico de las células Purkinje, permite el análisis específico del componente de las células de Purkinje de SCA1 5. Los ratones con SCA1 sufren degeneración de las células de Purkinje gradual y desarrollan marcha atáxica 6.
La disfunción mitocondrial complejo y la eficacia del tratamiento mitocondrial de orientación pueden ser evaluados con una batería de ensayos moleculares y de comportamiento. La disfunción mitocondrial complejo se mide ex vivo mediante ensayos que detectan la respiración alterada consumo de oxígeno en el tejido del cerebelo enla presencia de sustratos de cadena de transporte de electrones y los inhibidores de 7. Ensayos de respiración se han utilizado previamente con el tejido permeabilized, los aislados mitocondriales, y todo el tejido 7, 8, 9. Permiten una evaluación directa de la función mitocondrial a diferencia de los métodos de recopilación de datos morfológicos como la microscopía electrónica de transmisión o la tinción de inmunofluorescencia. El uso de todo el tejido en lugar de mitocondrias aisladas evita sesgos en la selección de las mitocondrias sanas que pueden ocurrir durante el proceso de aislamiento 7. Cuando se adapta al protocolo como se muestra, el ensayo de respiración es un valioso método para la detección de la disfunción mitocondrial en enfermedades neurodegenerativas del cerebelo.
activadores no específicos del metabolismo pueden utilizarse para inferir la disfunción mitocondrial en modelos de ratones transgénicos de diseas neurodegenerativase y la ayuda en el desarrollo de nuevas terapias. La quercetina, la coenzima Q10 y la creatina han sido mostrado para mejorar la patología enfermedad neurodegenerativa en pacientes y en modelos animales de enfermedad neurodegenerativa 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Aquí presentamos un activador metabólico novela, ácido succínico, para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial en la enfermedad neurodegenerativa. Para asegurarse de que el activador está cruzando la barrera hematoencefálica, HPLC se empleó para detectar la entrega al tejido neural en ratones tratados 17.
Para evaluar los efectos terapéuticos de los compuestos solubles en agua metabólicamente específica tales como el ácido succínico, una batería de paradigmas de comportamiento y estudios inmunopatológicos se puede utilizar. due a los déficits de coordinación motora se encuentran en la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa, el ensayo pista huella, ensayo de haz y la aceleración de ensayo de barra giratoria se usa para detectar rescate de la patología conductual 6, 18, 19. Estas medidas se complementan con la evaluación de inmunopatológico citoarquitectura cerebelosa mediante la evaluación de espesor molecular capa (definida como Purkinje de células dendríticas longitud Arbor) y de Purkinje recuentos soma celular dentro de un lóbulo definido de tejido cerebelar 6, 20, 21. Aquí presentamos varios métodos neuropatológicos y de comportamiento para la detección y el tratamiento de la disfunción mitocondrial con compuestos solubles en agua metabólicamente objetivo.
Utilizamos el análisis ex vivo de la respiración mitocondrial para analizar la disfunción mitocondrial en el tran SCA1sgenic ratón. Además, se muestra que los síntomas de la enfermedad y la patología se mejoran por el ácido succínico refuerzo mitocondrial soluble en agua, implicando más que la disfunción mitocondrial en progresión de la enfermedad SCA1.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices del IACUC en Skidmore College para trabajar con ratones.
1. El tratamiento con compuestos solubles en agua
- Disolver ácido succínico a una concentración de 0,75 mg / mL en el agua potable jaula. Tenga en cuenta que cualquier compuesto soluble en agua de interés a la concentración deseada podría ser sustituido en esta etapa. Se agita la solución para asegurarse de que el compuesto se haya disuelto completamente.
- Después de ratones llegan a la edad de tratamiento deseado, sustituir el agua de bebida jaula hogar del grupo de condiciones de tratamiento con la solución en el paso 1.1.
- Medir el peso de las dos botellas de agua grupo de tratamiento y control diario para asegurar que tanto los ratones tratados y de control están bebiendo la misma cantidad de agua. Utilice estas medidas para calcular la dosis total de medicamentos por jaula. Continuar el tratamiento durante todo el peso de la botella experimento y el monitor.
2. Análisis de la Huella
- Coloque la pista de aterrizaje en el suelo ouna mesa en una habitación confinado. Ajuste la pista en un ligero ángulo hacia arriba hacia el cuadro de casa forrada con ropa de cama y la recompensa de los alimentos (por ejemplo, cereal azucarado). La línea de la longitud de la pista con una hoja de papel blanco. Deje que el sujeto se aclimate en el cuadro de casa durante 5 min.
- Retire el tema desde el cuadro de casa y pintar las patas traseras izquierda y derecha, respectivamente, con pintura a base de agua no tóxica azul y rojo. Las impresiones de pintura se utilizarán para calcular las mediciones de comportamiento de salida múltiple.
