Abstract
Mitochondriale dysfunctie speelt een belangrijke rol bij het verouderingsproces en neurodegeneratieve ziekten waaronder verscheidene erfelijke Spinocerebellaire Ataxie en andere bewegingsstoornissen gekenmerkt door progressieve degeneratie van het cerebellum. Het doel van dit protocol is het mitochondriale dysfunctie spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) evalueren en de effectiviteit van farmacologische doelwit metabole ademhaling evalueren via de in water oplosbare verbinding barnsteenzuur progressie van de ziekte vertragen. Deze benadering geldt voor andere cerebellum ziekten en kan worden aangepast aan een groot aantal in water oplosbare therapieën.
Ex vivo analyse van mitochondriale respiratie wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van ziekte gerelateerde veranderingen in mitochondriale functie. Genetische bewijs (ongepubliceerde gegevens) en proteomics bewijs van mitochondriale dysfunctie bij SCA1 muismodel, evalueren we het effect van behandeling met de in water oplosbare metabole booster succinic zuur door het oplossen van deze verbinding direct in de kooi drinkwater. Het vermogen van het geneesmiddel om de bloed-hersenbarrière passeert af te leiden met behulp van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC). De werkzaamheid van deze verbindingen kunnen vervolgens worden getest met meerdere gedragsparadigma's waaronder de versnellende rotarod, balk footprint testen en analyse. Cytoarchitectural integriteit van de kleine hersenen kan worden bepaald met behulp van immunofluorescentie assays dat Purkinjecel kernen en Purkinjecel dendrieten en soma te sporen. Deze methoden zijn robuust technieken voor het bepalen van mitochondriale dysfunctie en de werkzaamheid van de behandeling met in water oplosbare verbindingen in cerebellaire neurodegeneratieve ziekte.
Introduction
Mitochondriën zijn de belangrijkste producenten van adenosine trifosfaat (ATP), een co-enzym essentieel voor cellulaire energie, waarbij het merendeel van mitochondriale ATP geproduceerd door middel van oxidatieve fosforylering (OXPHOS) met de elektronen transportketen. De hersenen, gezien de hoge metabole eisen en de afhankelijkheid van oxidatieve fosforylering voor het voeden van neurale activiteit, is zeer gevoelig voor mitochondriale dysfunctie. Hierdoor wordt mitochondriale dysfunctie geactiveerd tijdens het verouderingsproces 1 en is betrokken bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten 2, 3, 4. Hieruit volgt dat mitochondria aantrekkelijke therapeutische doelwitten voor neurodegeneratie.
In dit protocol, hebben wij het gebruik van spinocerebellaire ataxie type 1 (SCA1) als model neurodegeneratieve ziekte vastgesteld voor de studie van mitochondrial dysfunctie en de ontwikkeling van mitochondriale gerichte therapieën. SCA1 wordt veroorzaakt door polyglutamine (polyQ) repeat expansie mutatie in het ataxine-1 genproduct dat de geleidelijke degeneratie van Purkinje neuronen van het cerebellum en neuronen van andere hersengebieden activeert. De transgene muis lijn hier gebruikt (aangeduid als SCA1 muis), die een polyQ-mutant ataxine-1 transgen onder de controle van een Purkinje-celspecifieke promoter tot expressie brengt, maakt de doelgerichte analyse van de Purkinje-cellen component van SCA1 5. SCA1 muizen ondergaan geleidelijke Purkinjecel degeneratie en ontwikkelen ataxic gang 6.
Mitochondriale dysfunctie complex en mitochondriale gerichte behandeling werkzaamheid kan worden geëvalueerd door een batterij van moleculaire en gedrags-assays. Mitochondriële complex dysfunctie wordt gemeten ex vivo door ademhaling testen die veranderde zuurstofverbruik binnen cerebellum weefsel in te detecterende aanwezigheid van elektronen transportketen substraten en remmers 7. Ademhaling assays zijn eerder gebruikt gepermeabiliseerde weefsel, mitochondrial isolaten en gehele weefsel 7, 8, 9. Zij zorgen voor directe beoordeling van de mitochondriale functie in tegenstelling tot morfologische dataverzameling methoden zoals transmissie-elektronenmicroscopie of immunofluorescentiekleuring. Het gebruik van hele weefsels dan geïsoleerde mitochondria voorkomt vooringenomen selectie van gezonde mitochondriën die kunnen optreden tijdens de isolatiewerkwijze 7. Na aanpassing aan het protocol zoals de ademhaling assay is een waardevolle werkwijze voor het detecteren mitochondriale dysfunctie in cerebellaire neurodegeneratieve ziekten.
