Summary
De CRISPR / Cas9 systeem biedt de mogelijkheid om gerichte genoom bewerken toegankelijk en betaalbaar voor de wetenschappelijke gemeenschap. Dit protocol is bedoeld om te demonstreren hoe virussen die een gen van belang met behulp van de CRISPR / Cas9 systeem zal knock-out, en dan injecteren ze stereotaxically in de volwassen hersenen van muizen te creëren.
Introduction
Aan de hand van normale fysiologie en pathologie te bestuderen, is er behoefte om genexpressie nauwkeurig manipuleren modelorganismen. Voor zoogdieren model organismen, dit is grotendeels gericht op de oprichting en ontwikkeling van transgene muizen waarbij een genetisch element van interesse wordt geflankeerd door websites herkend door een recombinase. Dit kan leiden tot een plaatsspecifieke manipulatie van deze genen geflankeerd. Hoewel dit misschien een succesvolle strategie is geweest, is het tijd en arbeidsintensief; bijvoorbeeld, het creëren van een triple transgeen dier dat een floxed gen, Cre recombinase en een Cre-reporter-gen zou uitdrukken vereist meerdere paringen en validatie. In tegenstelling, de stereotaxische injectie van replicatie defectieve virale deeltjes codeert voor een fluorescerend eiwit en de recombinase in een floxed gen dier geen complexe of genotypering veredelingsstrategieën 1 vereist. Indien verder een fluorescerend eiwit en Cre tot expressie virus co-geïnjecteerd met een tweede virus encoding een ander fluorescerend eiwit, dan levert dit een binnen-weefselcontrole voor de doelgerichte genetische manipulatie. Hoewel deze strategie nog het gebruik van knock-in dieren vereist, viraal gemedieerde RNA gebaseerde strategieën omzeilen de noodzaak van transgene dieren. Zo kan stereotaxische injectie van replicatie-deficiënte virussen die een fluorescerend eiwit en een korte haarspeld RNA (shRNA) coderen cel endogeen RNAi machines te gebruiken om tot een krachtige verlaging van de transcriptie van een gen van belang. Echter, shRNA strategieën produceren subtiele gen knock-downs wat vaak resulteert in een bescheiden cellulaire fenotypes 2. Terwijl een knock-down meer fysiologisch relevant is voor heterozygote gen dysfunctie kan zijn, zijn verlaagd robuustheid in vergelijking met een knock-out is niet ideaal voor fenotypische ontdekking van nieuwe genen.
Een derde techniek die recentelijk is ontstaan, het CRISPR (geclusterde regelmatig interspaced Short palindroom Repeat) / Cas9 (CRISPR-geassocieerdeeiwit 9) systeem, gebaseerd op de expressie van zowel kleine exogene RNA en DNA snij-enzym. De CRISPR / Cas9 systeem werd aangepast van het prokaryote immuunsysteem dat een werkwijze voor het identificeren vreemd, invasie DNA van virussen en spitsen voor afbraak via de Cas9 enzym 3,4 geëvolueerd. Deze krachtige genoom montagetechniek kan worden gebruikt voor het maken gerichte deleties, inserties en mutaties; en het volgende protocol aangeven hoe deleties maken een gen van belang om de expressie in vivo knockout. De Cas9 enzym wordt uitgedrukt met een RNA gids homoloog aan het gebied van belang en grenst aan een steiger RNA. Knockout van een gen met behulp van deze techniek vereist Cas9 gericht op een specifiek gebied in het genoom middels synthetische guide RNAs (sgRNA), en het induceren van dubbelstrengs breuken (DSB's) op de plaats van belang. Deze DSB's worden vervolgens hersteld door de endogene cel-reparatie machines via niet-homologe end-toetreding (NHEJ), die leadvertentie naar indels dat missense of nonsense mutaties kunnen produceren en dus een verlies van functioneel eiwit expressie 5 te creëren. Omdat dit systeem genomische veranderingen sorteert, is alleen de tijdelijke expressie van de Cas9 en sgRNA. Echter, is het wenselijk dat een stabiele fluorescentie-indicator cellen en hun nageslacht gemanipuleerd op deze wijze identificeren.
Lenti- en retrovirussen hebben het voordeel stabiel te integreren DNA van belang in gastheercellen cellen die lange termijn expressie te behouden en worden doorgegeven aan dochtercellen tijdens mitose. Dit protocol beschrijft het ontwerp en de productie van twee soorten replicatiedeficiënt, hoge titer retrovirussen: het menselijke immunodeficiency virus afgeleide lentivirale deeltjes (lentivirussen) en op basis van muizen Maloney Leukemia virus (retrovirus). Hoewel beide virussen kunnen ondersteunen stabiele expressie van grote transgenen, kan de retrovirale deeltjes alleen integreren in het genoom during celdeling met de afbraak van de kernenvelop, en derhalve kan worden gebruikt als instrument labelen en geboorte datum 6 cellen. Terwijl lentivirussen hebben een reputatie voor het zijn relatief lage titer 7, deze methode, inclusief het gebruik van cafeïne 8 bij virale inzameling, produceert routinematig titers van 10 9 en 10 10 deeltjes / ml. Een ander voordeel van lenti- en retrovirussen is de tolerantie voor zeer grote inserts. De volgende collectie van protocollen schetst de procedure voor het ontwerpen van een Lenti of retrovirus dat codeert voor een fluorescerende reporter, sgRNAs en Cas9 de CRISPR / Cas9 systeem om DNA evenals wijzigen express een fluorescerend eiwit te gebruiken.