- Coloque el sujeto al principio de la pista de aterrizaje y permitir que el sujeto a caminar a la caja de casa. Una vez que el sujeto ha alcanzado el cuadro de casa, cerrar la puerta de la trampa, y permitir que el objeto de mantenerse dentro de la caja de la casa durante un minuto antes de volver a la jaula de alojamiento respectivo. Limpiar la caja del cauce y el hogar con un 30% de etanol y vuelva a colocar la ropa de cama, recompensa de comida, y el papel de pista para el siguiente tema.
- Cuantificar el número de zancadas, la anchura de la puerta, el ángulo de paso, y el número de vueltas tomadaspor sujeto de acuerdo con los métodos analíticos descritos anteriormente 6. Un ensayo huella de éxito se define como un mínimo de 5 huellas secuenciales en el que el sujeto está caminando hacia el área chica sin darse la vuelta o se detenga.
3. Análisis de la viga
- Preparar el aparato de haz de acuerdo con las especificaciones de barras transversales descritas anteriormente 6 con las vigas 6 siguientes: 1 = viga rectangular, ancho 28 mm; haz 2 = redondo, 28 mm de diámetro; haz 3 = rectangular, anchura 12 mm; haz 4 = redondo, 12 mm de diámetro; haz 5 = rectangular, ancho 6 mm; haz 6 = redondo, 6 mm de diámetro. En un extremo de la viga, establecer un cuadro de casa a oscuras con comida recompensa.
- Para entrenar a los sujetos en la viga, montar el aparato con la viga 3. Con cuidado, coloque el sujeto en el extremo de la viga opuesta a la caja de la casa, y permitir que el objeto de cruzar. Permitir que cada sujeto hasta tres ensayos de 2 min para lograr una carrera exitosa, Que se define como cruzar la viga y entrar en el cuadro de casa dentro de 2 min. En medio de ensayos, dejar que el resto sujeto en el cuadro de casa durante 2 min. En entre sujetos, limpiar la caja de la viga y casa con 30% de etanol y reemplazar la comida recompensa en preparación para el siguiente objeto.
- Repita el paso 3.2 una vez al día durante los próximos dos días que resulta en un total de 3 días de entrenamiento secuencial. El día de la prueba, el día 4, debe seguir secuencialmente los días de entrenamiento.
- Para poner a prueba los sujetos en el día 4, montar primero el aparato con la viga 1 y configurar el buzón de su casa como se describe en el paso 3.1. Colocar una cámara de vídeo en la parte delantera del aparato y compruebe que el aparato completo de la viga puede ser claramente capturado en video. Empezar a grabar y colocar el primer tema en la viga opuesta a la caja de la casa, lo que permite un máximo de 3 intentos de 2 min para completar con éxito un ensayo. En medio de ensayos, permitirá sujeto a descansar durante 2 minutos en el cuadro de casa.
- Poniendo a prueba sujetos en cada una de las seis vigas en orden numérico,permitiendo así al sujeto reposo durante 2 minutos en el cuadro de casa antes de comenzar la siguiente viga. Entre los sujetos, limpiar cada viga y el cuadro de casa con 30% de etanol y vuelva a colocar la comida recompensa en preparación para cada sujeto.
- Cinta de vídeo cada ensayo y registrar el número de ensayos con éxito por sujeto por haz de la siguiente manera: '1' indica que el sujeto ha tenido éxito en el primer ensayo, "2" indica el tema fue un éxito en el segundo ensayo, '3' indica el tema era éxito en la tercera y última prueba, y '4' indica que el sujeto no tuvo éxito en ninguno de los tres ensayos.
- Utilizar grabaciones de vídeo de footslips ensayos miden por goleadores que están cegados a las condiciones experimentales de la materia. Definir un footslip como la parte posterior del pie que está a la vista directa de la cámara de inmersión por debajo de una línea media teórica a través de la longitud de la viga. las puntuaciones medias de los múltiples footslip goleadores.
- Para analizar el número de sUccessful ensayos y número de datos footslips, calculan la media y el error estándar dentro de cada genotipo y experimental condición cohorte. Realizar un análisis de ANOVA de una vía y comparaciones múltiples post hoc para determinar si hay un efecto del tratamiento y el genotipo en el número de ensayos con éxito y número de footslips.
4. Acelerar rotarod
- Aclimatar sujetos a la sala de ensayo de 10 min antes del inicio del ensayo. Durante este período de aclimatación, preparar el aparato rotarod, limpieza cada carril del aparato con 30% de etanol.
- Abra el software de cilindro giratorio y establecer la configuración de comenzar a 4 rpm, configuración de aceleración de 5 min y ajustes de velocidad final a 40 rpm. Estos valores proporcionan una aceleración constante 4-40 rpm durante un período de 5 min. Los ratones pueden permanecer en el rotarod a 40 rpm durante 5 min más allá del periodo de aceleración para una longitud máxima de ejecución de 10 min.
- Después de la aclimatación, lugar o sujetosnto el rotarod en sus respectivos carriles, mientras que la varilla está girando a 4 rpm. Una vez que todos los sujetos están en sus respectivos carriles, comenzará el primer juicio. Registrar la latencia a caer usando el software del instrumento; un temporizador secundario se puede emplear como una copia de seguridad.