Niet-specifieke activatoren van metabolisme kan worden gebruikt om mitochondriale dysfunctie afleiden in transgene muizen modellen van neurodegeneratieve disease en hulp bij de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Quercetine, co-enzym Q10 en creatine zijn allemaal aangetoond neurodegeneratieve pathologie verbeteren bij patiënten en in diermodellen voor neurodegeneratieve ziekten 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Hier presenteren we een nieuwe metabole activator, barnsteenzuur, het metabolisme stimuleren en mitochondriale neurodegeneratieve ziekte. Opdat de activator is de bloed-hersenbarrière, HPLC werd toegepast voor levering aan neuraal weefsel te detecteren in 17 behandelde muizen.
Om de therapeutische effecten van metabolisch gerichte water oplosbare verbindingen zoals barnsteenzuur evalueren, kan een batterij van gedragsparadigma's en immunopathologische studies worden gebruikt. due de motorische coördinatie in cerebellaire neurodegeneratieve ziekte, de voetafdruk baan assay beam test en versnellen roterende staaf test worden gebruikt om redding van gedrags- pathologie 6, 18, 19 detecteren. Deze maatregelen worden aangevuld met immunopathologische evaluatie van cerebellaire cytoarchitecture door het beoordelen van moleculaire laagdikte (gedefinieerd als Purkinjecel dendritische prieel lengte) en Purkinjecel soma tellingen binnen een bepaalde kwabje van cerebellaire weefsel 6, 20, 21. Hier presenteren we meerdere neuropathologische en gedragsmatige methoden voor de opsporing en behandeling van mitochondriale dysfunctie met metabolisch gerichte water oplosbare verbindingen.
We maken gebruik van ex vivo analyse van mitochondriale ademhaling tot mitochondriale dysfunctie te analyseren in de SCA1 transgenic muis. Verder laten wij ziekte symptomen en pathologie zijn verbeterd door de in water oplosbare mitochondriale booster barnsteenzuur, verder impliceert mitochondriale dysfunctie in SCA1 ziekteprogressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de IACUC richtlijnen bij Skidmore College voor het werken met muizen.
1. Behandeling met water-oplosbare verbindingen
- Barnsteenzuur lossen tot een concentratie van 0,75 mg / ml in kooi drinkwater. Een door water oplosbare verbinding van belang in de gewenste concentratie kunnen worden gesubstitueerd in dit stadium. Roer oplossing om ervoor te zorgen dat de verbinding volledig is opgelost.
- Na muizen de gewenste leeftijd van de behandeling te bereiken, vervang dan de kooi drinkwater van de behandeling aandoening groep met de oplossing in stap 1.1.
- Meet het gewicht van zowel behandeling als controlegroep flessen water dagelijks of zowel behandelde en controlemuizen drinken dezelfde hoeveelheid water. Gebruik deze metingen te berekenen totale drug dosering per kooi. Voortzetting van de behandeling gedurende het experiment en de monitor fles gewicht.
2. Footprint Analyse
- Plaats de start-en landingsbaan op de vloer ofeen tafel in een afgesloten ruimte. Stel de startbaan op een lichte opwaartse hoek naar de home box bekleed met beddengoed en een beloning voedsel (bijvoorbeeld suikerhoudende ontbijtgranen). Langs de lengte van de baan met een vel wit papier. Dat het onderwerp acclimatiseren in de home box gedurende 5 min.
- Verwijder het onderwerp uit de home box en verf linker en rechter achterpoten met respectievelijk blauwe en rode niet giftig verf op waterbasis. De verf prints worden gebruikt om meerdere uitvoer gedragsmaten berekenen.
