Summary
Система / cas9 CRISPR предлагает потенциал, чтобы сделать редактирования целенаправленный генома доступной для научного сообщества. Этот протокол предназначен для демонстрации того, как создать вирусы, которые будут с выбыванием представляющий интерес ген, используя систему CRISPR / cas9, а затем применить их стереотаксическим в мозг взрослых мышей.
Introduction
Изучить основы нормальной физиологии и патологии болезни, существует необходимость точно манипулировать экспрессии генов в модельных организмах. Для модельных организмов млекопитающих, это в значительной степени сосредоточены на создании и развитии трансгенных мышей, в которых генетический элемент, представляющий интерес, в окружении сайтов, признанных рекомбиназы. Это может привести к участкам, манипулирование этими генами фланкированные. Хотя это была успешная стратегия, настало время и ресурсоемким; например, создание тройной трансгенного животного, которое выражало бы floxed ген, Cre рекомбиназу и ген-репортер Cre требует многократных спариваний и проверки. В противоположность этому , стереотаксической инъекции репликации дефектных вирусных частиц , кодирующие флуоресцентный белок и рекомбиназу в floxed гена животного не требует сложного генотипирование или стратегий разведением 1. Кроме того, если флуоресцентный белок и Cre экспрессирующих вирус совместно вводят со вторым вирусом ENCOдинь другой флуоресцентный белок, то это обеспечивает контроль внутри ткани-мишени для генетических манипуляций. В то время как эта стратегия по-прежнему требует использования нокаута в животных, вирусно опосредованные стратегии РНК на основе обойти потребность в трансгенных животных. Например, стереотаксической инъекции репликации с дефицитом вирусов, которые кодируют флуоресцентный белок и короткий шпилька РНК (shRNA) могут использовать эндогенные RNAi оборудование ячейки приведет к мощному снижению транскрипта гена. Тем не менее, стратегии shRNA производят тонкие ген нокдаунов часто приводит к скромных клеточных фенотипов 2. В то время как нокдауна может быть более физиологически актуально для гетерозиготной дисфункции гена, его уменьшилась прочность по сравнению с нокаута не является идеальным для фенотипического открытия новых генов.
Третий метод, который недавно появился, то CRISPR (Кластерный Регулярно Interspaced Короткие палиндромных Repeat) / cas9 (CRISPR-ассоциированныйбелок 9) система, опирается на экспрессию как небольшой экзогенной РНК и режущим ДНК фермента. Система / cas9 CRISPR был адаптирован из прокариот иммунной системы , которая эволюционировала способ идентификации иностранных, вторгаясь ДНК от вирусов и ориентации его на деградацию с помощью фермента cas9 3,4. Этот мощный метод редактирования генома может быть использован для создания целевых делеции, инсерции и мутации; и следующий протокол будет кратко описано , как сделать делеции в гене интереса для того , чтобы с выбыванием свое выражение в естественных условиях. Фермент cas9 должен быть выражен с направляющей РНК , гомологичные области , представляющей интерес и смежных с подмостей РНК. Нокаут гена с помощью этого метода требует ориентации cas9 для конкретного региона в геноме с использованием синтетических направляющих РНК (sgRNA), и вызывая двухцепочечные разрывы (DSBs) на сайте интерес. Эти DSBs затем ремонтироваться эндогенного клеточно-ремонтной техники через негомологичный конечного присоединения (NHEJ), который леобъявления вставкам , которые могут производить миссенс или нонсенс - мутации и , следовательно , может создать потерю экспрессии функционального белка 5. Так как эта система производит геномные изменения, он требует только временной экспрессии cas9 и sgRNA. Тем не менее, желательно, чтобы стабильная флуоресцентного индикатора для идентификации клеток и их потомство манипулируют таким образом.
Lenti- и ретровирусы имеют преимущество стабильно интегрировать интерес ДНК в клетки-хозяева, которые поддерживают долгосрочное выражение и которые передаются дочерним клеткам во время митоза. Этот протокол описывает конструкцию и производство двух типов репликации дефектной, высокий ретровирусов титром: вирус иммунодефицита человека, полученные лентивирусов частицы (лентивирусные) и те, которые основаны на мышиной лейкемии Мэлони вируса (ретровируса). В то время как оба из этих вирусов способны поддерживать стабильный выражения больших трансгенов, ретровирусные частицы могут включать только в геном дюделение клеток кольцо с деградацией ядерной оболочки, и , следовательно , может быть использован в качестве инструмента для обозначения и дата рождения 6 ячеек. В то время как лентивирусов имеют репутацию относительно низкий титр 7, эта методология, в том числе использование кофеина 8 во время вирусной коллекции, обычно производит титры 10 9 и 10 10 частиц / мл. Еще одно преимущество lenti- и ретровирусов является допуском для очень больших вставок. Следующий сборник протоколов описывает процедуру для разработки Ленти или ретровирус, кодирующий флуоресцентный репортер, sgRNAs и cas9, чтобы использовать систему CRISPR / cas9 модифицировать ДНК, а также выразить флуоресцентный белок.
