Summary
CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.
Introduction
normal fizyoloji ve hastalık patolojisinin temel incelemek için, hassas bir model organizmada gen ekspresyonu işlemek için bir ihtiyaç vardır. ilgi konusu bir genetik eleman, bir rekombinaz tarafından tanınan bölgeleri tarafından takviye edilir, burada, memeli bir model organizmalar için, bu, büyük ölçüde oluşturma ve transgenik farelerin gelişimi üzerinde odaklanmaktadır. Bu durum, bu iki yanında bir gen alana özgü manipülasyon neden olabilir. Bu başarılı bir strateji olsa da, zaman ve kaynak yoğun olduğu; Örneğin, bir floxed gen Cre rekombinaz ve Cre raportör geni ifade olan bir üç transjenik hayvan oluşturma çok çiftleşmesi ve onay gerektirmektedir. Bunun aksine, bir replikasyon stereotaksik enjeksiyonu floxed geni hayvana floresan protein ve rekombinazı kodlayan kusurlu viral parçaları, karmaşık genotipleme veya üretme stratejilerinin 1 gerektirmez. virüs eksprese eden bir floresan protein ve Cre ise Bundan başka, ikinci bir virüs Enco ile birlikte enjekte edilirDing, farklı bir flüoresan proteini, bu hedef genetik manipülasyonu için bir mesafede olan doku kontrolü sağlar. Bu strateji hala knock-in hayvanların kullanılmasını gerektirir iken, viral aracılı RNA temelli stratejiler transgenik hayvanların ihtiyacını aşmak. Örneğin, bir flüoresan protein ve kısa bir saç tokası RNA (shRNA) kodlayan replikasyon eksikli virüsleri stereotaksik enjeksiyonu ilgi konusu bir genin kopyasının güçlü bir azalmaya neden hücrenin endojen RNAi amaçlı kullanılabilir. Ancak, shRNA stratejileri genellikle mütevazı hücresel fenotipleri 2 sonuçlanan ince gen knock-çıkışlar üretir. bir knock-down daha fizyolojik heterozigot gen disfonksiyonu hakkında olsa da, onun azalmış sağlamlığı bir knock-out ile karşılaştırıldığında yeni genlerin fenotipik keşif için ideal değildir.
Son zamanlarda ortaya çıkan üçüncü bir tekniktir, ilişkili CRISPR-(Düzenli interspaced Kısa palindromic Tekrar Kümelenmiş) CRISPR / Cas9 (Protein 9) sistemi, bir küçük dışsal RNA ve DNA kesme enzimi hem ekspresyonuna dayanır. CRISPR / Cas9 sistemi yabancı tanımlayan virüs DNA istila ve Cas9 enzimi 3,4 vasıtasıyla bozulmaya için hedeflenmesi için bir yöntem gelişti prokaryotik bağışıklık sistemi için uyarlanmıştır. Bu güçlü genom düzenleme tekniği hedeflenen silmeler, girmeler ve mutasyonları oluşturmak için kullanılabilir; Aşağıdaki protokol, in vivo ifadesini nakavt için ilgi konusu bir gen silme işlemi yapmak için nasıl özetleyecek. Cas9 enzimin bir skafold RNA ile ilgili bölge ile homolog ve bitişik bir kılavuz RNA ile ifade edilmelidir. Bu tekniği kullanarak bir genin nakavt sentetik kılavuz RNA'lar (sgRNA) kullanarak genomunda belirli bir bölgeye Cas9 hedefleyen ve ilgi yerinde çift iplikli sonları (DSBs) indükleyici gerektirir. Bu DSBs sonra homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) hangi le yoluyla endojen hücre onarım makine tarafından tamir ediliryanlış anlamlı veya anlamsız mutasyon üretebilir ve bu nedenle fonksiyonel protein ifade 5 kaybına oluşturabilirsiniz indellerin reklam. Bu sistem genomik değişiklikler üretir, çünkü sadece Cas9 ve sgRNA geçici ifadesini gerektirir. sabit bir flüoresan göstergesi bu şekilde manipüle hücreleri ve soyu tespit etmek için Ancak, arzu edilir.
Lenti- ve retrovirüsler kararlı bir şekilde, uzun süreli ekspresyonunu korumak ve mitoz sırasında yavru hücrelere aşağı geçirilir konakçı hücrelere, ilgi konusu DNA'yı entegre avantajına sahiptir. Bu protokol tasarım ve replikasyon kusurlu hale, yüksek titre retrovirüslerin iki tip üretimini tarif etmektedir: insan bağışıklık eksikliği virüsü kaynaklı lentiviral partiküller (lentivirüs) ve murin Maloney Lösemi virüsü (retrovirüs) dayananlar. Bu virüslerin her iki stabil büyük transgenlerin ifade destekleyebilen olsa da retroviral parçacıklar, sadece genomun du entegre olabilirBu nedenle nükleer zarfın bozulması ve halka hücre bölünmesi bir etiket aracı ve doğum tarihini hücreleri 6 olarak kullanılabilir. Lentiviruses viral toplama sırasında kafein 8 kullanımı dahil nispeten düşük titre 7, bu metodoloji, olduğu için bir üne sahip olsa da, rutin 10 9 ve 10 10 parçacıklar / ml titreleri üretir. lenti- ve retrovirüsler diğer bir avantajı, çok büyük parçaları için tolerans. protokolleri takip toplama flüoresan raportör, sgRNAlardır ve Cas9 DNA değiştirme gibi bir flüoresan proteini ifade etmek üzere CRISPR / Cas9 sistemi kullanmak için kodlayan bir lenti tasarımı veya retrovirüs prosedürü özetlenmektedir.