Muis stereotaxische neurochirurgie is een waardevolle werkwijze voor het injecteren van virussen in vivo morfologie, functie en connectiviteit van geïnfecteerde neuronen te bestuderen. Virale infecties in neuronen kan worden gebruikt om expressie niveaus gedurende langere tim manipulerene, zoals tijdens de ontwikkeling en expressie kan nauwkeurig worden geregeld door het gebruik van verschillende drugs induceerbare systemen en specifieke Cre gedreven expressie. Deze bijzondere protocol wordt uitgelegd hoe u een virus dat een sgRNA en Cas9 om een gen van belang knock-out in de hersenen van een volwassen muis te injecteren. Muizen herstellen zeer snel van deze procedure en expressie van het virale transgen kan worden gezien binnen 48 uur na injectie. Lijkt echter fluorofoor expressie stijgen in de loop van weken resulteerde in een bijna maximale niveaus van 3 weken na infectie. Muizen die virale stereotaxische injectie ondergaan kan worden gebruikt voor het gedrag, elektrofysiologie of morfologische studies. Kortom, het doel van deze procedure is om te demonstreren hoe een gen in de volwassen hersenen van muizen gebruikt stereotaxische chirurgie en een virus dat een bepaald sgRNA en Cas9 knockout.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle protocollen zijn goedgekeurd door de Dartmouth Institutional Bioveiligheid en Institutional Animal Care en gebruik Comite review boards.
1. Protocol voor het ontwerpen van een Guide Strand (sgRNA) voor CRISPR / Cas9 Retrovirus
LET OP: Er zijn veel non-profit websites die kunnen worden gebruikt om sgRNAs genereren om een gen van belang te richten (https://benchling.com/ en http://crispr.mit.edu/). Het doel van dit protocol is het ontwerpen en bestellen enkelstrengs oligo uit een commerciële verkoper die versmolten elkaar. Deze versmolten oligo wordt geligeerd in de PXL overdrachtsvector. Zie aanvullende video 1 voor een voorbeeld van het ontwerpen sgRNAs gebruik Benchling.
- Gebruik een website gewijd aan het ontwerpen sgRNAs.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, het invoeren van een coderende / exon sequentie van nabij het begin van het gen van belang in de website een 20 nucleotide sgRNA genereren. Gebruik de 20 nucleotide sgRNA volgorde om de sense en anti-sense oligo ontwerpens die worden veroordeeld tot de sgRNA creëren. - Na het genereren van de sgRNA, kopieer deze sequentie in een tekstverwerker. Voeg een G (guanine) aan het begin van de 20 nucleotide sequentie sgRNA in het document als het niet reeds begint met één (dat wil zeggen G-20 nucleotide sequentie sgRNA). Dit is nodig voor een goede transcriptie van de U6 promoter waarborgen.
- Documenteer het omgekeerde complement van deze nu 20-21 nucleotidesequentie. Voor de sense oligo, voeg "CACC" naar het 5 'uiteinde van de sequentie in het document (dwz CACC-G-20 nucleotide sequentie sgRNA). Deze overhang wordt gebruikt om de sequentie in de vector PXL ligeren.
- Voor de antisense oligo, voeg AAAC aan het 5 'uiteinde. Gebruik deze overhang aan de sequentie ligeren in de PXL vector.
- Het verkrijgen van de sense en antisense oligo's. Na ontvangst van de oligo's, maken 100 uM voorraden met behulp van DNAse gratis water. Meng 10 pl elk van de 100 pM sense en antisense oligo met 4 μl 10x NEB Buffer 2, en 16 pl water.
LET OP: Ze hoeven niet pagina zuivering of 5'phosphorylation (zoals de BbsI overhangen zijn niet-compatibele cohesieve uiteinden).- Breng 200 ml water aan de kook in een 500 ml bekerglas vervolgens drijven de buis met dit mengsel in een schuim "drijver" houder. Laat het water langzaam afkoelen van 95 ° C gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Verdun het nu versmolten oligo-mix 1: 1000 in steriel water en onmiddellijk gebruikt in de volgende ligatie of bewaar het resterende reactiemengsel bij -20 ° C.
- Digest pxl een PX330 vector derivaat met BbsI restrictie-enzym bij 37 ° C gedurende 2 uur. Gebruik een 40 pi reactie die 2 ug pxl, 4 gl 10x NEB buffer 2, 1 pl Bbs1 en waterbalans. Het aldus gedigereerde-Pxl routine gel zuivering met gebruik van een commerciële kit. Zorg ervoor dat de opbrengst is ~ 8,5 kB product.
- Een handelspraktijk ligatiekit, ligeren 1 ui van de 1: 1000-versmolten oligos met 50 ng gedigesteerde en gel-gezuiverde Pxl. Transformeer de ligatieproduct in competente recombinatie deficiënte E. coli (NEB 5-alpha, subkloneren efficiëntie). Screen de transformanten op de aanwezigheid van de juiste gids van plasmide-DNA sequentiebepaling.