Мышь стереотаксической нейрохирургии является ценным методом для инъекций вирусов в естественных условиях для изучения морфологии, функции и связность инфицированных нейронов. Вирусные инфекции в нейронах могут быть использованы для манипулирования уровнями экспрессии в течение длительного периода ТИМае, такие, как в ходе развития, и выражение можно точно контролировать путем использования различных лекарственных индуцируемых систем и специфической ведомой экспрессии Cre. Этот конкретный протокол объясняет, как внедрить вирус, экспрессирующие sgRNA и cas9 нокаутировать представляющий интерес ген в мозге взрослого мыши. Мыши восстанавливаться очень быстро от этой процедуры и экспрессии вирусных трансгенов можно увидеть в течение 48 часов после инъекции. Тем не менее, флуорофор выражение, как представляется, увеличиваются в течение нескольких недель, в результате вблизи максимальных уровней на 3 недели после заражения. Мыши, которые претерпевают вирусный стереотаксической инъекции могут быть использованы для поведения, электрофизиологии или морфологических исследований. В целом, цель этих процедур заключается в демонстрации того, как нокаутировать ген в мозге взрослых мышей с помощью стереотаксической хирургии и вирус, выражающую определенную sgRNA и cas9.
Protocol
Заявление по этике: Все протоколы были одобрены советами институционального и организационного обеспечения биобезопасности по уходу и использованию животных комитета Дартмут.
1. Протокол по проектированию направляющий выступ Strand (sgRNA) для CRISPR / cas9 ретровируса
Примечание: Есть много некоммерческих сайтов, которые могут быть использованы для создания sgRNAs для целевой интерес ген (https://benchling.com/ и http://crispr.mit.edu/). Цель этого протокола заключается в разработке и заказать одноцепочечных олигонуклеотидов от коммерческого поставщика, который отжигают друг к другу. Это отжигают олиго будет легируют в вектор переноса PXL. Смотрите дополнительную видео 1 для примера проектирования sgRNAs с использованием Benchling.
- Использование веб-сайт, посвященный разработке sgRNAs.
Примечание: Например, ввода кодирование / exonic последовательность из вблизи начала представляющего интерес гена в веб-сайт будет генерировать 20 нуклеотида sgRNA. Используйте последовательность sgRNA 20 нуклеотидов, чтобы спроектировать смысл и антисмысловой олигоs, что будет приказано создать sgRNA. - После создания sgRNA, скопируйте эту последовательность в текстовый процессор. Добавление G (гуанин) к началу последовательности sgRNA 20 нуклеотидов в документе , если он уже не начинается с одной (т.е., G-20 нуклеотидной последовательности sgRNA). Это необходимо для того, чтобы обеспечить хорошую транскрипцию выключения промотора U6.
- Документ обратный комплемент этого сейчас 20-21 нуклеотидной последовательности. Для чувственного олиго, добавьте "CACC" к 5' - концу последовательности в документе (т.е. CACC-G-20 нуклеотидной последовательности sgRNA). Это свес будет использоваться для лигирования последовательности в вектор PXL.
- Для антисмыслового олигонуклеотида, добавьте AAAC к 'концу 5. Используйте этот выступ для лигирования последовательности в вектор PXL.
- Получить смысловой и антисмысловой олиго. После получения олигомеров, составляют 100 мкМ запасов с использованием ДНКазы воды. Смешайте по 10 мкл каждого из 100 мкМ смыслового и антисмыслового олигомеров с 4 цл 10х NEB буфера 2 и 16 мкл воды.
Примечание: Они не нуждаются в очистке страницы или 5'phosphorylation (как свесы BbsI не являются совместимыми Липкие концы).- Доведите 200 мл воды до кипения в стакане емкостью 500 мл, а затем всплывают пробирку, содержащую эту смесь в пенной "поплавка" держателем. Дайте воде остыть медленно от 95 ° С в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Развести в настоящее время отжигают-олиго смеси 1: 1000 в стерильной воде и используют сразу же в следующей перевязки или хранить оставшуюся реакционную смесь при -20 ° С.
- Дайджест PXL, А PX330 вектор производной, с помощью фермента рестрикции BbsI при 37 ° С в течение 2 часов. С помощью реакции 40 мкл, содержащем 2 мкг PXL, 4 мкл 10х NEB буфера 2, 1 мкл Bbs1 и водного баланса. Тема Гидролизованный-PXL для очистки рутинного геля с использованием коммерческого набора. Убедитесь в том, что выход составляет ~ 8,5 кБ продукт.
- С помощью коммерческого набора для лигирования, лигирования 1 мкл 1: 1000отожженных-олигонуклеотиды с 50 нг переваривается и гель-очищенной PXL. Transform лигирования продукт в компетентной рекомбинации с дефицитом E. палочки (NEB 5-альфа, субклонирования эффективность). Экран трансформантов на присутствие правильной направляющей с помощью секвенирования плазмидной ДНК.