Fare stereotaksik nöroşirürji morfolojisi, fonksiyon ve enfekte nöronların bağlantı incelemek için in vivo virüs enjekte etmek için değerli bir yöntemdir. nöronlar viral enfeksiyonun tim uzun bir süre boyunca ifade seviyelerini değiştirmek için kullanılabilirBu gelişim boyunca e, ve sentezleme tam olarak çeşitli ilaç uyarılabilir sistemler ve spesifik Cre tahrik ifade kullanımı ile kontrol edilebilir. Bu özel protokol bir yetişkin fare beyninde ilgilenilen geni nakavt bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs enjekte açıklar. Fareler 48 saat sonrası enjeksiyon içinde görülebilir, viral transgenin bu prosedür ve ifadeden çok hızlı iyileşir. Bununla birlikte, florofor sentezleme 3 hafta sonrası enfeksiyon yakınındaki maksimal seviyeleri ile sonuçlanan hafta boyunca arttırır. Viral stereotaksik enjeksiyonu tabi Fareler davranış, elektrofizyoloji, ya da morfolojik çalışmalar için de kullanılabilir. Genel olarak, bu prosedürlerin amacı stereotaksik cerrahi ve belirli bir sgRNA ve Cas9 ifade eden bir virüs kullanılarak yetişkin fare beyninde bir gen nakavt nasıl göstermektir.
Protocol
Etik Beyanı: Tüm protokoller Dartmouth Kurumsal Biyogüvenlik ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi inceleme kurulları tarafından onaylandı.
CRISPR / Cas9 Retrovirus için bir kılavuz Strand (sgRNA) Tasarımı 1. Protokol
NOT: (https://benchling.com/ ve http://crispr.mit.edu/) ilgilenilen geni hedef sgRNAlardır oluşturmak için kullanılabilecek birçok kar amacı gütmeyen web siteleri vardır. Bu protokolün amacı, tasarım ve birbirlerine tavlanır ticari bir satıcıdan tek sarmallı oligos sipariş etmektir. Bu tavlanmış oligo PXL transfer vektörüne lige olacaktır. Benchling kullanarak tasarım sgRNAlardır bir örnek için ek bir video 1 Bkz.
- sgRNAlardır tasarlamaya adamıştır bir web sitesini kullanın.
NOT: Örneğin, sitenize entegre ilgilenilen genin başlangıcından yakın bir kodlama / egzonik dizisi giren 20 nükleotid sgRNA üretecektir. duyu ve anti-duyu oligo tasarım 20 nükleotid sgRNA dizisini kullanınsgRNA oluşturmak için sipariş edilecektir s. - sgRNA oluşturduktan sonra, bir kelime işlemci içine bu diziyi kopyalayın. Zaten bir (yani, G-20 nükleotid sgRNA dizisi) ile başlayan yoksa belgedeki 20 nükleotid sgRNA dizisinin başlangıcına kadar bir G (guanin) ekleyin. Bu U6 organizatörü kapalı iyi transkripsiyonu sağlamak için gereklidir.
- Bu şimdi 20-21 nükleotid dizisinin ters tamamlayıcı belgeler. Sens oligo için, doküman (örneğin, OAKK-G-20 nükleotid sgRNA sekansı) dizisinin 5 'ucuna "OAKK" ekleyin. Bu çıkıntı PXL vektörüne sekansı bağlanması için kullanılır.
- antisens oligo için, 5 'ucuna ürün karması için AAAC ekleyin. PXL vektörüne sekansını ligate etmek Bu çıkıntı kullanın.
- sens ve antisens oligos edinin. oligos aldıktan sonra, DNAse ücretsiz su kullanarak 100 uM stokları yapmak. 4 mikron ile birlikte 10 ul 100 mcM sens ve antisens oligo her karıştırın10x NEB tamponu 2 ve su 16 ul l.
NOT: (BBSI çıkıntılar uyumlu olmayan yapışkan uçları gibi) Bunlar sayfa saflaştırma veya 5'phosphorylation gerekmez.- daha sonra, bir köpük "Şamandıra" tutucu Bu karışımını içeren tüp şamandıra, 500 ml'lik bir beher içinde, bir kaynama noktasına 200 ml su getirin. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile 95 ° C arasında yavaşça soğuk su izin verin.
- steril su içinde 1.000 aşağıdaki ligasyon içerisinde hemen kullanmak veya -20 ° C de geriye kalan reaksiyon depolamak: Şu anda tavlanmış-oligo karışımı 1 seyreltin.
- Özet pxl, 2 saat boyunca 37 ° C'de BBSI kısıtlama enzimi ile PX330 vektörü türevi. pxl 2 ug, Bbs1 ve denge su 10x NEB tamponu 2, 1 ul 4 ul ihtiva eden bir 40 ul reaksiyon kullanın. ticari bir kit kullanılarak, rutin jel saflaştırma ile sindirilmiş-pxl Konu. verim 8.5 kB ürün ~ olduğundan emin olun.
- 1000: Bir ticari ligasyon kiti kullanılarak, 1 1 ul Artersindirilir ve jel saflaştırılır-pxl 50 ng ile tavlanmış-oligo. E. yoksun yetkili rekombinasyon içine ligasyon ürünü Dönüşümü E. coli (NEB 5-alfa, klonlama verimlilik). plazmid DNA'smm, dizilişiyle doğru kılavuz varlığı için transformantların koruyucu.