- Plaats het onderwerp aan het begin van de startbaan en laat het onderwerp te lopen naar de home box. Zodra het onderwerp van het home box heeft bereikt, sluit de val deur, en laat het onderwerp te blijven binnen de home box voor een minuut alvorens terug te keren naar de respectievelijke kooi. Maak de landingsbaan en home box met 30% ethanol en het beddengoed te vervangen, te belonen voedsel en landingsbaan papier voor het volgende onderwerp.
- Kwantificeren van het aantal stappen, de breedte van de poort, de hoek van stap, en het aantal windingen genomenop onderwerp volgens de analytische methoden die eerder 6 beschreven. Een succesvolle footprint proef wordt gedefinieerd als een minimum van 5 opeenvolgende voetafdrukken in die het onderwerp loopt naar het doel doos zonder zich om te draaien of te stoppen.
3. Beam Analyse
- Opgericht bundel apparaat volgens de dwarsbalk specificaties die eerder beschreven 6 met de volgende 6 balken: beam 1 = rechthoekig, 28 mm breedte; beam 2 = rond, 28 mm diameter; balk 3 = rechthoekig, 12 mm breed; beam 4 = rond, 12 mm diameter; beam 5 = rechthoekig, 6 mm breedte; beam 6 = rond, 6 mm diameter. Aan de ene kant van de bundel, het opzetten van een verduisterde home box met beloning voedsel.
- Om onderwerpen op de balk te trainen, vergadert de inrichting met balk 3. Plaats voorzichtig het onderwerp op het einde van de balk tegenover de home box, en laat het onderwerp over te lopen. Laat elk onderwerp maximaal drie 2-min proeven tot een succesvolle run te bereiken, Gedefinieerd als het oversteken van de balk en het invoeren van de home box binnen 2 min. Tussen de proeven, laat het onderwerp rusten in de home box voor 2 min. Tussen de onderwerpen, het reinigen van de balk en home box met 30% ethanol en vervang de beloning voedsel in de voorbereiding op het volgende onderwerp.
- Herhaal stap 3,2 keer per dag gedurende de volgende twee dagen tot een totaal van 3 opeenvolgende trainingsdagen. Het testen dag, dag 4, moeten achtereenvolgens volg de trainingsdagen.
- Om de onderwerpen op dag 4 te testen, eerst monteren van de inrichting met balk 1 en het opzetten van de home box zoals beschreven in stap 3.1. Plaats een videocamera voor de inrichting en controleer of de volledige bundel apparaat duidelijk kan worden vastgelegd op video. Begin met opnemen en plaats de eerste onderwerp op de balk tegenover de home box, waardoor tot 3 2-min pogingen om een proces met succes te voltooien. Tussen studies laten onder rusten 2 minuten in de home box.
- Blijf proefpersoon op elk van de zes bundels in numerieke volgorde,zodat het onderwerp rusten 2 minuten in de home box voor het begin van de volgende bundel. Tussen subjecten, schoon elke bundel en het huis doos met 30% ethanol en vervang de beloning voedsel in de voorbereiding voor elk onderwerp.
- Videotape elke proef en noteer het aantal succesvolle tests per patiënt per bundel als volgt: '1' geeft het onderwerp succesvol was op de eerste proef, '2' geeft het onderwerp succesvol was op de tweede proef, '3' geeft het onderwerp was succesvol op de derde en laatste proef, en "4" geeft het onderwerp niet succesvol op een van de drie proeven.
- Gebruik maken van video-opnames van de proeven maatregel footslips door scorers die verblind aan de experimentele omstandigheden van het onderwerp. Definieer een footslip de achtervoet die direct zicht van de camera dompelen onder theoretisch middenlijn over de lengte van de balk. Gemiddeld footslip scores van meerdere scorers.
- Om het aantal s analyserenUccessful proeven en het aantal footslips data, berekent het gemiddelde en standaard fout binnen elke genotype en experimentele conditie cohort. Voeren eenzijdige ANOVA en meervoudige vergelijkingen post-hoc analyse om te bepalen of er een effect van de behandeling en het genotype van het aantal succesvolle proeven en het aantal footslips.