- Гидролизуют U6, направляющую цепи и РНК матриксные элементы (sgRNA) из PXL использованием BstB1 и РАС1 ферментов рестрикции и лигирование в флуоресцентный белок-Т2А-cas9 вирусной цепи расщепляли теми же ферментами рестрикции. Transform лигирования продукт (NEB 5-альфа максимальную эффективность). Флуоресцентные белок-T2A-cas9 вирусных Магистральные плазмид являются низкие плазмид копирования и, таким образом, низкие протоколы копирования должны быть использованы.
Примечание: Вторая sgRNA может быть аналогичным образом введены PacI переваривании другой гид нити плазмиды PXL и легируют в РАС1 переваривается и теленка-кишечных фосфатазы лечение вирусной позвоночник, уже содержащий первую направляющую цепи. Фосфатазы лечение вирусной плазмиды переноса поможетуменьшить число трансформантов из самолигирования плазмид, не содержащих второй направляющей. - Последовательность проверки окончательной плазмиды и макси приготовительное с использованием набора макси преп Nucleobond Xtra и упаковать его в вирус, используя следующий "Протокол для Retro / Lentiviral производства - CaPO4 метод».
2. Подготовьте 293FT / 293GP клетки для трансфекции (Retro / Лентивирусов Производство - CaPO4 Метод)
- (День 1) Быстро разморозить 1 флакона клеток на 10 см культуральный планшет в водяной бане при 37 ° C. Для лентивирусов упаковки используйте 293FT клетки. Для ретровирусов упаковки используйте 293GP (рвотный / POL) клетки.
- Пипетировать все размороженных клеток из крио трубки в 15 мл коническую пробирку и добавляют 2 мл подогретого CO 2 , уравновешенную-полной модифицированной среде Дульбекко Искова.
- Центрифуга клетки в течение 5 мин при 500 мкг до гранул. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл полной IsБухты модифицированной среде Дульбекко. Пластина клеток на 10 см для культивирования клеток блюдо с. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе с 5% углекислого газа.
- (2-й день) 24 ч после посева, замены среды на пластине с помощью аспирационного существующих средств массовой информации и добавлением 10 мл предварительно подогретой среде Исков модифицированном Дульбекко к пластине.
- (День 3-4) 24-48 ч после смены носителя и как только клетки становятся сливающиеся, расколоть клетки к сплошности 2,5-3,0 × 10 6 клеток / пластин (10 см пластины).
- Чтобы разделить клетки, аспирация СМИ и промыть пластины с 5 мл PBS. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина к пластине и инкубировать при температуре 37 ° С до тех пор, пока клетки не снимите пластину. Добавить 0,5 мл среды Айскоува модифицированную Дульбекко, чтобы нейтрализовать реакцию трипсина 0,25% и пипеткой клеток в 1,5 мл пробирку.
- Спин клетки при 500 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в 1 мл модифицированной среде Дульбекко Искова. Развести 1081; л клеток в 90 мкл PBS. Граф клеток с использованием либо гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Re-пластины 2,5-3,0 х 10 6 клеток / пластина с модифицированной среде Дульбекко полном Искова.
Примечание: Клетки будут ~ 50% сливающийся 24-34 ч после посева. Трансфекции клеток, когда они ~ 50% сплошности.
3. (5-й день) CaPO4 Трансфекция и вирусных частиц Коллекция
- Изменение час СМИ 2 до трансфекции аспирационных существующих средств массовой информации и добавление 10 мл подогретого модифицированной среде Дульбекко Искова. Убедитесь в том, что существует ровно 10 мл среды в 10 см пластины.
- Подготовка реагентов трансфекции для 2-х блюд с использованием 2, 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Добавьте первую трубку "ДНК" и вторую трубу "2X HBS". Регулировка концентрации ДНК в 1 мкг / мкл в Трис-ЭДТА при рН 7,4.
- Для лентивирусов, медленно добавляют 20 мкл вектора переноса (The Viraл конструкт интереса), 13 мкл CMVdelta8.9, 9 мкл VSV-G, 860 мкл молекулярной биологии класса H 2 O, и 100 мкл 2,5 М CaCl 2 к первой трубе ( "ДНК"), непрерывно выстукивая на трубе, чтобы перемешать.
- Для ретровирусов, опустить плазмиду CMVdelta8.9. Добавьте 20 мкл вектора переноса, 15 мкл VSV-G, 860 мкл молекулярной биологии Grade H 2 O, и 100 мкл 2,5 М CaCl 2 в пробирку с надписью "ДНК".
- Добавьте 1 мл 2x HEPES-буферном солевом растворе (рН 7,0; это рН является абсолютно критическим) к трубе с надписью "2X HBS".