- BstB1 ve Pac1 kısıtlama enzimleri kullanılarak pxl üzerinden U6, kılavuz teli, ve RNA iskele elemanları (sgRNA) sindirmek ve aynı kısıtlama enzimleri ile sindirilmiş floresan protein-T2A-Cas9 viral omurgasına ligate. ligasyon ürünü (NEB 5-alfa maksimum verimlilik) Transform. floresan protein-T2A-Cas9 viral omurga plazmid düşük kopya plazmid ve böylece düşük kopya protokoller kullanılmalıdır.
Not: İkinci bir sgRNA Benzer bir pxl kılavuz şerit plazmid Pacl sindirimi ile kişiye ve Pac1 lige edilebilir sindirilen ve dana bağırsak fosfatazı önce ilk kılavuz teli ihtiva eden viral omurga işlemden geçirildi. Viral aktarım plazmid fosfataz tedavisi yardımcı olurikinci bir kılavuzun içermeyen plazmitler kendi kendine bağlanmasını gelen transformantların sayısını azaltır. - Sıra Nucleobond Xtra maxi hazırlık kiti kullanılarak nihai plazmid ve maksi hazırlık doğrulamak ve şu "Retro / lentiviral Üretim Protokolü - CaPO4 Metodu" kullanılarak bir virüs içine paket.
2. Transfeksiyon için 293FT / 293GP Hücreleri hazırlayın (Retro / lentiviral Üretim - CaPO4 Yöntemi)
- (Gün 1) hızla 37 ° C su banyosu içinde 10 cm hücre kültürü plakasının her hücre 1 şişe çözülme. lentiviral ambalaj için 293FT hücreleri kullanır. retroviral ambalaj için 293GP (gag / pol) hücreleri kullanın.
- 15 ml konik bir tüp içine cryo tüpten çözülmüş hücrelerinin her pipet ve önceden ısıtılmış CO2 dengelenmiş tamamlama Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı 2 ml.
- 500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje hücreler pelet. Süpernatantı aspire ve tam mı 10 ml hücre peletKoy adlı Dulbecco'nun Orta Modifiye. 10 cm hücre kültürü çanak üzerine hücreleri Plate. % 5 karbon dioksit kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri.
- (Gün 2) kaplama 24 saat sonra, mevcut medya aspirasyon ve plaka önceden ısıtılmış Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 10 ml ilave edilerek plaka ortamı değiştirmek.
- 24-48 saat medya değişiminden sonra ve hücrelerin bir kez (Gün 3-4), birleşik haline / plaka (10 cm plaka) 2.5-3.0 x 10 6 hücre birleştirilmek üzere hücreleri bölme.
- Hücreleri bölmek için, medya aspire ve PBS 5 ml ile plaka yıkayın. levhaya% 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve hücreler, plaka duruma gelinceye kadar 37 ° C'de inkübe edin. % 0.25 tripsin reaksiyon nötralize etmek ve 1.5 ml tüp içine hücreleri pipet Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 0.5 ml ilave edilir.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri dönerler. Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 1 ml hücrelerin tekrar. 10 seyreltin81; PBS 90 ul hücre l. Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı ile yeniden plaka 2.5-3.0 x 10 6 hücre / levha.
NOT: Hücreler kaplama sonrası% 50 konfluent 24-34 saat ~ olacaktır. onlar ~% 50 konfluent olduğunda hücreleri transfekte.
3. (Gün 5) CaPO4 Transfeksiyon ve Viral Parçacık Koleksiyonu
- Mevcut ortamı aspire ve önceden ısıtılmış Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 10 ml ekleyerek, transfeksiyondan önce ortam 2 saat değiştirin. 10 cm plaka medya 10 ml tam olduğundan emin olun.
- 2, 5 ml'lik yuvarlak dipli polistiren tüpler kullanılarak 2 yemekleri için transfeksiyon reaktifleri hazırlayın. İlk tüp "DNA" ve ikinci tüp "2X HBS" etiketleyin. pH 7.4'te Tris-EDTA / ul 1 | ig DNA konsantrasyonu ayarlayın.
- lentivirüsler, yavaş yavaş transfer vektörü 20 ul (vira ekleyinÇevrede l yapısı), CMVdelta8.9 13 ul, VSV-G 9 ul, moleküler biyoloji sınıf H2O 860 ul ve ilk boru ( "DNA"), 2.5 M CaCI2, 100 ul, sürekli çekme sırasında tüp karıştırın.
- retrovirüslerin için CMVdelta8.9 plazmid ihmal. "DNA", etiketli bir tüpe 20 ul transfer vektörü, 15 ul, VSV-G, 860 ul Molecular Biology Grade H2O ve 100 ul 2.5 M CaCI2 ekleyin.
- 2x HEPES tamponlu tuz 1 ml ekleyin (pH 7,0; bu pH değeri kesinlikle önemlidir) "2X HBS" etiketli tüpe.
- Yavaşça, "2X HBS" tüp bir defada bir damla "DNA" tüp 1 ml içeriğini ekleyin. "DNA" tüp içeriği eklerken sürekli olarak dizin veya orta parmakla "2X HBS" tüp dokunun. Her damla sonra ortaya CaPO4 veziküller gözlemleyin. Oda sıcaklığında, 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe tüpü.
- gece boyunca, 37 ° C inkübe edilir, her biri 10 cm hücre plakasına yavaş damlalar halinde transfeksiyon 1 ml ilave edilir.