4. Versnellen Rotarod
- Acclimatiseren onderwerpen de assay kamer 10 minuten voor aanvang van de proef. Gedurende deze acclimatiseringsperiode, bereidt de rotarod-inrichting reinigen elke laan van de inrichting met 30% ethanol.
- Open de rotarod software en stel instellingen 4 rpm, versnelling instellingen gaan 5 min en eindsnelheid instellingen 40 rpm. Deze instellingen bieden een constante versnelling 4-40 rpm gedurende 5 min. Muizen op de rotarod blijven op 40 rpm gedurende nog 5 min na het aanlopen van een maximale serie lengte van 10 min.
- Post-acclimatisatie, plaats onderwerpen onto de rotarod in hun respectievelijke lanen terwijl de stang roteert met 4 omwentelingen per minuut. Zodra alle onderwerpen zijn in hun respectieve rijstroken, beginnen de eerste proef. Noteer de latency te vallen met behulp van het instrument software; een tweede timer kan worden gebruikt als backup.
- Na voltooide onderzoeken aangeven, zodat elk onderwerp te rusten in hun baan reservoirs tien minuten voor de volgende proef om vermoeidheid te voorkomen.
- Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 voor een totaal van vier proeven.
- Herhaal stap 4,3-4,5 voor een totaal van vier opeenvolgende dagen, voortzetting van de behandeling gedurende de proefperiode. Na voltooiing, kwantificeren latency de roterende staaf af te vallen voor elke proef per onderwerp 6.
5. Cerebellaire Extraction en Fixation
- Euthanaseren muizen via kooldioxide stikken volgens de institutionele IACUC richtlijnen. Plaats onderwerp in de kooldioxide kamer, en laat kooldioxide in de kamer. Horlogehet dier te allen tijde tijdens de euthanasie stap en niet het dier onbeheerd achter.
- Zodra de ademhaling is opgehouden en onderwerpen tonen geen resterende pijnperceptie door achterpoot druk verwijderen onderwerp vanuit kamer en maak een superieure middellijn incisie door de epitheelweefsel van het midden van de schedel caudaal aan de basis van de schedel door middel van epitheelweefsel.
- Met behulp van dissectie schaar, knip de schedel van de basis op het ruggenmerg door de pijlnaad aan de bregma. Snijd zijdelings door elke coronale hechtdraad voordat trekken uit de frontale, pariëtale en interparietal botten met behulp van stompe pincet.
- Gebruik stompe tang afbreken bot lateraal van de kleine hersenen. Tang om de kleine hersenen scheiden van de colliculi en hersenstam en extruderen van de rest van het weefsel. Scheid het cerebellum in linker en rechter hemisferen met een pincet.
- Onmiddellijk plaats recht cerebelli in vloeibare stikstof om te sparen voor HPLC analysis en linker cerebelli in vooraf gekoelde 4% paraformaldehyde (PFA) voor fixatie van het weefsel. Oogst elk ander weefsel van belang voor het scheiden van de aorta en de teruggooi het karkas volgens de institutionele IACUC regels.
LET OP: PFA is een zeer giftig, brandbaar, en corrosieve. - Vierentwintig uur na extractie, wassen weefsel in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in PFA (4% in PBS) gefixeerd (driemaal, 5 min / wasbeurt) voordat het weefsel in 30% sucrose bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.
6. Immunopathologie Assay
- Bevestig de slang van een slee microtoom om een wastafel kraan en een temperatuur schakelkast. Gebruik de temperatuurregelaar vak aan de microtoom podium te koelen tot -25 ° C. Stel de snijdikte draaiknop om 50 pm.
OPMERKING: Als de draaiknop op de slee microtoom niet bereikt 50 pm, zet de knop om een dunnere instelling en vermenigvuldig de dikte van dienovereenkomstig te verschuiven van de instelling (bijvoorbeeld zet de dial tot 10 urn en verschuiving vijfmaal voordat snijden voor een totale dikte van 50 um). - Dep een dubbeltje-size portie van optimale temperatuur Cutting (OTC) oplossing op het podium. Voor de OTC bevriest, een tang om de halve bol te positioneren, zodat de mid-sagittale snijvlak ligt gezicht naar beneden op de OTC laag. Werken snel, voorzichtig oriënteren het weefsel met een pincet zodat de zijdelingse uiteinde van de halve bol wordt gericht naar het blad boven de trap. Laat de OTC volledig bevriezen.