- Медленно добавить содержимое пробирки "ДНК" в 1 мл в пробирку "2X HBS", по одной капле за раз. Постоянно нажмите "2X HBS" трубку с указательным или средним пальцем, добавляя содержимое трубки "ДНК". Заметим , кажущиеся Capo 4 везикулы после каждого падения. Инкубируйте пробирку в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Добавить 1 мл трансфекцией в медленных капель в каждую ячейку пластины 10 см, а затем инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
- (6-й день) Заменить носитель с 8 мл модифицированной среде + 0,5% FBS Дульбекко Айскоува и 40 мг кофеина / 100 мл среды. Если вектор переноса содержит флуоресцентный маркер, то Флуорофор выражение указывает на успешную трансфекцию.
- (7-й день) Сбор средств массовой информации, содержащие вирусные частицы с помощью 10 мл серологические пипетки и обойтись в 50 мл коническую трубку. Хранить в 50 мл коническую трубку при 4 ° С. Добавить 8 мл 0,5% FBS сред на каждой пластине.
- (8-й день) Опять же, собирать средства массовой информации, содержащей вирусные частицы, и в сочетании с урожая предыдущего дня в 50 мл коническую трубку.
4. Концентрация и очистка вирусов
- Сделать 5х раствора полиэтилена гликоля 6000, добавляя 40% полиэтиленгликоля 6000 и 1,5 М NaCl в DDH 2 O. Автоклава решение нажидкий цикл в течение 45 мин при температуре 121 ° С. Медленно перемешать раствор при охлаждении.
Примечание: Решение начнет облачно, а затем станет ясно, как он охлаждается. - Центрифуга 50 мл коническую пробирку, содержащую обе коллекции вирусного супернатанта при 2000 х г в течение 10 мин для того, чтобы осадить нерастворимый материал. Очищают вирусный носитель путем фильтрации через 0,45 мкм низким содержанием белка связывания шприцевой фильтр (ПЭС или PVDF).
- Добавить 5x полиэтиленгликоль 6000 раствор для медиа-контента (конечная концентрация должна быть 8% полиэтиленгликоль 6000 и 0,3 М NaCl). Смешайте перевернув несколько раз трубки (Не вихрь). Выдержите вирусный раствор, содержащий полиэтиленгликоля при температуре 4 ° С в течение 12 или более часов, ремиксинга время от времени.
- (День 9) Центрифуга вирусный содержащий полиэтилен гликолевый раствор при 2500 х г в течение 45 мин. Удаляют супернатант и спина снова в течение 2 мин. Опять же, удалить и уничтожить супернатант.
- Ресуспендируют гранул путем добавления 320 мклстерильный фосфатно-солевой буферный раствор (320 мкл раствора 1/100 исходного объема вирусных , содержащих Собранную среду) и инкубируют в течение ночи при 4 ° C. По желанию, ресуспендируют осадок при комнатной температуре на качалке в течение 30 мин.
- После ресуспендирования осадка, аликвоты вируса (5-10 мкл на 0,5 мл трубки) и замораживать аликвот при -80 ° С (замораживание разморозки или хранения при температуре 4 ° С позволяет значительно снизить титр).
- Титр вирусов с использованием стандартных протоколов, то есть выполнить серию разведений на 6-луночный планшет из HEK293T клеток и вручную подсчитывать флуоресцентные колонии 48 ч позже.
5. Тестирование Эффективность CRISPR вируса
Примечание: Последовательность клонов, используя следующие шаги для проверки производства двунитевых разрывов ремонтируемых по NHEJ с помощью мыши Neuro2A клетки. Это имеет преимущество над сюрвейерскими анализов в том, что он может быть использован, чтобы определить процент клеток, которые были изменены, и характериз вставкам в результате NHEJ.
- Шерсть на 3,5 см для культивирования клеток блюдо с желатиновой белковой смеси, такие как Матригель разводили в модифицированной среде Дульбекко Искова 1:50 и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С. Аспирируйте желеобразную смесь белка и высевания Neuro2A клетки.
- После того, как клетки Neuro2A достигают 50% сплошности, добавьте CRISPR Лентивирус или ретровирус при множественности инфекции 10 (то есть, 10 вирусных частиц на клетку).
Примечание: Neuro2A клетки не столь любезен к инфекции, как и НЕК293, таким образом, одна инфекция не приведет к 100% клеток заражаются с лентивирусов. Кроме того, ретровирус заражает только делящиеся клетки и, следовательно, также не приводит к 100% инфекции. Для достижения почти уровень инфицирования 100%, добавление вируса может повторяться на нескольких дней, разделяя клетки по мере необходимости. В качестве альтернативы, флуоресцентные позитивные клетки могут быть выделены с помощью флуоресцентной-активированных клеток-сортировочный. Thе наиболее эффективным способом для достижения скорости инфекции 100% с лентивирусах должен выполнить одну инфекцию с последующим FACS изоляции. Для ретровируса, выполнить 4-раундов инфекции 24 ч друг от друга и следовать путем FACS изоляции, чтобы гарантировать 100% инфекции. - После заражения клеток в течение 1 недели, расширить клетки почти до слияния в 10 см планшете, аспирация СМИ и промыть пластины с 5 мл фосфатно-буферным солевым раствором. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина и инкубировать при температуре 37 ° С до тех пор, пока клетки не снимите пластину. Добавить 0,5 мл среды Айскоува модифицированную Дульбекко, чтобы нейтрализовать реакцию трипсина 0,25% и пипеткой клеток в 1,5 мл пробирку и осаждения клеток при 500 мкг в течение 5 мин.