- Tras la finalización del ensayo, permitir que cada sujeto a descansar en sus respectivos depósitos de carril durante diez minutos antes de la siguiente prueba para evitar la fatiga.
- Repita los pasos 4.3 y 4.4 para un total de cuatro ensayos.
- Repetir los pasos 4.3 hasta 4.5 para un total de cuatro días consecutivos, el tratamiento durante todo el período de prueba de continuar. Al finalizar, cuantificar latencia para caer de la barra giratoria para cada ensayo por sujeto 6.
5. Extracción y fijación del cerebelo
- La eutanasia a los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono de acuerdo con las directrices del IACUC institucional. Lugar sujeto a la cámara de dióxido de carbono, y la liberación de dióxido de carbono en la cámara. Relojel animal en todo momento durante el paso de la eutanasia y no dejar desatendido el animal.
- Una vez que la respiración ha cesado y los sujetos no muestran la percepción del dolor por la presión restante de la pata trasera, eliminar objeto de la cámara y hacer una incisión en la línea media superior a través del tejido epitelial de la zona central del cráneo caudalmente a la base del cráneo a través del tejido epitelial.
- Usando tijeras de disección, corte del cráneo de la base en la médula espinal a través de la sutura sagital a la bregma. Cortar lateralmente a través de cada sutura coronal antes de tirar de los huesos frontal, parietal y interparietales utilizando pinzas romas.
- El uso de fórceps romos para romper el hueso lateral del cerebelo. El uso de fórceps para separar el cerebelo del colículo y el tronco cerebral y extruir del resto del tejido. Separar el cerebelo en los hemisferios izquierdo y derecho con fórceps.
- Colocar inmediatamente cerebelo derecho en nitrógeno líquido para ahorrar para HPLC analisis y cerebelli izquierda en pre-refrigerada 4% de paraformaldehído (PFA) para la fijación del tejido. Cosecha de cualquier otro tejido de interés antes de cortar la aorta y descartando la carcasa de acuerdo con las reglas del IACUC institucional.
PRECAUCIÓN: PFA es un altamente tóxicos, inflamables y corrosivos. - Veinticuatro horas después de la extracción, lavar tejido fijado en PFA (4% en PBS) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tres veces, 5 min / lavado) antes de colocar el tejido en 30% de sacarosa a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
6. Ensayo de Inmunopatología
- Conecte el tubo de un microtomo trineo a un grifo de lavabo y una caja de control de la temperatura. Utilice el cuadro de control de temperatura para enfriar la fase microtomo a -25 ° C. Ajuste el disco de espesor de corte de 50 micras.
NOTA: Si el dial en el microtomo trineo no llega a 50 micras, ajuste el dial a un ajuste más fino y multiplicar el espesor cambiando la configuración en consecuencia (por ejemplo, establecer el dIal a 10 micras y cambiar cinco veces antes de seccionamiento para un espesor total de 50 micras). - Frote una porción tamaño de una moneda de solución temperatura óptima de corte (OTC) en el escenario. Antes de la OTC se congela, el uso de fórceps para posicionar el hemisferio de manera que la superficie de corte sagital medio está boca abajo sobre la capa de OTC. Trabajando rápidamente, orientar suavemente el tejido con pinzas para que la punta lateral del hemisferio se apunta hacia la cuchilla, superior a los escenarios. Deje que la OTC se congele por completo.
- Trabajando en capas, añadir OTC adicional alrededor del tejido que permite la OTC para congelar completamente antes de añadir la siguiente capa. Añadir una capa delgada de OTC en la parte superior del tejido y la congelación.
- Sección del tejido, la distribución de peso igual cuerpo sobre la cuchilla de corte, mientras que el corte. Recoger las secciones usando un pincel fino artista y el lugar en una placa de pocillos debidamente etiquetados que contiene 1x PBS. Entre las secciones, re-establecer el grosor de corte en eltrineo de línea microtomo, si es necesario, a 50 m.
- Vuelva a colocar la PBS en cada pocillo de la placa de pocillos con solución de urea [0,01 M de urea en PBS] y coloque la placa en hielo. Cuando esté listo, retire la placa de secciones de hielo y hervir en una solución de urea tres veces durante 15 s cada vez desenmascarar los epítopos de inmunomarcación. Este paso se puede lograr fácilmente mediante la colocación de la placa en un bloque de calentamiento fijado a la temperatura de ebullición. Entre cada etapa de ebullición, enfriar la placa que contiene las secciones de tejido en el hielo.
NOTA: Si la realización de la urea, el bloqueo, el anticuerpo primario, anticuerpo secundario y DAPI pasos en una placa de 96 pocillos, usar volúmenes de 100 mu l a lo largo. Si se utiliza un bien de tamaño diferente, ajustar los volúmenes de reactivos en consecuencia. En lugar de un bloque de calentamiento, un horno de microondas se puede utilizar para hervir las muestras de tejido en la urea. muestras de microondas en un escenario de tres intervalos de 15 s de alta potencia. - ebullición Post, lavar secciones tres veces, cada vez la eliminación de la solución presente, en sustitución de la solucióncon 1x PBS y agitando durante 10 min.