- Werken in lagen, voeg extra OTC rond het weefsel waardoor de OTC volledig bevriezen voordat het toevoegen van de volgende laag. Voeg een dun laagje OTC bovenop het weefsel en bevriezing.
- Sectie van het weefsel, de distributie van gelijke lichaamsgewicht op het zaagblad tijdens het snijden. Verzamel secties met behulp van een beeldend kunstenaar penseel en plaats in een juiste label goed plaat met 1x PBS. Tussen secties, opnieuw instellen van de snijdikte van deslee microtoom dial eventueel tot 50 urn.
- Vervang de PBS in elk putje van de plaat met goed ureumoplossing [0,01 M ureum in PBS] en plaats de plaat op ijs. Als u klaar bent, verwijdert u de plaat uit ijs en kook secties in ureumoplossing drie keer gedurende 15 s elke keer om epitopen te ontmaskeren voor immunokleuring. Deze stap kan eenvoudig worden bereikt door het plaatsen van de plaat op een verwarmingsblok ingesteld op kooktemperatuur. Tussen elke stap koken, koelen van de plaat met het weefsel secties op het ijs.
LET OP: Als het uitvoeren van het ureum, het blokkeren, primair antilichaam, secundair antilichaam en DAPI stappen in een 96-well plaat, gebruik dan 100 ul volumes overal. Als een ander formaat goed wordt gebruikt, past u de reagens volumes dienovereenkomstig. In plaats van een verwarmingsblok kan een magnetron worden gebruikt om weefselmonsters te koken in ureum. Magnetron monsters op een hoog vermogen-instelling voor drie 15 s intervallen. - Na koken, drie keer, telkens verwijderen onderhavige oplossing wassen secties, ter vervanging van de oplossingmet 1x PBS en roeren gedurende 10 min.
- Blokdelen met ezel serum-oplossing (3% normaal serum ezel, 0,3% Triton X-100 in PBS) door incubatie van weefsel in serum gedurende één uur onder zacht schudden bij kamertemperatuur. Verwijderen ezel serum oplossing.
- Label secties met 0,2 ug / ml anti-calbindin en 1: 2000 anti-ataxine-1 antilichaam (11NQ) 16 in donkey serum oplossing en incuberen bij 4 ° C gedurende 72 uur onder zacht schudden.
- Was secties met PBS zoals in stap 6.5 vóór incuberen secties geschikt secundair antilichaam (1: 500 Alexa Fluor-488-anti-geit en 1: 500 Alexa Fluor-594-anti-konijn-antilichamen verdund in donkey serum oplossing) bij 4 ° C gedurende 48 uur onder zacht schudden.
- Spoel secties driemaal met PBS zoals in stap 6,5 voor labeling celkernen met DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) verdund tot een eindconcentratie van 0,5 ug / ml in PBS. DAPI incubatie mag niet meer dan tien minuten. Verwijder solution en wassen met PBS zoals in stap 6,5.
- Mount weefsel op 2% gelatine gecoate glaasjes met montage medium tot fotobleken te verminderen. Coverslip en afdichting met nagellak.
- Met een scanning confocale microscoop te lokaliseren de primaire spleet van het cerebellum onder helderveld licht. Met een 10X UIS2 doelstelling, scannen en sequentieel exciteren DAPI, AlexaFluor-488 en AlexaFluor-594 kanalen met een 405 nm diodelaser, een 488 nm argon laser en een 559 nm diodelaser, respectievelijk, in combinatie met een DM488 / 559 nm dichroïde bundelsplitser. Aparte en het verzamelen van uitgezonden licht met behulp van SDM490 en SDM560 beam splitters en een BA575-675 banddoorlaatfilter, respectievelijk.
- Voor elk kanaal, de bouw van een z-stack in de primaire spleet met z = 20 pm en stap = 0,1 urn. Gebruik de post-processing software die bij de confocale microscoop in een groot marker toe te voegen aan het uiteindelijke beeld.