- Для выделения ДНК, добавляют 100 мкл 50 мМ гидроксида калия, повторно приостанавливать клетки и инкубировать при температуре 95 ° С в течение 5 мин. Нейтрализовать раствор, используя 10 мкл 1 М Трис, рН = 8,0.
- ПЦР-амплификации область фланговый геномную область мишенью в CRISPR sgRNAиспользуя ~ 300 нг ДНК , выделенного на стадии 5.5 , используя высокодостоверном Master Mix ПЦР 4.
- Запуск реакции ПЦР на 2,5% -ном агарозном геле и гель очистить соответствующего размера фрагмента с использованием набора для очистки гель, такие как набор гель для восстановления ДНК. Перевязывать в клонирующий вектор ПЦР такой как pGem-трет-легко и превращаются в компетентные клетки 9.
- 24 часа в сутки позже, добавьте 2 мл LB бульона в 15 мл с круглым дном трубы, а также соответствующий антибиотик (ампициллин, неомицин и т.д.). Инокуляции трубку с отдельной колонии с помощью стерильной пипетки или контур, чтобы выбрать одну колонию из LB-пластинки. Расширение и вырастить колонию путем встряхивания трубки со скоростью 250 оборотов в минуту и температуре 37 ° С в течение 24 ч. Повторите эту операцию для многих колоний, как хотелось бы.
- С помощью мини-Prep Kit, выделения ДНК из E. палочка и последовательность с использованием праймеров , предназначенных для амплификации области гена целевого по sgRNA для того , чтобы проанализировать cas9 целевой области генома мыши.
6. Протокол Инъекции стереотаксическая для взрослых мышей
- Подготовка к хирургии
Примечание: Важно поддерживать стерильные условия во время операций выживания. Это достигается в этом протоколе под воздействием тепла стерилизации хирургических инструментов, используя бетадин стерилизовать место инъекции, и добавление мазь с антибиотиком на месте разреза после его закрытия. Кроме того, важно использовать стерильные перчатки, а также тщательно стерилизованные, специализированную область хирургии.- Тепло стерилизовать хирургические инструменты перед использованием либо автоклавированием или с помощью горячего шарика стерилизатор. Подготовьте камеру регенерации и область хирургии путем включения грелки для поддержания температуры тела во время операции и восстановления. Соберите сверло используется для создания отверстий в черепе для инъекций.
- Нагрузка 4 мкл вируса в инъекционной иглы путем удаления вируса непосредственно из стерильной ПЦР-пробирку. Кратко удалить вирусный аликвоты из льда. Поддерживать вирусв шприце при комнатной температуре в течение не более 1 ч до инъекции.
7. стереотаксическая Инъекции
- Убедитесь, что вентиляция в хирургии набора открыта для обеспечения надлежащего потока воздуха. Подготовьте мышь для хирургии обезболивающее с 4% изофлуран в индукционной камере. После анестезии, брить голову, чтобы подготовить место для инъекции.
- Поместите мышь в стереотаксической инструмента с помощью пинцета, чтобы переместить язык вниз и в сторону. Вставьте укуса бар в рот, пока зубы не упасть в щель, а затем закрепите стержни уха. Убедитесь, что корпус мыши находится на грелку, и нос расположен в носовой конус. Прямой 4% изофлуран в носовой конус. Подтверждение анестезии, зажимая ногу с помощью пинцета и гарантируя, что нет никакого испуга рефлекс.
- Применяют искусственные слезы, чтобы смазывать глаза. Завершить подготовку к месту инъекции моечные бритую голову с чередующимися раундах POVidone-йод и лидокаин.
- Используя скальпель, вырезать небольшой разрез вдоль центра головы. Сушат череп с тампоном и перекиси водорода в случае необходимости, чтобы помочь визуализировать брегмы.
- Использование рассекает сферу, найти брегмы на череп и поместить кончик сверла на темени. Ноль (или запись) цифровых стереотаксических координат на х, у, г плоскостей.
- Для того, чтобы гарантировать, что голова уровня на ростральнее к хвосту оси у, поместите сверло на лямбда и выровнять голову так, что г-координата примерно равна как на темени и лямбда.