- Digest U6, gids streng en RNA scaffold elementen (sgRNA) van pxl gebruik BstB1 en PAC1 restrictie-enzymen en ligeren in het fluorescerende proteïne-T2A-Cas9 virale ruggengraat gedigereerd met dezelfde restrictie-enzymen. Transformeer de ligatieproduct (NEB 5-alpha maximale efficiëntie). De fluorescerende eiwit-T2A-Cas9 virale ruggengraat plasmiden low copy plasmiden en dus low copy-protocollen worden gebruikt.
OPMERKING: Een tweede sgRNA kan eveneens worden ingebracht door PacI-digestie van andere pxl guide streng plasmide en geligeerd in de gedigereerde PAC1 en kalf-intestinale fosfatase behandelde virale ruggengraat reeds met de eerste geleiding streng. Fosfatasebehandeling van de virale transferplasmide helptvermindering van het aantal transformanten van de zelf-ligatie van plasmiden niet de tweede geleider bevattende. - Sequence controleren of de uiteindelijke plasmide en maxi prep met behulp van de Nucleobond Xtra maxi prep kit en verpakken het in een virus met de volgende "Protocol voor Retro / Lentivirale Production - CaPO4 Method".
2. Bereid 293FT / 293GP Cellen voor Transfectie (Retro / Lentivirale Production - CaPO4 Method)
- (Dag 1) snel ontdooien 1 flacon van cellen per 10 cm celkweek plaat in een 37 ° C waterbad. Voor lentivirale verpakking, gebruiken 293FT cellen. Voor retrovirale verpakking, gebruiken 293GP (gag / pol) cellen.
- Pipetteer alle ontdooide cellen uit de cryo buis in een 15 ml conische buis en voeg 2 ml voorverwarmde CO 2 geëquilibreerd-compleet Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium.
- Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 500 x g te pelleteren. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml compleet iscove's gemodificeerd Dulbecco's Medium. Plaat de cellen op een 10 cm celkweek schotel. Incubeer de cellen overnacht bij 37 ° C in een 5% kooldioxide incubator.
- (Dag 2) 24 uur na plateren, wijzigt media op de plaat door opzuigen van de bestaande media en het toevoegen van 10 ml voorverwarmde Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium aan de plaat.
- (Dag 3-4) 24-48 uur na de media verandering en zodra de cellen confluent, splitsing van de cellen om een samenvloeiing van 2,5-3,0 x 10 6 cellen / plaat (10 cm plaat).
- Om de cellen te splitsen, zuigen de media en was de plaat met 5 ml PBS. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine aan de plaat en incubeer bij 37 ° C totdat de cellen tillen van de plaat. Voeg 0,5 ml medium Iscove's gemodificeerd Dulbecco's naar 0,25% trypsine reactiemengsel te neutraliseren en de cellen pipet in een 1,5 ml buis.
- Spin de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in 1 ml van Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium. Verdun 1081, l van de cellen in 90 ui PBS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Re-plate 2,5-3,0 x 10 6 cellen / plaat met compleet Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Medium.
LET OP: cellen zullen worden ~ 50% confluent 24-34 uur na plating. Transfecteren van de cellen als ze ~ 50% confluent.
3. (Dag 5) CaPO4 Transfectie en virusdeeltje Collection
- Verander het medium 2 uur voor transfectie door opzuigen van de bestaande media en het toevoegen van 10 ml voorverwarmde Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium. Zorg ervoor dat er precies 10 ml van media in de 10 cm plaat.
- Bereid de transfectie reagentia voor 2 gerechten met 2, 5 ml ronde bodem polystyreen buizen. Label de eerste tube "DNA" en de tweede buis "2X HBS". Dient de concentratie van DNA tot 1 ug / ul in Tris-EDTA bij pH 7,4.
- Voor lentivirussen, voeg langzaam 20 ui transfervector (The Viral construct plaats), 13 pl CMVdelta8.9, 9 pl VSV-G, 860 gl moleculaire biologie klasse H 2 O en 100 pl 2,5 M CaCl2 de eerste buis ( "DNA"), waarbij voortdurend tikken op de buis te mengen.
- Voor retrovirussen, laat de CMVdelta8.9 plasmide. Voeg 20 ul overdrachtsvector, 15 gl VSV-g, 860 gl Molecular Biology Grade H 2 O en 100 gl 2,5 M CaCl 2 aan de buis met het label "DNA".
- Voeg 1 ml 2x HEPES gebufferde zoutoplossing (pH 7,0, deze pH is absoluut noodzakelijk) aan de buis met het label "2X HBS".
- Voeg langzaam de inhoud 1 ml van de "DNA" tube naar "2X HBS" tube, een druppel per keer. tikt u continu de "2X HBS" tube met de index of middelvinger tijdens het toevoegen van de inhoud van de "DNA" tube. Observeer schijnbare CaPÛ4 blaasjes na elke druppel. Incubeer de buis in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 1 ml van de transfectie in slow druppeltjes elk 10 cm celplaat vervolgens overnacht incuberen bij 37 ° C.
- (Dag 6) Vervang media met 8 ml van Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium + 0,5% FBS en 40 mg cafeïne / 100 ml medium. Indien de overdracht vector bevat een fluorescerende marker, dan fluorofoor uitdrukking geeft aan een succesvolle transfectie.
- (Dag 7) Verzamel de media die de virale deeltjes met behulp van een 10 ml serologische pipet en afzien in een 50 ml conische buis. Sla de 50 ml conische buis bij 4 ° C. Voeg 8 ml 0,5% FBS medium aan elke plaat.
- (Dag 8) Ook laat het medium met de virale deeltjes te combineren met de vorige dag oogst in de 50 ml conische buis.