- (Gün 6) Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı +% 0.5 FBS 8 ml ve 40 mg kafein / 100 mi ortam ile değiştirin. transfer vektörü bir flüoresan işaretleyici içeriyorsa, florofor sentezleme başarılı bir transfeksiyon gösterir.
- (Gün 7) 10 mi serolojik pipet kullanılarak viral partikülleri ihtiva eden ortam toplamak ve 50 ml konik bir tüp içine dağıtın. 4 ° C'de 50 ml konik tüp saklayın. Her plaka için% 0.5 FBS ortamı 8 ml ekleyin.
- (Gün 8) Yine, viral partikülleri içeren medya toplamak ve 50 ml konik tüp önceki günkü hasat ile birleştirir.
4. Yoğunlaşma ve Virüs saflaştırılması
- 2 O GKD'li% 40 polietilen glikol 6000 ve 1.5 M NaCI eklenerek 5x polietilen glikol 6000 çözeltisi yapmak üzerinde çözüm Otoklav121 ° C 'de 45 dakika süre ile, sıvı döngüsü. soğutma sırasında yavaş yavaş çözeltiye karıştırılır.
NOT: Çözelti bulutlu başlatmak ve soğur sonra belli olacak. - çözünmeyen malzemenin pelet amacıyla 10 dakika boyunca 2,000 x g'de viral süpernatan iki koleksiyon ihtiva eden 50 ml konik tüp santrifüjleyin. 0.45 um düşük protein bağlama şırınga filtresinden (PES veya PVDF) içinden süzme ile, viral ortamı saflaştınlır.
- 5x polietilen glikol kullanarak ortamına 6000 solüsyonu ilave edin (nihai konsantrasyon% 8 polietilen glikol 6000 ve 0.3 M NaCl olmalıdır). Tüp birkaç kez (vorteks yapmak) ters çevirerek karıştırın. zaman zaman yeniden karıştırma, 12 veya daha fazla saat boyunca, 4 ° C de, viral ihtiva eden polietilen glikol çözeltisi inkübe edin.
- (Gün 9) santrifüj 45 dakika boyunca 2500 x g'de viral ihtiva eden polietilen glikol çözeltisi. Süpernatantı çıkarın ve atın ve 2 dakika için tekrar döndürün. Yine, kaldırmak ve supernatant atın.
- 320 ul ekleyerek peletSteril bir fosfat tamponlu tuzlu su ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (320 ul, 1/100 toplanan virüs ihtiva eden ortam orijinal hacminin th). İsteğe bağlı olarak, 30 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında pelletini.
- Pelet yeniden süspansiye sonra kısım virüsü (5-10 ul, 0.5 ml başına tüp) ve -80 ° C'de (önemli ölçüde titresi azaltacaktır 4 ° C'de çözülme veya depolama dondurma) alikotları dondurma.
- Örneğin, standart protokoller kullanılarak virüs titresi, HEK293T hücreleri, 6 gözlü bir plakanın üzerine bir seyreltme serisi yerine elle 48 saat sonra, floresan kolonileri sayın.
CRISPR Virüs 5. Test Etkinliği
NOT: Aşağıdaki adımları kullanarak Dizi klonlar fare Neuro2A hücrelerini kullanarak NHEJ tarafından onarılan çift iplikli kırılmalara üretimi için test etmek. Bu modifiye edilmiş hücrelerin yüzdesi ve niteliğini belirlemek için kullanılabilir olması ile Surveyor testlere göre avantajıNHEJ kaynaklanan indellerin arasında.
- örneğin, Matrigel olarak Coat jelatinimsi protein karışımı ile 3.5 cm hücre kültürü çanağı Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı içinde 1:50 seyreltilmiş ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir. jelatinli protein karışımı aspire ve Neuro2A hücreleri plaka.
- Neuro2A hücreleri% 50 kaynaşmaya eriştikten sonra, 10 enfeksiyon çokluğunda CRISPR lentivirüs veya retrovirüs ekleme (örneğin, hücre başına 10 viral partiküller).
Not: HEK293 hücreleri gibi Neuro2A hücreleri enfeksiyonu için sevimli değildir, bu nedenle, tek bir enfeksiyon hücreleri lentivirüs ile enfekte olma 100% neden olmaz. Dahası, retrovirüs sadece bölünen hücreler enfekte ve bu nedenle de% 100 enfeksiyona neden olmaz. enfeksiyonun neredeyse% 100 oranına ulaşmak için, virüs ilavesi gerektiği gibi hücreler bölme, birden fazla gün tekrar edilebilir. Alternatif olarak, floresan pozitif hücreler, floresan aktive hücre sıralama kullanılarak izole edilebilir. thBir lentivirüsler ile% 100 enfeksiyon oranını elde etmek için, e en etkili yolu FACS izolasyonu, ardından tek bir enfeksiyon yapmaktır. Bir retrovirüs için 24 saat arayla enfeksiyon 4-mermi gerçekleştirmek ve% 100 enfeksiyonu sağlamak için FACS izolasyonu ile izleyin. - 1 hafta için hücrelerin enfekte sonra, 10 cm'lik bir tabakta yakınındaki izdiham hücreleri genişletmek ortamı aspire ve fosfat-tamponlu tuzlu su, 5 ml plakayı yıkayın. % 0.25 tripsin 1 ml ilave edilir ve hücreler, plaka duruma gelinceye kadar 37 ° C'de inkübe edin. % 0.25 tripsin reaksiyon nötralize etmek ve 1.5 ml tüp içine hücreleri pipet ve 5 dakika boyunca 500 x g'de topak hücrelere Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, 0.5 ml ilave edilir.