- secciones de bloque con solución de suero de burro (3% de suero normal de burro, 0,3% de Triton X-100 en PBS) por incubación del tejido en el suero durante una hora con agitación suave a temperatura ambiente. Eliminar la solución de suero de burro.
- Secciones de etiquetas con 0,2 mg / ml anti-calbindina y 1: 2.000 contra la ataxina-1 anticuerpo (11NQ) 16 en solución de suero de burro y se incuba a 4 ° C durante 72 h con agitación suave.
- Lavar secciones con PBS como en el paso 6.5 antes de incubar las secciones en anticuerpo secundario apropiado (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-cabra y 1: anticuerpos 500 Alexa Fluor-594-anti-conejo diluido en solución de suero de burro), a 4 ° C durante 48 h con agitación suave.
- Lavar secciones tres veces con PBS como en el paso 6.5 antes de núcleos de células etiquetado con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) solución diluida a una concentración final de 0,5 mg / ml en PBS. DAPI de incubación no debe exceder de diez minutos. Retire SOLUTIOn y lavar con PBS como en el paso 6.5.
- tejido gancho de montaje en un 2% de gelatina revestida de diapositivas con medio de montaje para reducir photobleaching. Cubreobjetos y sellar con esmalte de uñas.
- Con un microscopio confocal de barrido localizar el surco primario del cerebelo bajo la luz de campo claro. Con un objetivo de 10X UIS2, escanear y excitar secuencialmente DAPI, AlexaFluor-488 y AlexaFluor-594 canales utilizando un láser de 405 nm de diodo, un láser de gas argón 488 nm y un láser de diodo de 559 nm, respectivamente, en conjunción con un DM488 / 559 nm divisor de haz dicroico. Separar y recoger la luz emitida usando SDM490 y SDM560 divisores de haz y un filtro de paso de banda BA575-675, respectivamente.
- Para cada canal, construir una pila Z dentro del surco primario con z = 20 micras y 0,1 micras paso =. Utilice el software de post-procesamiento proporcionada con el microscopio confocal para añadir en un marcador de tamaño de la imagen final.
NOTA: los láseres alternativos, filtros y fluoróforos pueden ser sustituidos basan en DISPONIBILTy. Si AlexaFluor-488 o AlexaFluor-594 de detección es débil, un fosfuro de galio (GaAsP) detector de alta sensibilidad se puede emplear para aumentar la señal si está disponible.
- Para cada canal, construir una pila Z dentro del surco primario con z = 20 micras y 0,1 micras paso =. Utilice el software de post-procesamiento proporcionada con el microscopio confocal para añadir en un marcador de tamaño de la imagen final.
7. Cuantificación de capa molecular espesor y números de la célula de Purkinje
- El uso de ImageJ, abrir una imagen z-pila de surco primario de colores y dividir cada imagen en sus canales rojo, azul y verde mediante la selección de "imagen" de la barra de menús, 'Color' de la pestaña de imagen y Canales divididos 'del color lengüeta.
- Crear una proyección Z máxima de cada canal que se dividió. Cuando la imagen canal de interés está abierto, seleccione "Imagen" de la barra de menús, "secciones" de la ficha Imagen y 'Z-proyecto "en la pestaña" secciones ". Dentro del menú "Proyecto-Z 'del sistema, seleccione' Max Z proyección 'y haga clic en' OK '. Repita este procedimiento para cada canal.
- Abra el complemento contador de células mediante la selección de 'plugins' de The Barra de menús, "Analizar" en la pestaña Plug-ins y "Cell Counter" de la ficha Analizar.
NOTA: ImageJ y el plugin de ImageJ contador de células se pueden descargar en los sitios web proporcionados en la Tabla de materiales y equipos. - Cuantificar el número de células de Purkinje contando núcleos ataxina 1 marcado que se encuentran a lo largo de un tramo de 200 micras predeterminado de longitudes anterior y posterior de la fisura primaria. Usa el mapa umbral seleccionando "Imagen" de la barra de menús, 'Ajuste' de la pestaña de imagen y "umbral" de la ficha Ajustar para hacer un mapa umbral del canal de interés (rojo en el caso de los núcleos ataxina-1 etiquetada ).
- Elija una gama de píxeles que se pueden normalizar a lo largo de la cuantificación (31-225 píxeles, por ejemplo). Desechar el ruido de las imágenes, marcando la casilla "Fondo Oscuro" en la ventana de umbral. Señal de la imagen se puede invertir para la facilidad de contar.
- Cuantificar thic capa molecularKness en el canal verde utilizando los canales divididos '' y la herramienta de 'Umbral Mapa' que en los pasos 7.1 y 7.2. Usando el marcador de tamaño en cada imagen como una guía, medir al azar tres longitudes capa molecular dentro de cada uno de dos designado 200 micras tramos cada imagen fisura primaria de. Hacer mediciones desde el extremo proximal del árbol dendrítico Purkinje en la base de la soma Purkinje al extremo distal del árbol dendrítico Purkinje.