- Для того, чтобы гарантировать, что голова уровня на оси х, поместите сверло у = 1/2 лямбда. Убедитесь в том, что г-координата равна на 1 мм с каждой стороны (х = +/- 1 мм) стреловидного шва. Отрегулировать череп, если есть разница в Z-координата в 1 мм слева и справа от лямбда.
- Поместите сверло над нужными координатами. Для зубчатую извилину, используйте координатSY = -1.9 от темени и х = +/- 1.1. Перед выполнением буровых работ, снизить изофлуран до 2%, а затем медленно и осторожно, сверлить через череп.
- После сверления все отверстия, прикрепить заполненный шприц на стереотаксической инструмента. Визуально центр шприца над отверстием и обнулить координаты г на череп.
- Медленно опустите шприц глубокой г глубины. Для зубчатую извилину, глубины Z являются -2,5, -2,4 и -2,3. Начинают инъекции со скоростью 0,25 мкл / мин с использованием стереотаксической инжектора.
- После инъекции завершается на самом низком Z-глубины, подождите 1 мин, а затем поднять на следующую координату и начать инъекции снова. Продолжить эту модель пока все координаты г впрыска не вводят. Подождите 2 минуты перед снятием шприца после последней инъекции.
Примечание: Никаких отрицательных эффектов не было отмечено на ткани путем инъекции до 2 мкл вируса на полушария в мозге мыши.
- После инъекции завершается на самом низком Z-глубины, подождите 1 мин, а затем поднять на следующую координату и начать инъекции снова. Продолжить эту модель пока все координаты г впрыска не вводят. Подождите 2 минуты перед снятием шприца после последней инъекции.
- Повторите инъекции для других скважин.
- После инъекции удалите мышь от стереотаксической инструмента и сшить кожу головы с 6-0 шелковыми швами. Применяют лидокаин и антибактериальный крем на рану.
- Вводят 0,8-1,0 мл физиологического раствора + кетопрофен (3-5 мг / кг) с помощью маршрута IP, чтобы управлять болью. Затем поместите мышь в нагретую камеру восстановления. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не вернуть животное в компании других животных, пока он не полностью восстановилась.
- В последующие дни после операции, взвесьте мышь ежедневно и обеспечивают мягкую пищу и лечит. Проверьте рану и обратите внимание на общее состояние / поведение.
- После стереотаксической инъекции, мыши могут быть умерщвлены для среза преп электрофизиологии 1 или перфузию и их мозг удаляли, нарезанный и окрашивали с помощью иммуногистохимии для анализа 10.
Representative Results
После "Протокол для разработки Руководство Strand (sgRNA) для CRISPR / cas9 ретровируса", олигонуклеотиды таргетингом конкретную последовательность встраивают в PXL клонирующий вектор вниз по течению промотора hU6 и после направляющей РНК эшафот с использованием сайтов клонирования BbsI (рис 1, этап 1). Это sgRNA затем вырезают из PXL и вставляется в основной цепи pRubi , используя сайты BstBI и Пачи (рисунок 1, шаг 2). Наконец, еще один sgRNA клонировали в PXL может быть размещен ниже по потоку от первой направляющей в pRubi-Guide1 (Рисунок 1, стадия 3), нацеливание другую область гена и увеличивает шансы на нокаут через NHEJ. Проверка правильности конструкций, должны быть определены с помощью анализа последовательности. После того, как эта конструкция выполнена, она может быть упакована в вирус после "Протокол для ретро / Lentiviral производство- CaPO4 метод». Успешная упаковка подтверждается инфекцией вируса в клетках НЕК293, чтобы титровать клиновойирус. Если нет, то выражение флуорофор скорее всего, была ошибка во время упаковки вируса.
Рисунок 2 является представителем результатом 2 ретровирусы, одного , выражающего GFP и другой , выражающей mCherry, совместно вводили в зубчатую извилину у новорожденных мышей (7 дневного возраста) и 21 отображены дней после инъекции. Маркировку нейронов с mCherry или GFP позволяет морфологическая оценка различных генетических манипуляций в той же ткани, где один вирус может выразить CRISPR / cas9 опосредованного KO, а другой вирус управления, выражая исключительно флуорофор. Стереотаксическая инъекция позволяет точно анатомическую селективность, как продемонстрированные дискретной инфекции предполагаемых координат, зубчатой извилине. При анализе участков мозга для инфекции, важно держать окружающих тканей до тех пор, пока не будет установлено, что правильная анатомическая область была заражена. Если нет признаков инфекции, то возможно, что инъекции произошел в соседнем регионе А.Н.d могут быть идентифицированы в окружающих участках. Она также может быть полезно, чтобы найти иглы трек, чтобы найти точную область инъекции. Вирусы pseudotyped VSVg редко распространяются из окраин зубчатую извилину при введении в естественных условиях, и имеют тенденцию распространяться вдоль ростральных / каудальной оси инфицировать клетки вдоль всей зубчатую извилину, как было проанализировано с помощью 3D реконструкции (рисунок 3).