- hücrelerin yeniden askıya ve 95 ° C'de inkübe, 50 mM potasyum hidroksit 100 ul ekleyin, DNA'yı izole etmek 5 dakika boyunca ° C. 1 M Tris, pH = 8.0, 10 ul kullanılarak çözelti nötralize.
- PCR CRISPR sgRNA hedef genomik bölgeyi çevreleyen bölgeyi genişletenkullanarak ~ DNA 300 ng yüksek sadakat PCR master karışımı 4 kullanarak adım 5.5 izole edilmiştir.
- Bu tür bir jel DNA kazanım kiti gibi bir% 2.5 agaroz jel ile jel jel saflaştırma kiti kullanılarak uygun bir ebada sahip parça saflaştırmak üzerinde PCR reaksiyonu şu koşullarda yürütülmüştür. PGEM-T kolay şekilde, bir PCR klonlama vektörü içine bağlanır ve yetkin hücreleri 9 dönüşür.
- 24 saat sonra, 15 ml yuvarlak tabanlı bir boru gibi uygun bir antibiyotik (ampisilin, neomisin, vs.) halinde LB suyu 2 ilave edin. LB-plaka tek bir koloni seçmek için steril bir pipet veya döngü kullanarak bireysel kolonisi ile tüp inoküle edin. Expand 250 RPM, 24 saat boyunca 37 ° C'de tüp çalkalanarak koloni büyür. istenildiği kadar koloni için tekrarlayın.
- Mini hazırlık kiti kullanılarak, E. DNA izole E. coli ve fare genomu Cas9 hedef bölgeyi analiz etmek için sgRNA hedef genin alan amplifiye etmek için tasarlanmış primerler ile sekansı.
Yetişkin fare 6. Stereotaksik enjeksiyon Protokolü
- Cerrahi için hazırlanın
NOT: hayatta kalma ameliyatları sırasında steril koşulları sağlamak için önemlidir. Bu enjeksiyon bölgesini sterilize etmek için betadin kullanarak, cerrahi aletleri sterilize ve kapatıldıktan sonra kesi sitesine antibiyotik merhem ekleyerek ısı bu protokolde gerçekleştirilir. Steril eldiven yanı sıra iyice sterilize, özel cerrahi alanı kullanmak da önemlidir.- Isı Sterilize cerrahi aletler otoklav veya bir kullanarak sıcak boncuk sterilizatör biri tarafından kullanılmadan önce. cerrahi ve kurtarma sırasında vücut ısısını korumak için ısıtma pedleri açarak kurtarma odasına ve cerrahi alanını hazırlayın. Enjeksiyon için kafatasında delik oluşturmak için kullanılan matkap birleştirin.
- Yük steril PCR tüpü doğrudan virüsü çekerek enjeksiyon iğnesinin içine virüs 4 ul. Kısaca buz viral numuneyi çıkarın. virüs koruyunenjeksiyondan önce en fazla 1 saat boyunca oda sıcaklığında şırıngada.
7. Stereotaksik Enjeksiyon
- cerrahi paketine havalandırma uygun hava akışını sağlamak için açık olduğundan emin olun. indüksiyon odasında izofluran% 4 ile anestezi ile ameliyat için fare hazırlayın. Anestezi ardından, enjeksiyon sitesi hazırlamak için başını tıraş.
- dilini aşağı taşımak için cımbız kullanarak ve yan stereotaksik alet fare yerleştirin. dişler, daha sonra, yuvaya açılan kulak çubukları emniyete kadar ağzına lokma çubuğunu yerleştirin. fare vücut ısıtma yastığı ve burun burun konisi yer olduğundan emin olun. burun konisi içine doğrudan% 4 izofluran. Cımbız ile ayak kısma ve hiçbir irkilme refleksi olduğunu sağlayarak anestezi onaylayın.
- gözleri yağlamak için yapay gözyaşı uygulayın. Finish pov dönüşümlü mermi ile traş kafa sürüntü ile enjeksiyon bölgesini hazırlamakidone-iyot ve lidokain.
- Bir neşter kullanılarak, kafa derisi merkezi boyunca küçük kesi kesti. bregma görselleştirmek yardımcı olmak için gerekirse bir çubukla ve hidrojen peroksit ile kafatası kurulayın.
- Diseksiyon kapsamı kullanarak, kafatası üzerinde bregma bulmak ve bregma üzerine matkap ucu yerleştirin. Sıfır (veya kaydın) x, y ve z uçakları üzerinde dijital stereotaktik koordinatlar.
- Baş y ekseni kaudal rostral seviye olduğundan emin olmak için, lambda üzerine matkap ucu yerleştirin ve z koordinat bregma ve lambda hem de kabaca eşit şekilde kafasını seviyesi.
- Baş X ekseni üzerinde düzeyde olmasını sağlamak için, y = 1/2 lambda matkap ucu yerleştirin. z koordinatı emin olun sutur her iki tarafında (x = +/- 1 mm) 1 mm eşittir. bir fark olup olmadığını kafatası ayarlayın ve sol lambda sağındaki 1mm de z koordinatı.