- Registro de Purkinje recuentos de células y espesor de la capa molecular como medios más o menos el error estándar. Realizar ANOVA de una vía con comparaciones múltiples análisis post-hoc para probar el efecto de las condiciones de tratamiento o genotipo en el número de células y la longitud de la árbol dendrítico.
8. Análisis por HPLC de cerebelosa succínico concentraciones de ácido post-tratamiento
- Preparación de la muestra para el análisis
- Pesar cada hemisferio cerebeloso derecho recolectadas antesutilizar en el análisis de HPLC. Picar mitades hemisféricas de una en una en un homogeneizador Dounce enfriado previamente y añadir 0,5 ml de 75:25 (en volumen) de agua: solución de metanol a cada medio homogeneizada 17.
- El uso de un homogeneizador previamente enfriado estrecha, groseramente romper el tejido con 5 golpes Dounce. Continuar finamente pelos en cada muestra de tejido con un homogeneizador más amplio, aplicando 20 golpes Dounce.
- La transferencia de los homogeneizados de comprobar la validez de tubo de microcentrífuga refrigerada. Después de cada muestra, aclare el homogeneizador con 0,5 ml de agua enfriada con hielo: solución de metanol y añadir el enjuague al tubo de microcentrífuga.
- muestras de homogeneizado centrifugar a 1.300 xg durante 30 minutos a 25 ° C y recoger el sobrenadante en un tubo de microcentrífuga limpio.
- Se filtra el sobrenadante a través de una unidad de filtro centrífugo alojados con un filtro de celulosa regenerada de 10 kilodaltons (kDa) límite de peso molecular nominal. Si no se ejecuta inmediatamente el análisis por HPLC, almacenar filtra las muestras a -80 °DO.
- HPLC Instrumentación y Condiciones
- Adjuntar una columna de cromatografía de exclusión iónica con una longitud de al menos 30 cm y un tamaño de partícula de 7 micras a un cromatógrafo de líquidos de alta resolución.
- Preparar y desgasificar una cantidad suficiente de tampón de acetato de 1 mM ajustado a un pH de 5.
- Ajuste el HPLC con una velocidad de fase móvil de 0,8 ml / min. Si se utiliza un detector UV-vis, seleccionar un detector de longitud de onda de 224 nm. tiempos de elución típicas de ácido succínico en estas condiciones son entre 10 y 12 min.
- Ejecución y análisis de patrones y muestras
- Preparar un conjunto de normas en fase móvil de tampón de acetato con concentraciones de ácido succínico entre 0 y 250 ppm.
- Ejecutar cada estándar y preparar una curva de calibración utilizando el área del pico medida a partir de cada ejecución.
- Una vez que se obtiene una curva estándar precisa, ejecute muestras preparadas previamente diluido en tampón de acetato.Para una mayor exactitud de la medición, las muestras pueden ser sobrecargadas con concentraciones conocidas de ácido succínico que se han diluido en la fase móvil. Ejecutar todas las muestras por triplicado.
- Analizar cromatogramas de HPLC para determinar la concentración de ácido succínico de las muestras mediante el uso de la curva de calibración y multiplicando por el volumen de la muestra y dividiendo por la masa original de la muestra.
9. Análisis Ex Vivo de cerebelosa mitocondrial Funcionalidad El uso de una unidad de control de electrodo de oxígeno
- Crear un electrodo de tipo Clark usando un sistema disponible en el mercado mediante la aplicación primero una gota de cloruro de potasio (50% de KCl / v w) solución en el cátodo de platino, el corte de una pieza de tabaco comercial 1,5 cm 2 hojas de enrollar y colocar suavemente el papel sobre el cátodo de platino.
- Cubrir el cátodo y el ánodo que rodea con una pieza de papel de politetrafluoroetileno (PTFE) 2,5 cm 2 y cómodamente asegurar tanto membRanes con juntas tóricas, asegurándose de que no haya pliegues o burbujas dentro de las membranas. Goteo solución de KCl 50% en los alrededores también.
- Fije el electrodo preparado de antemano en la cámara de ensayo y llenar con agua saturada de aire. Calentar la cámara a 30 ° C, añadir un 0,8 cm barra de agitación a la solución y se agita a 70 rpm usando el software del instrumento. Calibrar la cámara mediante el establecimiento de oxígeno cero. Para ello, en serie agregar algunos cristales de la ditionito de sodio agente reductor a la solución.
- Una vez que se consigue la calibración, se lava la cámara de una vez con 70% de etanol, y luego lavar seis veces con agua desionizada antes de permitir que la cámara se adapte en 1,5 ml de tampón de respiración (5 mM MgCl 2, KCl 60 mM, manitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
NOTA: todos los rastros de ditionito de sodio debe ser eliminado completamente durante las etapas de lavado antes de intentar medirlas concentraciones de oxígeno durante los experimentos de respiración.
- Una vez que se consigue la calibración, se lava la cámara de una vez con 70% de etanol, y luego lavar seis veces con agua desionizada antes de permitir que la cámara se adapte en 1,5 ml de tampón de respiración (5 mM MgCl 2, KCl 60 mM, manitol 100 mM, 10 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM Na 2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
- homogeneizar suavemente los hemisferios cerebelosos pesó 0,5 ml de tampón de homogeneizado (0,25 M de sacarosa, EDTA 0,5 mM, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Transferencia homogeneizado a un tubo de microcentrífuga limpio 1,5 ml y mantener refrigerado hasta que comienza el ensayo.