Рисунок 1:. Клонирование стратегия для ретровирусов pRubi-Guide1-Guide2-CRISPR плазмиды Эта стратегия идентична для ФУ на основе лентивирусов плазмид. sgRNA олигонуклеотиды отжигают и встраивают в PXL , используя сайты клонирования BsbI. После того, как секвенирование , чтобы гарантировать , что sgRNA успешно вставлен в PXL, переваривают плазмиду с BstBI и PacI. Вкладыш, который выпал из (черный ящик), затем клонировали в вирусный обратно бодин (черный пунктирные линии) pRubi-Guide1 CRISPR. Второй sgRNA также могут быть вставлены в PXL и переваривают с помощью фермента PacI. Это затем клонировали в вектор CRISPR pRubi-Guide1 (красные пунктирные линии) с помощью сайта PacI. Затем полученную плазмиду содержит обе нити направляющие, а также необходимые вирусные элементы, промоутеров и флуорофоров. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Ретровирусное инъекция мыши зубчатой извилине ретровирусы , выражающие mCherry (красный) или GFP (зеленый) вводили в зубчатую извилины p7 мыши. 21 дней спустя мыши были перфузию и мозги секционного и окрашивают для GFP и mCherry. (A) 5х широкоугольным поле флуоресцентное изображение показывает прecision зубчатой извилины инъекции и специфичность маркировки зубчатыми нейронов извилине гранул. Морфология гиппокампа можно увидеть через (синий) окрашивания Dapi. Шкала бар измеряет 200 мкм. (В) , 10 - кратный широкоугольный поле флуоресцентное изображение показывает , что эти высокие лентивирусов титр заражать большое число клеток, морфология которых можно получить с помощью выражения флуорофора. Шкала бар измеряет 100 мкм. (C) Вирусы , экспрессирующие GFP или mCherry были совместно вводят в зубчатой извилине. Используя систему ретровирусов, можно использовать один вирус для того чтобы сделать один генетических манипуляций, отмеченный GFP и другим манипуляциям, отмеченного mCherry, а затем оценить одну или аддитивных изменения из-за каждого вируса. Шкала бар измеряет 10 мкм.
Рис . 3: Анатомический распространение лентивирусов инъекции стереотаксическая соинжекцию вируса GFP-shPten и контрольного вируса mCherry в мозг взрослого PTEN LoxP / + мышь привела к вирусным разбросанным по всей ростральной / каудальной оси зубчатую извилину гиппокампа. Это показано в 3D - реконструкции степени инжекции , в котором замкнутые контуры вирусного распространения были прослежены в течение 21 последовательных секций (Z = 50 мкм / раздела) , с использованием программного обеспечения восстановления. Контурные обводка затем выравниваются для создания 3D-изображений для объема количественной оценки. Общее распространение вируса показан зеленым цветом (объем = 54730800 мкм 3) и распространение зубчатая локализованы показан в фиолетовый (объем = 27275200 мкм 3). Вирус распространяется вдоль траекторией иглы и мозолистого на пересечении траекторией иглы в дополнение к заполнению ростральной / каудальной оси зубчатую извилину. Шкала бар измеряет 200 мкм.
ле / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Справочная Видео 1. Проектирование sgRNAs для клонирования в ретровирусов и лентивирусов позвоночника.
В этом синтетический руководство РНК (sgRNA) конструкции, например, геномная последовательность CHD8 мыши загружается из NCBI. Стартовый кодон и структура экзон затем визуализируется в Vector NTI. Это позволяет копировать геномную область вокруг первого экзона кодирования и ввести эту последовательность в Benchling. Benchling позволяет визуализировать все потенциальные sgRNAs в регионе. Кроме того, после того, как указывает на геномную область у нас есть вход, Benchling покажет нам баллы по-мишени и вне мишени для каждой направляющей РНК. После этого пользователь может выбрать направляющую РНК с самым высоким и офф-мишени баллов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Discussion
Есть несколько важных шагов, которые имеют важное значение для успешной вирусной упаковки. здоровье Ячейка имеет решающее значение до и во время трансфекции, как нездоровое клетки значительно уменьшит количество вируса производится. Если трансфекцию и упаковки успешны, то 100% клеток должны выразить флуорофора и клетки должны образовывать функциональный синцитий. На шаге 3.2.4, коснувшись трубу необходимо для высокого титра трансфекцией эффективно, и рН HEPES-буферном солевом растворе, должно быть точным. Макси-Preps, которые производят плазмид, необходимые для вирусной упаковки должны быть очень чистыми. С этой точки, полезно в этанол осадить окончательное элюирование ДНК и повторно приостанавливать в буфере Трис-ЭДТА. Кроме того, очень важно, чтобы уменьшить количество сыворотки на 2% или менее, в средствах массовой информации о том, что кофеин добавляется к на 6-й день (этап 3.4) перед вирусной коллекции. Если сыворотка не уменьшается, а затем окончательно очищенный вирус будет содержать нежелательный количество сыворотки PROTEin. Применение полиэтиленгликоля 6000 при осаждении вирусных частиц исключает необходимость ультрацентрифугирования. Важно также отметить, что cas9 CRISPR, содержащие вирусы, как правило, имеют титр около 10 раз меньше, чем вирусы, содержащие только флуорофор.