- İstenilen koordinatlar üzerinde matkap yerleştirin. dentat girus için, koordinat kullanınsy bregma ve x = +/- 1.1 -1.9 =. Sondaj öncesi, sonra yavaş yavaş ve dikkatli bir şekilde, kafatası yoluyla matkap,% 2 izofluran indirin.
- tüm delik sonra, stereotaksik alet üzerine doldurulmuş şırınga yapıştırın. Görme delik üzerinde şırınga merkezi ve z kafatası koordinat sıfır.
- Yavaşça derin z-derinliği şırınga indirin. dentat girus için, z derinlikleri -2.5, -2.4 ve -2.3 vardır. stereotaksik enjektör ile 0,25 ul / dakikalık bir oranda enjekte başlayın.
- Enjeksiyon düşük Z-derinlikte tamamlandıktan sonra, daha sonra koordinat sonraki yükseltmek ve tekrar enjeksiyon başlar, 1 dakika bekleyin. Tüm z-enjeksiyon koordinatları enjekte kadar bu modeli devam edin. son enjeksiyondan sonra şırıngayı çıkarmadan önce 2 dakika bekleyin.
NOT: Hiçbir yan etki fare beyninde yarımkürede başına virüsün 2 ul kadar enjekte ederek doku üzerinde not edilmiştir.
- Enjeksiyon düşük Z-derinlikte tamamlandıktan sonra, daha sonra koordinat sonraki yükseltmek ve tekrar enjeksiyon başlar, 1 dakika bekleyin. Tüm z-enjeksiyon koordinatları enjekte kadar bu modeli devam edin. son enjeksiyondan sonra şırıngayı çıkarmadan önce 2 dakika bekleyin.
- Diğer delik enjeksiyon tekrarlayın.
- Enjeksiyon sonrası, stereotaksik cihazdan fare kaldırmak ve 6-0 ipek dikişlerle kafa derisi sütür. Lidokain ve yaraya bir anti-bakteriyel krem uygulayın.
- ağrı yönetmek için IP yoldan 0.8-1.0 ml serum fizyolojik + ketoprofen (3-5 mg / kg) enjekte edilir. Sonra ısıtılmış kurtarma odasına fare yerleştirin. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete hayvan iade etmeyin.
- cerrahi sonrası günlerde, günlük fare tartmak ve yumuşak gıda ve davranır sağlar. Yarayı kontrol ve genel durumu / tavır not edin.
- Stereotaksik enjeksiyonu takiben, fareler dilim hazırlık elektrofizyoloji 1 ötenazi veya perfüze ve beyinleri çıkarılmış, dilimlenmiş ve analiz 10 immünohistokimya yoluyla lekeli olabilir.
Representative Results
Belirli bir hedefleme sekansı oligo alt HU6 promotörünün PXL klonlama vektörü içine sokulur ve BBSI klonlama siteleri kullanılarak bir kılavuz RNA iskele mansap "CRISPR / Cas9 Retrovirus için bir kılavuz bloğun (sgRNA) Tasarımı Protokolü" izlenerek (Şekil 1, aşama 1). Bu sgRNA sonra pxl kesilmiş ve BstBI ve Pacl siteleri (Şekil 1, Aşama 2) kullanılarak pRubi omurgası içine sokulur. Son olarak, başka bir sgRNA geninin bir alan hedef ve NHEJ üzeri nakavt şansını arttırır pRubi-GUIDE1 (Şekil 1, Aşama 3) ilk kılavuz alt baş yerleştirilebilir pxl klonlanmıştır. Doğru yapıların doğrulanması sekans analizi ile tespit edilmelidir. bu yapı, yapıldığında, "retro / lentiviral Üretim- CaPO4 Yöntem Protokolü" izlenerek virüs içinde paketlenebilir. Başarılı ambalaj v titre etmek için HEK293 hücrelerine virüs enfeksiyonu ile doğrulanırirus. Hiçbir fluorofor ifade yoksa o zaman büyük olasılıkla virüs paketleme sırasında bir hata oluştu.
Şekil 2 2 retrovirüsler, bir ifade GFP ve diğer ifade mCherry temsili bir sonucudur, (7 gün eski) yenidoğan fare dentat girus içine birlikte enjekte ve 21 gün sonrası enjeksiyon görüntülenmiş. mCherry veya GFP ile nöronların Etiketleme sadece bir florofor ifade, bir virüs, bir CRISPR ifade aynı dokuda çeşitli genetik manipülasyonlar, morfolojik değerlendirme / Cas9 aracılı KO ve diğer bir kontrol virüsü tanır. Stereotaksik enjeksiyon amaçlanan koordinatlar, dentat girus ayrık enfeksiyon da gösterdiği gibi hassas anatomik seçicilik sağlar. enfeksiyon beyin bölümleri analiz ederken, o doğru anatomik bölge enfekte olduğu saptanmış kadar çevreleyen doku tutmak için önemlidir. enfeksiyon belirtisi yok ise, o zaman enjeksiyon komşu bölgenin bir meydana geldiğini mümkündürD çevresindeki bölümleri tespit edilebilir. Aynı zamanda tam enjeksiyon bölgesini bulmak için iğne parçayı bulmak için yararlı olabilir. In vivo enjekte ve tüm dentat girus boyunca rostral / kaudal eksen bulaşmasını hücrelere yayılabilir eğilimi zaman 3 boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 3) ile analiz olarak VSVg pseudotyped virüsler nadiren kıvrımlarının marjlarının yayıldı.