- Añadir el homogeneizado a la cámara, alcanzando un volumen final de 2 ml. Permeabilizar el homogeneizado cerebelosa mediante la adición de 40 l de digitonina o saponina (5 mg / ml); permitir que el tejido se homogeneiza a incubar durante 10 min.
NOTA: La digitonina y saponina son tóxicos, y los tiempos de incubación deben mantenerse al mínimo. - Para empezar a grabar el consumo de oxígeno, determinar la función mitocondrial a través de la activación y la inhibición de la fosforilación oxidativa de la cadena usando sustratos e inhibidores, respectivamente (3 grabaciones min por sustrato).
- Añadir sustratos utilizando jeringas limpias de la siguiente manera: 10 l 2 M de glutamato [concentración final (fc) 0,01 M],5 l 0,8 M malato [fc 2 mM], 20 l de 0,5 M de adenosina difosfato (ADP) [fc 5 mM], 1 l 1 mM rotenona [fc 0,5 M], 20 l 1 M de ácido succínico [10 mM], 1 l 5 mM antimicina A [fc 2,5 M], 1 l 0,8 M ascorbato [fc 0,4 mM], y 5 l M tetrametil-p-fenilendiamina 0,2 (TMPD). [Fc 0,5 mM] Cuando la adición de sustratos a la cámara tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el sistema.
NOTA: La información detallada sobre el efecto funcional inducida por cada sustrato y el inhibidor se describe en un protocolo previamente publicado 7. curvas de dosis-respuesta individuales pueden necesitar ser producido para determinar las concentraciones óptimas de los sustratos e inhibidores en las preparaciones / tejidos / especies no estudiadas con anterioridad. Del mismo modo, el protocolo se puede optimizar para las tendencias innatos del metabolismo de los tejidos / las especies que están siendo estudiados, tales como las preferencias de sustrato.
- Añadir sustratos utilizando jeringas limpias de la siguiente manera: 10 l 2 M de glutamato [concentración final (fc) 0,01 M],5 l 0,8 M malato [fc 2 mM], 20 l de 0,5 M de adenosina difosfato (ADP) [fc 5 mM], 1 l 1 mM rotenona [fc 0,5 M], 20 l 1 M de ácido succínico [10 mM], 1 l 5 mM antimicina A [fc 2,5 M], 1 l 0,8 M ascorbato [fc 0,4 mM], y 5 l M tetrametil-p-fenilendiamina 0,2 (TMPD). [Fc 0,5 mM] Cuando la adición de sustratos a la cámara tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en el sistema.
- Una vez que se ha completado la recolección de datos, suavemente unaespirar los homogeneizados del cerebelo y limpiar la cámara con etanol y agua desionizada. , muestras de homogeneizado de cerebelo adicionales Una vez limpias se pueden ejecutar sin calibración adicional durante el tiempo que la membrana de PTFE se mantiene intacta. Después de la terminación final, limpie el electrodo con agua desionizada y etanol y tienda con gel de sílice o desecante.
NOTA: Entre el mismo día se ejecuta, llenar la cámara con agua desionizada asegurar que la membrana no se seque. - El uso de la hoja de datos creado por el software del instrumento, la exportación de 40 min de los datos a partir de respiración dos minutos después de la adición del sustrato a un programa de hoja de cálculo.
- Calcular la tasa de respiración por sustrato o inhibidor. Normalizar los datos dividiendo la respiración total por la tasa de respiración durante la adición de sustrato ascorbato-DPMT.
NOTA: La tasa de respiración puede ser normalizada más para el contenido de proteína del tejido que puede ser particularmente deseable en los experimentos de neurodegeneraciónen la que el contenido de tejido puede variar. Para ello, reservar 50 l de la muestra de homogeneizado (del paso 9.3) para su uso en un ensayo de la proteína estándar.
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Representative Results
A través de la orientación farmacológica de las mitocondrias cerebelosa con ácido succínico somos capaces de prevenir la disfunción mitocondrial en un modelo de ratón de la enfermedad neurodegenerativa SCA1 cerebelosa. El donador de electrones canónica de la succinato deshidrogenasa, ácido succínico, se disolvió en jaula de agua potable de los ratones con SCA1 durante un mes, con el comienzo evaluación de comportamiento durante la segunda semana de tratamiento y evaluación neuropatológico después del tratamiento (Figura 1A). Tratamiento con ácido succínico 22 mejora el rendimiento de los ratones SCA1, medido por el ensayo de la huella, ensayo de haz y la aceleración de ensayo rotarod. Las mejoras de comportamiento detectados indica un mejoramiento de la coordinación motora y el aprendizaje motor (Figura 1B-D).