OPMERKING: Alternatieve lasers, filters en fluoroforen kunnen gesubstitueerd zijn gebaseerd op availability. Als AlexaFluor-488 of AlexaFluor-detectie 594 zwak is, kan een gallium fosfide (GaAsP) zeer gevoelige detector worden gebruikt om het signaal te versterken indien beschikbaar.
- Voor elk kanaal, de bouw van een z-stack in de primaire spleet met z = 20 pm en stap = 0,1 urn. Gebruik de post-processing software die bij de confocale microscoop in een groot marker toe te voegen aan het uiteindelijke beeld.
7. kwantificeren Moleculaire Laagdikte en Purkinje Cell Numbers
- Met behulp van ImageJ, open een z-stapel van gebrandschilderd primaire spleet en split elk beeld in zijn rode, blauwe en groene kanalen door het selecteren van 'beeld' in de menubalk, 'Kleur' van het tabblad Beeld en 'Split Channels' uit de Color tab.
- Maak een max Z-projectie van elk kanaal dat werd gesplitst. Wanneer het kanaal beeld van belang is geopend, selecteert u 'Beeld' in de menubalk, 'afdelingen' van het tabblad Beeld en 'Z-project' van het tabblad 'afdelingen'. Binnen het 'Z-project' commando menu, selecteer 'Max Z projectie' en klik op 'OK'. Herhaal dit voor elk kanaal.
- Open de Cell Counter plugin door 'Plugins' van the menubalk 'analyseren' op het tabblad Plugins en 'Cell Counter "op het tabblad Analyseren.
LET OP: ImageJ en de ImageJ Cell Counter plugin kan worden gedownload op de websites die in de tabel van materialen en apparatuur. - Kwantificeren aantal Purkinje cellen door telling ataxine-1 gemerkte kernen die langs een vooraf bepaalde 200 urn strook voorste en achterste lengtes van de primaire spleet liggen. Gebruik de drempel kaart door te kiezen voor 'Beeld' in de menubalk, 'Aanpassen' op het tabblad Beeld en 'Threshold' op het tabblad Aanpassen aan een drempel kaart van het kanaal van belang (rood te maken in het geval van ataxine-1 gelabelde kernen ).
- Kies een pixel bereik dat gedurende de kwantificering (31-225 pixels bijvoorbeeld) kan genormaliseerd worden. Gooi lawaai van de beelden door het controleren van de "Dark Background" box aan de Drempel venster. Beeldsignaal kan worden geïnverteerd voor het gemak van het tellen.
- Kwantificeren moleculaire laag thickness in het groene kanaal met behulp van de 'Split Channels' en het gereedschap 'Threshold Map' als in stap 7.1 en 7.2. Met behulp van de grootte marker op elke afbeelding als een gids, willekeurig meten drie moleculaire laag lengtes binnen elk van de twee aangewezen 200 pm stukken elk beeld primaire spleet van. Metingen van het proximale uiteinde van de Purkinje dendritische as aan de basis van de Purkinje soma naar het distale uiteinde van de Purkinje dendritische as.
- Neem Purkinje cellen en laagdikte moleculaire als middel plus of minus de standard error. Voer eenzijdige ANOVA met meerdere vergelijkingen post-hoc analyse om het effect van behandelingsomstandigheden of genotype van het aantal cellen en de lengte van de dendritische as testen.
8. HPLC Analyse van cerebellaire Barnsteenzuur Concentraties Post-behandeling
- Voorbereiding van de te analyseren monster
- Weeg elk geoogst rechter cerebellaire hemisfeer voorafgaand aangebruik in HPLC-analyse. Gehakt hemisferische helften één voor één in een voorgekoeld dounce homogeniseerinrichting en voeg 0,5 ml van 75:25 (volumeverhouding) water: methanol oplossing in elk gehomogeniseerd half 17.
- Met behulp van een smalle pre-gekoelde homogenisator, schromelijk breken weefsel met 5 dounce slagen. Doorgaan met fijn gehakt elk weefselmonster met een breder homogenisator, het aanbrengen van 20 dounce beroertes.
- Breng de homogenaten voor een pre-gekoelde microcentrifugebuis. Na elk monster, spoel de homogenisator met 0,5 ml ijskoud water: methanol-oplossing en voeg de spoeling aan de microcentrifugebuis.