4. Concentratie en zuivering van het virus
- Wordt 5x polyethyleenglycol 6000 door toevoeging van 40% polyethyleenglycol 6000 en 1,5 M NaCl tot DDH 2 O. Autoclaaf de oplossingde vloeistofkringloop 45 minuten bij 121 ° C. Langzaam Meng de oplossing bij koelen.
NB: De oplossing begint bewolkt en daarna duidelijk worden als het afkoelt. - Centrifugeer de 50 ml conische buis met beide verzamelingen van virale supernatant bij 2000 g gedurende 10 minuten om onoplosbare materiaal te pelletiseren. Zuiver het virale media door te filteren door middel van een 0,45 pm lage eiwitbinding spuit filter (PES of PVDF).
- Voeg 5x polyethyleenglycol 6000 oplossing media (De eindconcentratie moet 8% polyethyleenglycol 6000 en 0,3 M NaCl zijn). Meng door het buisje meerdere malen (niet vortex) omkeren. Incubeer de virale bevattende polyethyleenglycol oplossing bij 4 ° C gedurende 12 uur of meer, soms opnieuw mengen.
- (Dag 9) Centrifugeer de virale bevattende polyethyleenglycol oplossing bij 2500 xg gedurende 45 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof en opnieuw draaien gedurende 2 minuten. Nogmaals, te verwijderen en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de pellet door het toevoegen van 320 glsteriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (320 ul is 1/100 van het oorspronkelijke volume van virale bevattende media verzameld) en incubeer overnacht bij 4 ° C. Eventueel resuspendeer de pellet bij kamertemperatuur op een rocker gedurende 30 min.
- Na resuspenderen van de pellet, de hoeveelheid virus (5-10 ui per 0,5 ml buisje) en vries porties bij -80 ° C (stilstaand ontdooien of opslag bij 4 ° C zal drastisch verminderen van de titer).
- Titreren virussen met behulp van standaard protocollen, bijvoorbeeld, het uitvoeren van een verdunningsreeks op een 6-wells plaat van HEK293T-cellen en handmatig tellen fluorescerende kolonies 48 uur later.
5. Testen De werkzaamheid van het CRISPR Virus
LET OP: Sequence klonen met behulp van de volgende stappen uit om te testen voor de productie van dubbel-breuken gerepareerd door NHEJ met de muis Neuro2A cellen. Dit heeft het voordeel boven expert assays die kan worden gebruikt om het percentage cellen die zijn gewijzigd en mogen de aardvan de INDELs als gevolg van NHEJ.
- Laag zoals Matrigel een 3,5 cm celkweekschaal met een gelatineachtige proteïne verdund 1:50 in Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Zuig het gelatineuze eiwitmengsel en de plaat de Neuro2A cellen.
- Na de Neuro2A cellen oplopen tot 50% samenvloeiing, voeg de CRISPR Lentivirus of retrovirus bij een veelvoud van infectie van 10 (dat wil zeggen, 10 virale deeltjes per cel).
OPMERKING: Neuro2A cellen niet zo vriendelijk om infectie zijn HEK293 cellen dus een infectie leidt niet tot 100% van de cellen worden geïnfecteerd met het lentivirus. Verder is de enige retrovirus infecteert delende cellen en dus ook niet tot 100% infectie. Om een bijna 100% infectiegraad bereiken, kan toevoeging van virus worden herhaald op verschillende dagen, het splitsen van de cellen nodig. Als alternatief kunnen fluorescente positieve cellen geïsoleerd met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel-sortering. the meest effectieve manier om een 100% infectie met lentivirussen bereiken is een infectie gevolgd door FACS isolatie voeren. Voor een retrovirus, uitvoeren 4-serie infecties 24 uur uit elkaar en volg door FACS isolatie te waarborgen 100% infectie. - Na het infecteren van de cellen gedurende 1 week, breiden de cellen tot bijna confluentie op een 10 cm plaat, zuig de media, en was de plaat met 5 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine en incubeer bij 37 ° C totdat de cellen tillen van de plaat. Voeg 0,5 ml medium Iscove's gemodificeerd Dulbecco's naar 0,25% trypsine reactiemengsel te neutraliseren en de cellen pipet in een 1,5 ml buis en pellet de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten.
- Om DNA te isoleren, voeg 100 pl 50 mM kaliumhydroxide, resuspendeer de cellen en incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Neutraliseren van de oplossing met 10 gl 1 M Tris, pH = 8,0.
- PCR versterken het gebied aan weerszijden van de genomische regio waarop het CRISPR sgRNAmet behulp van ~ 300 ng van het DNA geïsoleerd in stap 5.5 met behulp van een high fidelity PCR Master Mix 4.
- Voer het PCR-reactie op een 2,5% agarose gel en gel zuivering de juiste maat fragment met een gel zuiveringssamenstel zoals een gel DNA herstel kit. Ligeren in een kloneringsvector PCR zoals pGem-t-gemakkelijk en transformatie in competente cellen 9.
- 24 uur later, voeg 2 ml LB-bouillon in een 15 ml rondbodem buizen en de juiste antibioticum (ampicilline, neomycine, etc.). Inoculeer de buis met een individuele kolonie met behulp van een steriele pipet tip of loop naar een enkele kolonie van de LB-plaat te selecteren. Verbreden en de kolonie door schudden van de buis bij 250 rpm en 37 ° C gedurende 24 uur. Herhaal dit voor zoveel kolonies als gewenst.