Şekil 1:. Retroviral pRubi-GUIDE1-Kılavuzu 2-CRISPR yer plazmid için klonlama stratejisi Bu strateji FU temelli lentiviral plasmidler için aynıdır. sgRNA oligos tavlı ve BsbI klonlama sitelerini kullanarak PXL eklenir. Sıralama sgRNA başarıyla PXL takılı olduğundan emin olmak için sonra BstBI ve Pacl ile plazmid sindiremez. (Kara kutu) dışarı bırakılan insert sonra viral geri b klonlanırbir pRubi-GUIDE1 CRISPR (siyah çizgiler noktalı). İkinci sgRNA da PXL içine yerleştirilir ve Pfalc enzimi kullanılarak sindirilmiş olabilir. Bu, daha sonra Pacl sitesi kullanılarak pRubi-GUIDE1 CRISPR vektörü (kırmızı noktalı çizgiler) klonlanır. Elde edilen plazmid daha sonra kılavuz tellerini yanı sıra gerekli olan viral unsurları, destekleyicileri ve fluorophores hem de içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. MCherry (kırmızı) veya GFP (yeşil) ifade eden fare kıvrımlarının retroviral enjeksiyonla retrovirüsler, P7 fare dentat girus içine enjekte edildi. 21 gün sonra fareler, perfüze edilmiş ve beyinleri kesitli ve GFP ve mCherry için boyandı. (A) 5X geniş alan floresan görüntü pr gösterirdentat girus enjeksiyon ecision ve etiketleme dentat girus granül nöronların özgünlüğü. hipokampus morfolojisi DAPI (mavi) boyama ile görülebilir. Ölçek çubuğu 200 mikron ölçer. (B) 10X geniş alan floresan görüntü bu yüksek titre lentiviruses olan morfoloji fluorofor ifade ulaşılabilir hücrelerin çok sayıda enfekte olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron ölçer. GFP veya mCherry ifade (C) Virüsler dentat girus birlikte-enjekte edilmiştir. retrovirüslerin bir sistemin kullanılması ile bir GFP ve mCherry ile işaretlenmiş bir manipülasyon ile işaretlenmiş bir genetik manipülasyon yapmak için bir virüs kullanabilir, ve daha sonra her birinden kaynaklanan virüsün tek ya da ilave değişiklikleri değerlendirmek. Ölçek çubuğu 10 mikron ölçer.
Şekil 3:. Lentiviral enjeksiyon anatomik yayılması Stereotaksik ko-enjeksiyon GFP-shPten virüsü ve bir yetişkinin beyninin içine bir MCherry kontrol virüsünün PTEN loxP / + fare hipokampusun dentat girus tüm rostral / kaudal ekseni boyunca viral yayılma sonuçlandı. Bu viral yayılma kontür yeniden yazılımı kullanarak 21 seri bölümleri (Z = 50 mm / bölüm) üzerinden takip edildi kapalı olan enjeksiyon ölçüde bir 3D rekonstrüksiyon gösterilir. kontur iz sonra ses ölçümü için 3D görüntüler oluşturmak için uyumlu hale getirilmiştir. Toplam viral yayılım yeşil gösterilir (hacim = 54730800 um 3) ve dentat lokalize yayılması (= 27.275.200 um 3 hacim) mor renkte gösterilmiştir. Virüs iğne izi ve dentat girus rostral / kaudal ekseni dolum yanı sıra iğne izi kesiştiği korpus kallosum boyunca yayılır. Ölçek çubuğu 200 mikron ölçer.
les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Ek Video sgRNAlardır 1. Tasarım retroviral ve lentiviral omurgası içine klonlamak.
Bu, sentetik kılavuz RNA (sgRNA) tasarım örneğinde, fare CHD8 genomik sekans, NCBI indirilir. start kodonu ve ekson yapısı daha sonra Vektör NTI içinde görülür. Bu bize ilk kodlama ekson etrafında genomik bölge kopyalayıp Benchling içine bu diziyi girmek için izin verir. Benchling bize bölgedeki tüm potansiyel sgRNAlardır görüntülemenizi sağlar. Ayrıca, biz girişi var genomik bölgeyi gösteren sonra, Benchling bize her kılavuz RNA hedefine ve off-hedefe puanları gösterecektir. Kullanıcı daha sonra en yüksek içi ve dışı hedefe puanları ile kılavuz RNA seçebilirsiniz. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Discussion
Başarılı viral paketleme için önemli olan bir kaç kritik adımlar vardır. sağlıksız hücreleri büyük ölçüde üretilen virüs miktarını azaltacaktır gibi hücre sağlığı, öncesi ve transfeksiyon sırasında önemlidir. transfeksiyon ve paketleme başarılı olursa, o zaman hücrelerin% 100 fluorofor ifade etmelidir ve hücreler fonksiyonel Sinsityum oluşturmalıdır. Aşama 3.2.4, boru çekme verimli, yüksek titre transfeksiyonu için gerekli olan ve HEPES-tamponlu tuzlu su pH kesin olmalıdır. Viral paketleme için gerekli plazmidler üretmek maksi prepler derece saf olması gerekir. Bu noktaya kadar, son DNA yıkanmasının çökeltilmesi etanol ve Tris-EDTA tamponu içinde yeniden askıya yararlıdır. Kafein, viral alınan güne 6 (basamak 3.4) üzerine ilave edilir olduğu ortam içinde% 2 ya da daha düşük serum miktarını azaltmak için de çok önemlidir. Serum düşük değilse, o zaman son saflaştırılmış virüs serum prot istenmeyen bir miktarda ihtiva edecektirein. polietilen glikol viral partikülleri çökeltme 6000 kullanımı ultra-santrifüj gerekliliğini hariç tutar. Cas9 CRISPR içeren virüsler genellikle sadece bir fluorofor içeren virüsler kat daha az yaklaşık 10 bir titreye sahip olduğunu not etmek de önemlidir.