Rescate de rendimiento de comportamiento se encontró en concierto con una preservación de la ceraBellar tejido (Figura 2). tratamiento con ácido succínico conserva significativamente cuerpos de las células de Purkinje y el aumento de espesor de la capa molecular (indicativo de extensión árbol dendrítico de células de Purkinje) en el surco primario del cerebelo en ratones con SCA1 tratados en comparación con los ratones no tratados SCA1. Células de Purkinje la longitud dendrítica y el conteo de cuerpos de células de Purkinje proporcionan fuertes medidas de citoarquitectura cerebelosa global a los 5.
HPLC se realizó en el tejido del cerebelo de ratones tratados para verificar que el ácido succínico disuelto en el agua de bebida jaula cruzó con éxito la barrera hematoencefálica y el tejido del cerebelo penetrado. Una curva de respuesta a la dosis variando la duración del tratamiento más apoya el tratamiento ad libitum de ácido succínico como una forma viable de alcanzar el tejido del cerebelo (Figuras 3A-B). Nuestros experimentos de respiración están en curso y los resultados serán publicados en una investigaciónmanuscrito. Aquí nos muestran que podemos registrar con éxito el ritmo de la respiración a través de complejos fosforilación oxidativa del cerebelo tras la adición de diferentes sustratos cadena de transporte de electrones y los inhibidores (Figura 3C). En última instancia, vamos a utilizar el ensayo de respiración para mostrar déficits de fosforilación oxidativa en SCA1 cerebelo de ratón y la reversión de los déficits por tratamiento con ácido succínico.
Figura 1: Esquema de tratamiento y los datos representativos de la Huella de ensayo, ensayo de la viga y aceleración de Rotarod. (A) succínico ácido se disolvió en jaula agua de bebida de los ratones SCA1 durante cuatro semanas a partir de las 17 semanas de edad. ratones SCA1 comienzan a mostrar el fenotipo ataxia a las 5 semanas de edad. No representado en el esquema son tres cohortes de control: los ratones de tipo salvaje tratados con ácido succínico, VElos ratones de tipo salvaje y ratones con SCA1 tratados con vehículo hículo tratados. Las evaluaciones del comportamiento se llevaron a cabo durante el periodo de tratamiento de la siguiente manera: ensayo de la huella en la semana 17, ensayo de la viga en la semana 18 y la aceleración de cilindro giratorio en la semana 19. A las 20 semanas de edad, los ratones fueron sacrificados y se recogió el tejido del cerebelo para los ensayos de inmunopatología, ensayos de HPLC y ensayos de respiración. (B) Los datos representativos del ensayo de la huella que muestran un modo de andar tratado con vehículo de tipo salvaje (arriba), tratado con vehículo SCA1 la marcha (medio) y un modo de andar SCA1 tratado con ácido succínico (parte inferior). Los datos del análisis (C) de la viga mostrando mejora en el rendimiento del haz (medido como número de ensayos para una carrera exitosa) de ratones con SCA1 tratamiento con ácido succínico. (* P <0,05). (D) tratamiento con ácido succínico mejora significativamente la aceleración del rendimiento cilindro giratorio de SCA1 22 ratones como se muestra por el aumento de la latencia a caer (* p <0,05). Las barras de error en CD rereflexionar el error estándar de la media. Importancia se determinó mediante ANOVA de una vía y comparaciones múltiples análisis post-hoc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: los datos representativos de los Condes de células de Purkinje y capa molecular de espesor de Inmunopatología ensayos. (A) Los resultados representativos del ensayo de recuento de células de Purkinje que muestran un control tratado con vehículo transgénico cerebelosa fisura principal (superior), SCA1 cerebelosa surco primario tratado con vehículo (medio) y un SCA1 fisura primaria cerebelosa tratado con ácido succínico (parte inferior) se tiñeron para núcleos ATXN1-positivos (rojo) y de contraste con DAPI (azul). Las líneas blancas representan las 200 micras regiones de tejidodesignado para el recuento de células. Para este análisis particular, un ratón transgénico de control se utiliza en lugar de un ratón de tipo salvaje que sobreexpresan un gen ATXN1 no patógeno bajo el control de un promotor de Purkinje célula-específica debido a que las características de control transgénicos fácilmente niveles detectables de nuclear Purkinje ATXN1 y el ratón de tipo salvaje no. El ratón transgénico de control no muestra un fenotipo atáxica o la neurodegeneración cerebelosa. (B) Los resultados representativos del ensayo de espesor de la capa molecular que muestran una fisura tratado con vehículo de tipo salvaje cerebelosa principal (superior), SCA1 cerebelosa surco primario tratado con vehículo (medio) y un SCA1 fisura cerebelosa tratado con ácido succínico primaria (parte inferior) se tiñeron para calbindina , un marcador de las células de Purkinje (blanco). Dos de las tres capas de células del cerebelo pueden ser visualizados con calbindina. La capa media de células de Purkinje (que consiste en los cuerpos celulares de Purkinje) es visible a lo largo de la capa molecular externa (que consta de Purkinje cedendritas ll). La capa molecular aparece en el medio de la fisura primaria debido a los pliegues naturales de los tejidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los resultados representativos de la HPLC y ensayos respiración. (A) curva estándar de concentraciones