- Met behulp van een mini-prep kit, geïsoleerd DNA van de E. coli en sequentie met primers ontworpen om het gebied van het gen waarop het sgRNA amplificeren om de Cas9 doelgebied van de muis genoom analyseren.
6. Stereotaxische Injection Protocol voor de Adult Mouse
- Bereid je voor Chirurgie
NB: Het is belangrijk om steriele omstandigheden tijdens survival operaties te handhaven. Dit wordt bereikt in dit protocol door warmte steriliseren van de operatie-instrumenten, met behulp betadine de injectieplaats steriliseren en toevoegen van antibiotische zalf op de incisie na het sluiten. Het is ook belangrijk om steriele handschoenen en een goed gesteriliseerd, speciale chirurgie gebruikmaken.- Warmte steriliseren chirurgische instrumenten voor gebruik door ofwel een autoclaaf of met behulp van hete kraal sterilisator. Bereid herstel kamer en een operatie gebied door te draaien bij verhitting pads om de lichaamstemperatuur te handhaven tijdens de operatie en herstel. Monteer de boor gebruikt om gaten in de schedel voor injectie te creëren.
- Load 4 ul van virus in injectienaald door het virus direct terug te trekken uit de steriele PCR-buis. In het kort verwijder de virale hoeveelheid van ijs. Handhaving van het virusin de injectiespuit bij kamertemperatuur gedurende ten hoogste 1 uur voor de injectie.
7. Stereotaxische Injection
- Controleer of de ventilatie om de operatie suite is open voor een goede luchtstroom te verzekeren. Bereid de muis voor de operatie door verlamming met 4% isofluraan in een inductie kamer. Na verdoving, scheren het hoofd naar de plaats van injectie te bereiden.
- Plaats de muis in de stereotaxische instrument met behulp van een pincet om de tong naar beneden te bewegen en aan de zijkant. Steek de beet bar in de mond tot de tanden te laten vallen in de sleuf, zet vervolgens het oor bars. Zorg ervoor dat het lichaam van de muis op de verwarming pad en de neus is gelegen in de neuskegel. Direct 4% isofluraan in de neuskegel. Bevestig verdoving door knijpen de voet met een pincet en ervoor te zorgen dat er geen schrikreflex.
- Pas kunstmatige tranen in de ogen te smeren. Finish voorbereiden van de injectieplaats door zwabberen de geschoren hoofd met afwisselende rondes van povIdone jodium en lidocaïne.
- Met behulp van een scalpel, snijd kleine incisie langs het centrum van de hoofdhuid. Droog de schedel met een wattenstaafje en waterstofperoxide indien nodig te helpen visualiseren bregma.
- Met behulp van een dissectie scope, zoek bregma op de schedel en plaats de boor tip over bregma. Nul (of record) de digitale stereotactische coördinaten op de x, y en z vliegtuigen.
- Om te waarborgen dat het hoofd niveau op rostraal y-as caudaal, plaatst de boor op lambda niveau en de kop zodat de z-coördinaat ongeveer gelijk zowel bregma en lambda.
- Om te waarborgen dat het hoofd waterpas op de x-as, plaatst de boorbeitel y = 1/2 lambda. Controleer of de z-coördinaat is gelijk aan 1 mm aan elke zijde (x = +/- 1 mm) van de pijlnaad. Stel de schedel als er een verschil in de z-coördinaat 1 mm links en rechts van lambda.
- Plaats de boor over de gewenste coördinaten. Voor de dentate gyrus, gebruik dan de coördinaatsy = -1,9 van bregma en x = +/- 1.1. Vóór het boren, hoe lager de isofluraan tot 2%, dan langzaam en voorzichtig, boor door de schedel.
- Na het boren van alle gaten, brengt de gevulde spuit op de stereotaxische instrument. Visueel centreren de spuit over het gat en nul de z-coördinaat op de schedel.
- Langzaam lager de spuit diepste z-diepte. Voor de dentate gyrus, de z diepten -2,5, -2,4 en -2,3. Begin injectie met een snelheid van 0,25 pl / min met behulp van een stereotaxische injectie.
- Na de injectie is voltooid op laagste Z-diepte, wacht 1 min, dan verhogen tot de volgende coördineren en te beginnen met de injectie weer. Ga door met dit patroon tot alle z-injectie coördinaten worden geïnjecteerd. Wacht 2 minuten voor het verwijderen van de spuit na de laatste injectie.
LET OP: Geen ongunstige effecten zijn opgemerkt op het weefsel door het injecteren van maximaal 2 pl virus per halfrond in de hersenen van muizen.
- Na de injectie is voltooid op laagste Z-diepte, wacht 1 min, dan verhogen tot de volgende coördineren en te beginnen met de injectie weer. Ga door met dit patroon tot alle z-injectie coördinaten worden geïnjecteerd. Wacht 2 minuten voor het verwijderen van de spuit na de laatste injectie.
- Herhaal injectie voor andere boorgaten.
- Na injectie, verwijder de muis van de stereotaxische instrument en het hechten van de hoofdhuid met 6-0 zijde hechtingen. Toepassen Lidocaine en antibacterieel room aan de wond.