stereotaksik cerrahi için, inhale anestezi kullanımı enjektabl anestezik kıyasla hızlı ve hassas kontrol veya hayvanın bilincini izin verir ve daha geniş bir yaş aralığında anestezi sağlar. Temiz ve steril cerrahi aletler tutmak son derece önemlidir ve tekrarlanabilir hedefleme kafasının hassas konumlandırma gerektirir. stereotaksik alet ve kafatası sıkıca hissediyor başın gözleyin ya da haddeleme olduğundan emin olun. Kafatası stereotaksik koordinatlarını belirlemek için sütür bulmak için kuruması için yararlı olabilir. Ayrıca, koordine stereotaksik her hızı ve hacim ampirik olarak tespit edilmelidir.
Bu teknik, (AAVler) .Bu nedenle adeno-bağlantılı virüs ile karşılaştırıldığında, bir lenti- veya retrovirüs yayılması özellikle kısıtlı bir ayrık beyin bölgesi enfekte olduğunda, bu virüsler değerlidir, fakat genel olarak bulaşmasına AAVler ile ilişkili değil de sınırlayan hayvanlarda davranış analizi için kullanılmıştır. Bu protokolde kafein kullanımı büyük ölçüde bu virüslerin titresi artar, ama yine de AAV ambalaj elde titreleri gibi yüksek değildir. Ayrıca, geçici olarak transfekte zaman CRISPR / Cas9 istikrarlı genomik düzenlemeler bile formları olarak stabil entegrasyon florofor ifade sadece bir avantaj olduğunu ve bunun mümkün olduğunu devam eden sonunda hedef etkiler kapalı üretebilir Cas9 ve sgRNA ifadesini. AAVler ile CRISPR / Cas9 sistemi hücre bölünmesi üzerinden gerçekleştirilen genomik değişiklik sağlamak için yeterli olan geçici ifade, ancak, flüorofor sentezleme devam edilmez.
len oluşturulmasıTi ve CRISPR / Cas9 sistemini kullanan retrovirüsler organizmaların geniş bir yelpazede herhangi bir yeni genin hedeflenmesi yeteneği vermek olacaktır. Gen düzenleme etkinliği Cas9 bölünmesini hedefleme kılavuz RNA sekansına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Deneysel dizileme Neuro2A hücreleri enfekte sonrası 10 ila% klonların% 80 indeller içeren olduğu tespit edilmiştir. Neuro2A hücrelerinde hesaplanan Indel frekansları nöronların bu yansıtıcı olup bilinmemektedir. Böyle Benchling olarak rehberlik RNA tasarım yazılımı artık belirli bir hedef dizinin etkinliğini tahmin etmek mümkün olabilir bir "on-hedef" puan içerir. Bu tür "on-hedef" puanları daha yaygın uygulanan olur ampirik CRISPR-Cas9 sistemi olarak nöronlar ve diğer hücre türleri belirlenecek güvenilir ihtiyaçlar için ne derece.
Lentivirüs tabanlı transgenik hayvan üretimi lentivirüs-teslim transgenlerin si haline raporları ile değişken başarılı olmuştur11 lenced. DNA CRISPR aracılı gen düzenleme bütün hayvan modelleri oluşturmak için mikrop hattı üzerinden geçirilebilir. Böylece, istikrarlı genomik düzenleme viral teslim fluorophores ve Cas9 transgenlerin susturma rağmen elde olabilir. Bu hedef genomik değişiklikler için etkin bir platform sağlayabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin viral teslimat, transgenik organizmalar gerekmeyen iken, bu tekniklerin tamamlayıcıdır. Örneğin, indüktif genetik manipülasyonlar ve nöronal aktivitenin arasındaki ilişkinin içine karmaşık çalışmaları kolaylaştırmak gerektiğini Cre ve Cre bağımlı opto veya kemoterapi-genetik transgenlerin ifade eden bileşik transgenik hayvana böyle viral partikülleri enjekte. İkinci bir örnek, gen gen etkileşimleri taranması için bir girişim bir koşullu nakavt içine bu Cas9 / sgRNA viral partikülleri sunmaktır. Son olarak, bu araştırmanın bir başka heyecan verici rota hasta türetilmiş hücrelerde fenotip ve tedavi bileşiklerin tarama, hangi can olandoğrulamak ve çeşitli hastalıklarda bozulur genetik ağları bulmak için kullanılabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma R01MH097949 hibe Ninh tarafından desteklenen ve Otizm bwl ve Norris Pamuk Kanser Merkezi Optik Görüntüleme Paylaşılan Enstrümantasyon Grant P30CA023108 Pilot Grant 7359 konuşur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Cell Culture Reagents | |||
| 293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
| 293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
| Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine solution, 100x (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
| Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene 10 cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| List of Transfection Reagents | |||
| 5 ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS) | 500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
| 0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
| 0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
| 60 cc L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
| polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
| (10x) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
| Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 10 ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
| anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
| Stereotaxic Surgery Reagents | |||
| Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
| Isoflurane | |||
| Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
| artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
| PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
| normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
| cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
| Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
| MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
| 6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 | |
References
- Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
- Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).
- Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
- Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
- Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2015).
- Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