- Centrifugeer homogenaat monsters bij 1300 xg gedurende 30 min bij 25 ° C en verzamel de bovenstaande vloeistof in een schone microcentrifugebuis.
- Filtreer de bovenstaande vloeistof door een centrifugaal filter unit ondergebracht bij een geregenereerde cellulose filter van 10 kilodalton (kDa) nominaal gewicht limiet moleculair. Indien niet onmiddellijk worden weergegeven HPLC analyse, opslag gefiltreerde monsters bij -80 °C.
- HPLC Instrumentatie en voorwaarden
- Bevestig een ion uitsluitingschromatografie kolom met een lengte van ten minste 30 cm en een deeltjesgrootte van 7 um tot een High-Performance Liquid Chromatography.
- Bereiden en ontgas een voldoende hoeveelheid van 1 mM acetaat buffer ingesteld op een pH van 5.
- Stel de HPLC mobiele fase met een snelheid van 0,8 ml / min. Bij gebruik van een UV-vis-detector, selecteer een detector golflengte van 224 nm. Typische elutietijd voor barnsteenzuur onder deze omstandigheden tussen 10 en 12 minuten.
- Hardlopen en analyseren van Normen en Monsters
- Bereid een reeks normen in acetaat buffer mobiele fase met barnsteenzuur concentraties tussen 0 en 250 ppm.
- Run elke norm en voor te bereiden een kalibratiecurve met behulp van de piek gemeten vanaf elke run.
- Zodra een accurate standaard curve wordt verkregen, lopen eerder bereide monsters verdund in acetaat buffer.Voor een grotere nauwkeurigheid van de meting, kunnen monsters verrijkt met bekende concentraties barnsteenzuur die zijn verdund in de mobiele fase. Run alle monsters in drievoud.
- Analyseer HPLC chromatogrammen aan de barnsteenzuur concentratie van de monsters te bepalen met behulp van de kalibratiecurve en vervolgens te vermenigvuldigen met het monster volume en te delen door oorspronkelijke monster massa.
9. Ex Vivo Analyse van cerebellaire mitochondriaal functionaliteit Met behulp van een Oxygen elektrode Control Unit
- Maak een Clark-type elektrode met behulp van een commercieel verkrijgbaar systeem door eerst een druppel van kaliumchloride toe te passen (50% KCl w / v) oplossing op de platina kathode, het snijden van een 1,5 cm 2 stuk commerciële tabak vloei en voorzichtig het plaatsen van het papier over platina kathode.
- Bedek de kathode en anode rond met een 2,5 cm 2 stuk van polytetrafluorethyleen (PTFE) papier en behaaglijk te beveiligen zowel membranes met O-ringen, om ervoor te zorgen dat er geen vouwen of bellen binnen de membranen. Druppelen 50% KCl oplossing in de omringende put.
- Bevestig de premade elektrode in de test kamer en te vullen met lucht verzadigd water. Verwarm de kamer naar 30 ° C, voeg 0,8 cm roerstaaf aan de oplossing en geroerd bij 70 rpm met behulp van het instrument software. Kalibreer de kamer door de oprichting van nul zuurstof. Hiervoor serieel enkele kristallen van het reductiemiddel natriumdithioniet aan de oplossing.
- Nadat de kalibratie wordt bereikt, was de kamer eenmaal met 70% ethanol, en was daarna zes maal met gedeïoniseerd water alvorens de kamer acclimatiseren in 1,5 ml ademhaling buffer (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2PO 4, 0,5 mM Na2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
LET OP: alle sporen van natriumdithioniet moet volledig worden verwijderd tijdens het wassen stappen voordat u probeert te metenzuurstofconcentraties tijdens de ademhaling experimenten.
- Nadat de kalibratie wordt bereikt, was de kamer eenmaal met 70% ethanol, en was daarna zes maal met gedeïoniseerd water alvorens de kamer acclimatiseren in 1,5 ml ademhaling buffer (5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 100 mM mannitol, 10 mM KH 2PO 4, 0,5 mM Na2 EDTA, 60 mM Tris-HCl [pH 7,4]) 7.