- Injecteer 0.8-1.0 ml zoutoplossing + Ketoprofen (3-5 mg / kg) via IP-route om de pijn te beheren. Plaats dan de muis in verwarmde herstel kamer. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft het dier niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
- In de dagen na de operatie, wegen de muis dagelijks en zorgen voor zacht voedsel en lekkernijen. Controleer wond en noteer de algemene conditie / gedrag.
- Na stereotaxische injectie, kan de muizen worden gedood voor plak prep elektrofysiologie 1 of perfusie en hun hersenen verwijderd, gesneden en gekleurd via immunohistochemie voor analyse 10.
Representative Results
Naar aanleiding van het "Protocol voor het ontwerpen van een Guide Strand (sgRNA) voor CRISPR / Cas9 Retrovirus", oligo's gericht op een bepaalde volgorde worden in de PXL kloneringsvector stroomafwaarts van de HU6 promoter geplaatst en stroomafwaarts van een gids RNA steiger met behulp van de BbsI kloneringsplaatsen (Figuur 1, stap 1). Dit sgRNA wordt vervolgens uitgesneden uit PXL en in de pRubi backbone met de BstBI Pacl en plaatsen (Figuur 1, stap 2) ingebracht. Tenslotte nog sgRNA gekloneerd in PXL kan stroomafwaarts van de eerste geleider in pRubi-Guide 1 (Figuur 1, stap 3) worden geplaatst, gericht op een ander gebied van het gen en de kansen op een knockout via NHEJ. Controle van de juiste constructies moet worden bepaald door sequentie-analyse. Zodra dit construct wordt gemaakt, kan worden verpakt in een virus volgens de "Protocol Retro / Lentivirale Productie- CaPO4 Method". Succesvolle verpakking wordt bevestigd door infectie van virus in HEK293 cellen om het v titrerenirus. Als er geen fluorofoor expressie dan was er waarschijnlijk een fout tijdens het verpakken van het virus.
Figuur 2 is een representatief resultaat van 2 retrovirussen, een GFP en andere expressie mCherry, co-geïnjecteerd in de dentate gyrus van neonatale muis (7 dagen oud) en afgebeeld 21 dagen na injectie. Labeling van neuronen met mCherry of GFP mogelijk maakt morfologische beoordeling van verschillende genetische manipulaties in hetzelfde weefsel, wanneer een virus een CRISPR kan uitdrukken / Cas9 gemedieerde KO en de andere een controle virus, expressie alleen een fluorofoor. Stereotaxische injectie maakt nauwkeurige anatomische selectiviteit zoals blijkt uit de discrete infectie van de beoogde coördinaten, de dentate gyrus. Bij het analyseren hersensecties geïnfecteerd, is het belangrijk om omringende weefsel totdat is vastgesteld dat de juiste anatomische gebied werd geïnfecteerd. Als er geen teken van infectie, dan is het mogelijk dat de injectie plaatsvond in een naburig gebied eend kunnen worden geïdentificeerd omringende gedeelten. Het kan ook nuttig zijn om de naald spoor naar de exacte injectie regio vinden vinden zijn. VSVG pseudo virussen zelden verspreid van de marges van de dentate gyrus bij injectie in vivo, en vaak verspreid langs de rostrale / caudale as infecteren cellen langs de gehele dentate gyrus, zoals geanalyseerd met 3D reconstructie (figuur 3).
Figuur 1:. Kloneringstrategie voor retrovirale pRubi-Guide 1-Guide2-CRISPR plasmide Deze strategie is identiek voor de FU-gebaseerde lentivirale plasmiden. sgRNA oligo worden gehybridiseerd en geïnsereerd in PXL met de BsbI kloneringsplaatsen. Na sequencing dat de sgRNA succesvol in PXL wordt ingebracht, het plasmide verteren met BstBI en Pacl. Het insert dat wordt afgehaakt (black box) wordt dan gekloond in de virale terug been (zwarte stippellijnen) pRubi-Guide 1 CRISPR. Een tweede sgRNA kunnen ook in PXL worden gestoken en verteerd met behulp van de Pacl enzym. Dit wordt vervolgens gekloneerd in de pRubi-Guide 1 CRISPR vector (rode gestippelde lijnen) met de Pad plaats. Het resulterende plasmide bevat dan zowel gids strengen, alsmede de noodzakelijke virale elementen, promotors, en fluoroforen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Retrovirale injectie van de muis dentate gyrus Retrovirussen expressie mCherry (rood) of GFP (groen) werd geïnjecteerd in de dentate gyrus van een p7 muis. 21 dagen later werden de muizen geperfuseerd en de hersenen doorgesneden en gekleurd voor GFP en mCherry. (A) Een beeld 5x wide-field fluorescerende toont de prbeschikking betalen van de dentate gyrus injectie en de specificiteit van etikettering dentate gyrus korrel neuronen. De morfologie van de hippocampus is te zien via de Dapi (blauw) vlekken. Schaal bar meet 200 pm. (B) een 10x wide-veld image fluorescerende aantoont dat deze hoge titer lentivirussen infecteren een groot aantal cellen waarvan de morfologie kan worden geraadpleegd via fluorofoor expressie. Schaal bar meet 100 micrometer. (C) Virussen die GFP of mCherry werden co-geïnjecteerd in de dentate gyrus. Met behulp van een systeem van retrovirussen, kan men een virus te gebruiken om een genetische manipulatie gekenmerkt door GFP en andere manipulatie gekenmerkt door mCherry te maken, en dan beoordelen één of additief veranderingen als gevolg van elk virus. Schaal bar van 10 micrometer.