Для стереотаксической хирургии, использование вдыхаемого анестезии позволяет быстро и точно контролировать или сознание животного по сравнению с инъекционными анестетиков и позволяет анестезии в более широком диапазоне возраста. Очень важно, чтобы держать хирургические инструменты чистыми и стерильными, и воспроизводимое нацеливание требует точного позиционирования головки. Убедитесь, что нет качка или прокатка головы в стереотаксической инструмента и что череп чувствует себя твердо на месте. Это может быть полезным, чтобы позволить череп высохнуть, чтобы найти швы, чтобы определить стереотаксической координаты. Кроме того, скорость и объем для каждого стереотаксической координат должны быть определены эмпирически.
Этот метод ограничивает в том, что распространение в lenti- или ретровируса ограничено, особенно по сравнению с аденосателлитные вирусами (AAVs) .Therefore, эти вирусы являются ценными при заражении дискретную область мозга, но не для общей инфекции, связанные с AAVs используется для анализа поведения у животных. Использование кофеина в этом протоколе значительно повышает титр этих вирусов, но они все еще не так высок, как титрами, достигнутыми в AAV упаковке. Кроме того, стабильная интеграция является лишь преимуществом выражения флуорофора, так как CRISPR / cas9 образует стабильные геномные редактирует даже при трансфицированы, и возможно, что продолжающийся экспрессию cas9 и sgRNA могут в конечном счете привести к возникновению посторонних целевых эффектов. Переходная выражение CRISPR / cas9 система с AAVs достаточно для получения геномных изменений, которые распространяются по всему клеточных делений, тем не менее, экспрессия флуорофор не будет поддерживаться.
Создание Lenti- и ретровирусы, использующие / системы cas9 CRISPR будет придавать способность обнаружить любую новый ген в самых разнообразных организмов. Эффективность редактирования гена по-видимому, зависит от последовательности направляющей РНК, нацеленной на расщепление cas9. Эмпирически было установлено, что от 10% до 80% клонов содержат вставкам после того, как секвенирование инфицированных клеток Neuro2A. Это в настоящее время неизвестно, будет ли INDEL частоты, вычисленные в клетках Neuro2A отражают те, в нейронах. Руководство РНК разработки программного обеспечения, такие как Benchling в настоящее время включают в себя "на-мишень" счет, который может быть в состоянии предсказать эффективность данной целевой последовательности. В какой степени такие "по-мишени" забивает надежные потребности быть определены эмпирически в нейронах и других типов клеток, как система CRISPR-cas9 становится все более широко реализуются.
Лентивирус на основе трансгенных животных было успешным переменно с сообщениями, что лентивирусов доставляемого трансгены стать сиlenced 11. CRISPR редактирование опосредованной ген ДНК может быть пропущен через зародышевую линию, чтобы генерировать целые модели на животных. Таким образом, стабильная геномная редактирования может быть достигнута, несмотря на замалчивания вирусными доставляемого флуорофоров и cas9 трансгенов. Это может обеспечить эффективную платформу для целевых геномных изменений. Вирусный поставка CRISPR системы / cas9, в то время как не требующий трансгенных организмов, является дополнением к этим методам. Например, потребители инъекционных таких вирусных частиц в соединение трансгенного животного, которое индуцибельно выражающего Cre и Cre зависимой опто- или химио-генетический трансгены должны способствовать комплексные исследования в взаимосвязи между генетическими манипуляциями и нейронную активность. Вторым примером является доставить эти вирусные частицы cas9 / sgRNA в условном нокаута в попытке скрининга для генно-генных взаимодействий. И, наконец, еще один захватывающий маршрут этого исследования является скрининг фенотипов и терапевтических соединений в клетках пациента происходит, что можетиспользоваться для проверки и обнаружить генетические сети, которые нарушаются при различных заболеваниях.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Нинь грант R01MH097949 и Аутизм Говорит Pilot Грант 7359 до BWL и Норрис хлопок онкологического центра оптических изображений Shared Инструментарий Грант P30CA023108.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Cell Culture Reagents | |||
| 293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
| 293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
| Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine solution, 100x (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
| Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene 10 cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| List of Transfection Reagents | |||
| 5 ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS) | 500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
| 0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
| 0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
| 60 cc L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
| polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
| (10x) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
| Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 10 ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
| anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
| Stereotaxic Surgery Reagents | |||
| Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
| Isoflurane | |||
| Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
| artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
| PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
| normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
| cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
| Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
| MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
| 6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 | |
References
- Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
- Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).
- Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
- Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
- Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2015).
- Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