conocidas hasta ácido succínico 250 ppm diluido en tampón de acetato y se representó frente al área bajo el pico de HPLC medido. La ecuación de la línea se utilizó para calcular las concentraciones de ácido succínico desconocidas de muestras de tejido tratadas. (B) de respuesta a dosis de ácido succínico picos representativos de tejido del cerebelo de ratón siguientes diferentes tiempos de tratamiento (ya sea 0, 1 o 5 semanas). Bajo las condicionesdescrito, ácido succínico típicamente eluye entre 10 y 12 min. (C) de ejecución de respiración Representante del tejido cerebelosa tratado con vehículo de tipo salvaje del ratón. La línea azul representa el cambio en la concentración de oxígeno, la línea roja punteada representa el cambio en la tasa de respiración y la línea roja sólida representa una versión suavizada de la línea de puntos. D = adición de digitonina, G / M = adición de glutamato / malato, A = adición de ADP, R = adición de rotenona, S = adición de ácido succínico, AA = adición de antimicina A y A / T = adición de Asc / DPMT. Todos los sustratos se añadieron en los tiempos representados en la figura y en las concentraciones descritas en el protocolo (paso 9.5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si se utilizan estos métodos como se describe, que son capaces de detectar y mitigar la disfunción mitocondrial fosforilación mediada oxidativo en modelos de ratones enfermedad neurodegenerativa cerebelosos. Los ensayos bioquímicos y de comportamiento combinados son métodos multifacéticos para determinar el grado de contribución a la patología mitocondrial enfermedad neurodegenerativa cerebelosa. Al tratar a los ratones con ácido succínico para estimular el metabolismo y estimular la función mitocondrial, que son capaces de mostrar un rescate de los déficits conductuales cerebelosa y degeneración cerebelosa.
La metodología que se presenta aquí se puede utilizar para probar una amplia variedad de compuestos metabólicamente dirigidos solubles en agua para el tratamiento potencial de la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa. El ácido succínico es fácilmente soluble en agua a 0,75 mg / ml, lo que permite la administración fácil con agua potable jaula y no requiere la creación de bolitas de comida suplementados. Otros soluble en aguacompuestos pueden ser fácilmente sustituido en el protocolo. Si el uso de compuestos metabólicamente específicas que no son solubles en agua, nuestra metodología se puede adaptar fácilmente para el tratamiento con bolitas de comida suplementados 11, 12. Al probar un nuevo compuesto, es fundamental para verificar la penetración del cerebelo del medicamento antes de comenzar el tratamiento mediante análisis de HPLC u otro método de detección adecuado.
La batería de evaluaciones patológicas fue elegido debido a su eficacia reportada en la detección de patologías neurodegenerativas del cerebelo. Las evaluaciones de ensayo de la huella, ensayo de haz y el ensayo rotarod son ampliamente utilizados de la enfermedad neurodegenerativa cerebelosa incluyendo varios SCAs y Friedreich ataxia de 6, 23, 24. Estas evaluaciones conductuales particulares se correlacionan fuertemente con la degeneración del cerebelo. Sin embargo, otra behavioral paradigmas pueden ser sustituidos o añadirse según sea necesario.
El etiquetado de las células de Purkinje en ratones SCA1 con ataxina-1 y calbindina es ampliamente utilizado para detectar la degeneración cerebelosa en modelos SCA1 5, 20, 21. Otros anticuerpos neuronal selectiva y regiones de tejido se puede utilizar para visualizar la mitigación de la neurodegeneración, según sea necesario.
análisis de la respiración es una poderosa herramienta para la detección específica de la disfunción o la reparación dentro de los complejos mitocondriales individuales de tejido cerebeloso. Se debe tener cuidado para reducir al mínimo el tiempo entre la recolección de tejido y realizar el ensayo para obtener resultados reproducibles. Además, es importante tener en cuenta la homogeneidad del tejido que está siendo analizada. Específicamente, el tejido del cerebelo consiste mayoritariamente de neuronas granulares que no expresan el transgén SCA1 en nuestro modelo. Por lo tanto, un paso crítico de estaprotocolo es determinar si toda la respiración cerebelosa es un método viable para la detección de la función compleja oxidativo. cambios en la respiración en la SCA1 transgénico cerebelo de ratón pueden ser sutiles y pueden requerir un mayor número de sujetos para lograr resultados estadísticamente significativos.
La combinación de métodos de comportamiento y neuropatológicas que se detallan en este protocolo proporcionar distinta cuantificación de la enfermedad SCA1 y puede detectar robustamente mejora tras el tratamiento con compuestos solubles en agua. La importancia de este protocolo es en su amplia adaptabilidad a diversos tratamientos y un conjunto diverso de modelos de ratón. Por otra parte, muchas de las técnicas utilizadas en este protocolo no requieren equipos costosos o técnicas complicadas y por lo tanto son adecuados para un entorno de investigación de pregrado. Las aplicaciones futuras de este protocolo se utilizarán para evaluar el grado de eficacia del tratamiento de la edad que dependen de la administración del compuesto.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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