Figuur 3:. Anatomische verspreiding van lentivirale injectie Stereotaxische co-injectie van een GFP-shPten virus en een mCherry controlevirus in de hersenen van een volwassene Pten loxP / + muis resulteerde in een virale verspreiding over de gehele rostrale / caudale as van de dentate gyrus van de hippocampus. Dit blijkt uit een 3D reconstructie van de omvang van de injectie waarin gesloten contouren van de virale verspreiding opgespoord via 21 seriële secties (Z = 50 um / sectie) via reconstructieprogramma. De contour traces werden vervolgens afgestemd op de 3D-beelden voor volume kwantificering te genereren. Totaal virale verspreiding wordt getoond in groen (volume = 54.730.800 um 3) en dentate gelokaliseerde spread wordt getoond in het paars (volume = 27.275.200 um 3). Het virus verspreidt zich langs de naald spoor en het corpus callosum bij de kruising van het naaldspoor naast vullen van de rostrale / caudale as van de dentate gyrus. Schaal bar meet 200 pm.
les / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
Aanvullende Video 1. Ontwerp van sgRNAs te klonen in retrovirale en lentivirale backbone.
In deze handleiding synthetische RNA (sgRNA) ontwerp wordt bijvoorbeeld de genoomsequentie van de muis CHD8 gedownload van NCBI. Het startcodon en de exon structuur worden vervolgens gevisualiseerd in Vector NTI. Dit laat ons toe om het genomische gebied rond de eerste codering exon kopiëren en deze sequentie in Benchling. Benchling stelt ons in staat om alle potentiële sgRNAs visualiseren in de regio. Verder, na vermelding van de genomische regio hebben we input, Benchling zal ons de on-target en off-target scores voor elke gids RNA. De gebruiker kan vervolgens de gids RNA met de hoogste on- en off-target scores. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Discussion
Er zijn een paar kritische stappen die belangrijk zijn voor succesvolle virale verpakking. celgezondheid is kritisch voor en tijdens de transfectie, ongezond cellen sterk de hoeveelheid virus geproduceerd te verminderen. Indien de transfectie en verpakking succesvol zijn, dan 100% van de cellen moet de fluorofoor expressie en moeten de cellen een functioneel syncytium vormen. In stap 3.2.4, tikken de buis noodzakelijk hoge titer transfectie efficiënte, en de pH van de HEPES-gebufferde zoutoplossing moet exact. De maxi-preps dat de plasmiden die nodig zijn voor virale verpakking te produceren moet zeer zuiver zijn. Om dit punt, is het nuttig om ethanol neerslaan van de laatste DNA-elutie en opnieuw te schorten in Tris-EDTA buffer. Het is ook belangrijk om de hoeveelheid serum tot 2% of minder in de media dat de cafeïne wordt toegevoegd op dag 6 (stap 3,4) voor virale verzamelen verminderen. Indien het serum niet afneemt, dan zal de uiteindelijke gezuiverde virus een ongewenste hoeveelheid serum bevatten protein. Het gebruik van polyethyleenglycol 6000 als het neerslaan virusdeeltjes sluit de noodzaak van ultracentrifugatie. Het is ook belangrijk op te merken dat de Cas9 CRISPR bevattende virussen gewoonlijk een titer ongeveer 10 maal minder dan virussen alleen met een fluorofoor.
Voor de stereotaxische chirurgie, het gebruik van geïnhaleerde anesthesie maakt een snelle en nauwkeurige regeling of het bewustzijn van het dier in vergelijking met injecteerbare anesthetica en anesthesie maakt over een groter leeftijdsgroep. Het is zeer belangrijk om de chirurgische instrumenten schoon en steriel te houden en reproduceerbare targeting vereist een nauwkeurige positionering van het hoofd. Zorg ervoor dat er geen pitching of rollen van het hoofd in de stereotaxische instrument en dat de schedel voelt stevig op zijn plaats. Het kan nuttig zijn om de schedel drogen om de hechtingen te vinden voor de stereotaxische coördinaten bepalen. Ook moet de snelheid en volume voor elke stereotaxische coördineren empirisch worden bepaald.
Deze techniek wordt beperkt doordat de verspreiding van een lenti- of retrovirus beperkt, zeker in vergelijking met adeno geassocieerde virussen (AAV) .Daarom deze virussen zijn waardevol als geïnfecteerd een discrete hersengebied, maar niet voor de algehele infectie geassocieerd met AAV voor gedragsanalyse bij dieren. Het gebruik van cafeïne in dit protocol verhoogt de titer van deze virussen, maar ze zijn nog niet zo hoog als de resultaten die in AAV verpakking titers. Ook stabiele integratie slechts een voordeel van fluorofoor expressie, zoals CRISPR / Cas9 vormt stabiel genomisch bewerkingen zelfs wanneer tijdelijk getransfecteerd en het is mogelijk dat voortdurende expressie van het Cas9 en sgRNA kunnen produceren uiteindelijk doel af effecten. De tijdelijke expressie het CRISPR / Cas9-systeem met AAV's is voldoende om genomische veranderingen die de hele celdelingen worden gepropageerd produceren echter fluorofoor expressie zal niet worden gehandhaafd.