- Voorzichtig homogeniseren gewogen cerebellaire hemisferen in 0,5 ml homogenaat buffer (0,25 M sucrose, 0,5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4]). Transfer homogenaat om een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml en gekoeld houden tot het begin van de test.
- Voeg het homogenaat aan de kamer, tot een eindvolume van 2 ml. Permeabilize de cerebellaire homogenaat door toevoeging van 40 ul van digitonine en saponine (5 mg / ml); laten gehomogeniseerd weefsel incuberen 10 min.
OPMERKING: Digitonine en saponine zijn giftig, en incubatietijden moeten tot een minimum worden beperkt. - Om de opname zuurstofverbruik beginnen, bepalen de mitochondriale functie door middel van activering en remming van de oxidatieve fosforylering keten met behulp van substraten en remmers, respectievelijk (3 min opnames per substraat).
- substraten met behulp van schone spuiten als volgt toe te voegen: 10 pi 2 M glutamaat [uiteindelijke concentratie (fc) 0,01 M]5 pl 0,8 M malaat [fc 2 mM], 20 pl 0,5 M adenosine difosfaat (ADP) [fc 5 mM], 1 ui 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 pl 1 M barnsteenzuur [10 mM], 1 ui 5 Een mM antimycin [fc 2,5 uM], 1 ui 0,8 M ascorbaat [fc 0,4 mM], en 5 pl 0,2 M tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD). [Fc 0,5 MM] Bij het toevoegen van substraten aan de kamer voorzichtig luchtbellen niet in te voeren in het systeem.
OPMERKING: Gedetailleerde informatie over het functionele effect geïnduceerd door elk substraat en remmer wordt beschreven in een eerder gepubliceerd protocol 7. Individuele dosis-respons curves moet worden gegenereerd om optimale concentraties van de substraten en remmers in preparaten / weefsel / soort die tot dusver bestudeerd bepalen. Evenzo kan het protocol worden geoptimaliseerd voor de aangeboren metabole tendensen van het weefsel / soort bestudeerd, zoals substraat voorkeuren.
- substraten met behulp van schone spuiten als volgt toe te voegen: 10 pi 2 M glutamaat [uiteindelijke concentratie (fc) 0,01 M]5 pl 0,8 M malaat [fc 2 mM], 20 pl 0,5 M adenosine difosfaat (ADP) [fc 5 mM], 1 ui 1 mM rotenon [fc 0,5 uM], 20 pl 1 M barnsteenzuur [10 mM], 1 ui 5 Een mM antimycin [fc 2,5 uM], 1 ui 0,8 M ascorbaat [fc 0,4 mM], en 5 pl 0,2 M tetramethyl-p-fenyleendiamine (TMPD). [Fc 0,5 MM] Bij het toevoegen van substraten aan de kamer voorzichtig luchtbellen niet in te voeren in het systeem.
- Zodra het verzamelen van gegevens is voltooid, voorzichtig eenspirate de cerebellaire homogenaten en reinig de kamer met ethanol en gedemineraliseerd water. Eenmaal schoon aanvullende cerebellaire homogenaat monsters kan worden uitgevoerd zonder extra kalibratie zolang de PTFE membraan intact blijft. Na de definitieve oplevering, schone elektrode met gedemineraliseerd water en ethanol en winkel met silicagel of droogmiddel.
LET OP: Tussen dezelfde dag loopt, vult de kamer met gedemineraliseerd water ervoor te zorgen dat het membraan niet uitdroogt. - Met behulp van de data sheet gemaakt door het instrument software, export 40 min van de ademhaling data die aanvangt twee minuten na substraat Naast een spreadsheet-programma.
- Bereken de snelheid van de ademhaling per substraat of remmer. Normaliseren van de gegevens door de totale ademhaling door de ademhaling te delen tijdens de ascorbaat-TMPD substraat toevoeging.
OPMERKING: De ademhalingssnelheid kan verder genormaliseerd op het eiwitgehalte van het weefsel dat bijzonder wenselijk neurodegeneratie experimenten kan zijnwaarbij het weefsel gehalte variëren. Hiervoor reserveren 50 pi van het monster homogenaat (uit stap 9.3) voor gebruik in een standaard eiwit assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. 'Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich's ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