Oprichting van lenTi- en retrovirussen gebruikmaking van de CRISPR / Cas9 systeem de mogelijkheid om een nieuw gen te richten in een Veel organismen geven. De efficiëntie van gen-editing wordt afhankelijk van de sequentie van de RNA gids richt de Cas9 splitsing zijn. Empirisch is vastgesteld dat tussen 10% en 80% van de klonen bevatten indels na sequencing Neuro2A geïnfecteerde cellen. Het is op dit moment niet bekend of indel frequenties berekend Neuro2A cellen zijn een afspiegeling is van die in neuronen. Guide RNA ontwerpsoftware voorzien Benchling nu ook een "on target" score die in staat zijn om de doeltreffendheid van een bepaalde doelsequentie voorspellen. In hoeverre dergelijke "on-target" scores zijn betrouwbaar behoeften empirisch worden bepaald in neuronen en andere mobiele-types als de CRISPR-Cas9 systeem wordt op grotere schaal toegepast.
Lentivirus-gebaseerde transgene dierlijke productie is variabel succesvol met berichten dat de lentivirus-geleverde transgenen worden silenced 11. CRISPR gemedieerde gen het bewerken van DNA kan worden doorgegeven via de kiembaan om hele diermodellen te genereren. Zo kan stabiel genomic editing haalbaar, ondanks de silencing van virale-geleverde fluoroforen en Cas9 transgenen zijn. Dit kan een efficiënt platform voor doelgerichte genomische veranderingen. De virale levering van de CRISPR / Cas9 systeem, terwijl het niet nodig transgene organismen, is complementair aan die technieken. Bijvoorbeeld injecteren zoals virale deeltjes in een verbinding transgeen dier dat induceerbaar tot expressie Cre en Cre afhankelijke opto- of chemo-genetische transgenen dienen complex studies naar de relatie tussen genetische manipulaties en neuronale activiteit te maken. Een tweede voorbeeld is deze Cas9 / sgRNA virusdeeltjes leveren een voorwaardelijke knockout in een poging om te screenen op gen-gen interacties. Tot slot, een spannende route van dit onderzoek is het screenen van fenotypes en therapeutische verbindingen in de patiënt afgeleide cellen, dat kanworden gebruikt om te valideren en te ontdekken genetische netwerken die verstoord bij verschillende ziekten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NINH verlenen R01MH097949 en de Autism Speaks Pilot Grant 7359 om BWL en de Norris Cotton Cancer Center optische beeldvorming Shared Instrumentation Grant P30CA023108.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Cell Culture Reagents | |||
| 293FT cell line | Life Technologies | R700-07 | For Lentivirus |
| 293GP cell line | Clontech | 631458 | For Retrovirus |
| Iscove's Modification of DMEM (IMDM) | Corning | 10-016-CV | Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and 1% P/S |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| MEM Nonessential Amino Acids (NEAA) | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine solution, 100x (L-Gln) | Corning | 25-005-CI | |
| Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S) | Corning | 30-002-CI | |
| Polystyrene 10 cm plate | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| Trypsin EDTA 1x | Corning | 25-053-CI | |
| List of Transfection Reagents | |||
| 5 ml polystyrene tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Scientific | C69-500 | Make a 2.5 M solution in ddH2O |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP2939-100 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS) | 500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!) | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-5G | |
| 0.22 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLGV033RS | |
| 0.45 µM syringe filter unit | EMD Millipore | SLHP033RS | |
| 60 cc L/L Syringe | Med-Vet International | MV60CCLL | |
| 50 ml Conical Tube | Corning | 352098 | |
| polyethylene glycol 6000 (PEG 6000) | Millipore | 528877 | |
| (10x) Phosphate Buffered Saline (PBS) | National Diagnostics | CL-253 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1605-0000 | |
| Matrigel | Fisher Scientific | CB-40230A | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC41678-5000 | |
| Donor Horse Serum | Cellgro | 35-030-CV | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| 10 ml serological pipette | Fisher Scientific | 357551 | |
| anti-GFP, rabbit, 488 conjugate | Invitrogen | A21311 | |
| Stereotaxic Surgery Reagents | |||
| Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx | Med-Vet International | 1CCVLS | |
| Isoflurane | |||
| Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk | Med-Vet International | JOR580S | |
| artificial tear ointment | Med-Vet International | RXPARALUBE-O | |
| PVP PrepSolution | Med-Vet International | HPIV108208H | |
| normal saline | Med-Vet International | DYND500MLSH | |
| cotton tipped applicators | Med-Vet International | CTA6 | |
| Triple antibiotic ointment | Med-Vet International | RXTRIP-OI15 | |
| MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8" | Med-Vet International | 25058 | |
| 6-0 silk sutures | Med-Vet International | MV-711 | |
References
- Williams, M. R., DeSpenza, T. Jr, Li, M., Gulledge, A. T., Luikart, B. W. Hyperactivity of newborn Pten knock-out neurons results from increased excitatory synaptic drive. J Neurosci. 35 (3), 943-959 (2015).
- Luikart, B. W., et al. Pten knockdown in vivo increases excitatory drive onto dentate granule cells. J Neurosci. 31 (11), 4345-4354 (2011).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
- Luikart, B. W., et al. miR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus. PLoS One. 6 (5), e19077 (2011).
- Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
- Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
- Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method (2015).
- Fricano, C. J., et al. Fatty acids increase neuronal hypertrophy of Pten knockdown neurons. Front Mol Neurosci. 7, 30 (2014).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis? Physiol Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
